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        苯并[a]芘在厚殼貽貝體內(nèi)的富集及代謝特征

        2021-12-22 10:48:10曾夢妮王翠華馬麗艷黃冬梅
        海洋漁業(yè) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:差異實驗

        李 磊,曾夢妮,王翠華,馬麗艷,張 璇,黃冬梅,蔣 玫

        (1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090;2.寶船生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司,上海 201203)

        苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,BaP)是多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)中高致癌物質(zhì)的典型代表。多環(huán)芳烴可通過降雨、地下河流等方式最終流入海洋[1]。我國多處海域受到PAHs污染,對青島沿岸、象山港、海南洋浦灣等區(qū)域的海水檢測顯示,水體中BaP濃度為0.12~2.35 ng·L-1[3-4]。水環(huán)境中的BaP主要以溶解態(tài)、吸附于懸浮物中、與沉積物結(jié)合等形式存在,因其具有較高親脂性、疏水性和低生物降解性,可通過攝食作用、鰓呼吸作用以及表皮接觸滲透等方式進(jìn)入水生生物體并累積[5]。BaP進(jìn)入生物體后,機體會產(chǎn)生解毒反應(yīng),BaP經(jīng)組織細(xì)胞中的混合功能氧化酶激活轉(zhuǎn)化為3-羥基苯并[a]芘(3-hydroxybenzo(a)pyrene,3-OH BaP)等羥基化合物、醌類或環(huán)氧化物[6]。

        海洋中雙殼貝類因濾食性攝食方式,易在體內(nèi)富集多環(huán)芳烴等環(huán)境污染物,常作為監(jiān)測海洋環(huán)境污染的良好指示生物[7-8]。有學(xué)者先后研究了水體中多環(huán)芳烴在貝類體內(nèi)的吸收速率常數(shù)和釋放速率常數(shù)[9]、累積和凈化動力學(xué)參數(shù)[10]等富集動力特征,針對消化盲囊、鰓、閉殼肌等不同組織在貝類體內(nèi)的蓄積規(guī)律進(jìn)行了分析[11-12]。厚殼貽貝(Mytilus coruscus)作為雙殼貝類,在中國各海域均有分布。因此,研究厚殼貽貝對PAHs的蓄積規(guī)律對評價我國沿海水體的PAHs污染狀況具有重要意義。

        本研究通過對厚殼貽貝在不同濃度BaP溶液中的富集和釋放實驗,獲得內(nèi)臟團(tuán)、外套膜和閉殼肌對BaP的富集及釋放規(guī)律,分析BaP代謝產(chǎn)物3-OH BaP在3個組織中的時間與劑量效應(yīng)關(guān)系,初步闡明了BaP在厚殼貽貝各組織的代謝規(guī)律,以期為BaP在貝類體內(nèi)的轉(zhuǎn)化機制研究提供參考數(shù)據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        實驗用海水為海水晶配制的人工海水,鹽度為26,水溫控制在(23±2)℃。厚殼貽貝取自浙江省枸杞島養(yǎng)殖海域,平均殼長為(119.6±7.7)cm,殼寬為(55.0±3.0)cm,體質(zhì)量為(130.6±17.3)g。實驗前將厚殼貽貝暫養(yǎng)7 d,期間連續(xù)曝氣,并投喂螺旋藻粉。選取健康個體進(jìn)行實驗,實驗容器為20 L的玻璃缸體,實驗用水為14 L。BaP標(biāo)準(zhǔn)品和3-OH BaP標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司。丙酮、甲醇和乙腈均為美國默克公司生產(chǎn)的色譜純。

        1.2 BaP的富集和釋放

        1.2.1 富集和釋放實驗

        為了驗證0.01%(丙酮體積占實驗水體總體積比率)丙酮作為BaP助溶劑的可行性,在實驗開始前對添加BaP試驗組和添加了0.01%丙酮處理的BaP試驗組中貽貝組織的BaP含量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。結(jié)果表明,二者無顯著性差異(P>0.05),說明0.01%丙酮作為BaP的助溶劑是可行的。

        實驗分為富集和釋放兩個階段,分別進(jìn)行10 d和5 d。在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上設(shè)置0.2、1.0、3.0 μg·L-13個濃度組,以人工海水(其中加入的丙酮體積占實驗水體總體積的0.01%)作為對照組,每個試驗組設(shè)置3個平行,每個實驗容器各放入16只厚殼貽貝。實驗期間每天換水1次,換水率100%,每天定時投喂螺旋藻粉。分別于實驗的1、3、6、10、12、15 d從每個實驗容器中各隨機抽取2只貝類,分離其內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌3種組織于-80℃保存,待測分析每種組織內(nèi)的BaP和3-OH BaP的殘留量。

        1.2.2 組織樣品前處理

        每種厚殼貽貝組織樣品分別稱取1 g于10 mL的勻漿器中,加入2 mL超純水制成組織勻漿液。取上述勻漿液100μL,加入200μL乙腈,渦旋混合10 min,10000 r·min-1離心10 min,取上清液供高效液相色譜分析。同時開展BaP和3-OH BaP的加標(biāo)回收實驗,以滿足檢測質(zhì)控要求,回收率為90%~110%。

        1.2.3 色譜條件

        色譜柱:CenturySIL C18-BDS(150 mm×4.6 mm,5μm);BaP流動相:甲醇-水(90∶10),激發(fā)波長265 nm,發(fā)射波長450 nm;3-OH BaP流動相∶甲醇-水(87∶13),激發(fā)波長365 nm,發(fā)射波長450 nm;流速1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量15μL;柱溫25℃。

        1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        用乙腈分別稀釋BaP和3-OH BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、10.0 ng·mL-1的BaP標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,濃度為1.0、4.0、8.0、10.0、25.0、50.0 ng·mL-1的3-OH BaP標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,色譜條件測定同1.2.3。BaP在0.1~10.0 ng·mL-1范圍內(nèi),線性回歸方程為y=116.56x+10.156,相關(guān)系數(shù)R=0.9996;3-OH BaP在1~50 ng·mL-1范圍內(nèi),線性回歸方程為y=3.0172x+3.2594,相關(guān)系數(shù)R=0.9967。以信噪比S/N=3求得BaP和3-OH BaP檢出限分別為0.1μg·kg-1和0.3μg·kg-1。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        所有數(shù)據(jù)采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,顯著性差異檢驗采用單因素方差分析(ANOVA)和雙變量相關(guān)性檢測法,相關(guān)性分析采用Dunnet多重比較和皮爾遜(Pearson)方法。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 3種組織對BaP的富集與釋放規(guī)律

        各試驗組的厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)對BaP的富集和釋放情況如圖1所示。在富集階段,內(nèi)臟團(tuán)中BaP富集含量均隨時間的增加而增加,1.0和3.0 μg·L-1濃度組間無顯著性差異(P>0.05),但顯著高于0.2μg·L-1濃度組和對照組(P<0.05)。在清水釋放階段(11~15 d),3個濃度組內(nèi)臟團(tuán)BaP含量隨時間的延長逐漸下降。釋放前期階段(12 d),3個濃度組間無顯著性差異(P>0.05);釋放后期階段(15 d),高濃度組(3μg·L-1)內(nèi)臟團(tuán)中BaP含量變化顯著高于1.0μg·L-1和0.2μg·L-1低濃度組(P<0.05)。

        各試驗組的厚殼貽貝外套膜對BaP的富集和釋放情況如圖2所示。外套膜中BaP富集含量在富集階段均隨時間的增加而增加;3個濃度組間有顯著性差異(P<0.05),且與對照組差異顯著(P<0.05)。在清水釋放階段(11~15 d),3個濃度組外套膜BaP含量隨時間的延長逐漸下降。釋放前期階段(12 d),3個濃度組外套膜BaP含量有顯著性差異(P<0.05);釋放后期階段(15 d),2個高濃度組(1.0μg·L-1和3.0 μg·L-1)與低濃度組(0.2μg·L-1)差異顯著(P<0.05)。

        圖2 厚殼貽貝外套膜對BaP的富集和釋放情況Fig.2 Enrichment and release of BaP in outer membrane of M.coruscus

        各試驗組的厚殼貽貝閉殼肌對BaP的富集和釋放情況如圖3所示。在富集階段,閉殼肌中BaP富集含量均隨時間的增加而增加;1.0 μg·L-1和3.0μg·L-1濃度組間差異不顯著(P>0.05),但顯著高于0.2μg·L-1濃度組和對照組(P<0.05)。在清水釋放階段(11~15 d),閉殼肌組織BaP含量隨時間的延長逐漸下降。釋放前期階段(12 d),2個高濃度組閉殼肌中BaP含量顯著高于0.2μg·L-1濃度組;釋放后期階段(15 d),3個濃度組間無顯著差異(P>0.05)。

        從圖1~圖3可知,厚殼貽貝各組織對BaP的富集含量高低表現(xiàn)為內(nèi)臟團(tuán)>外套膜>閉殼肌。

        圖1 厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)對BaP的富集和釋放情況Fig.1 Enrichment and release of BaP in visceral mass of M.coruscus

        圖3 厚殼貽貝閉殼肌對BaP的富集和釋放情況Fig.3 Enrichment and release of BaP in closed shell muscle of M.coruscus

        厚殼貽貝3種組織對BaP的吸收速率與釋放速率如表1所示。從表1可知,富集階段(1~10 d)和清水釋放階段(11~15 d),厚殼貽貝3種組織對BaP的吸收速度和釋放速率基本都隨BaP暴露濃度增加而增加。從表1可見,各組織對BaP的吸收速率和釋放速率大小表現(xiàn)為內(nèi)臟團(tuán)>外套膜>閉殼肌。

        表1 厚殼貽貝3個組織對BaP的吸收速率和釋放速率Tab.1 Enrichment and release rates of BaP in three tissues of M.coruscus

        2.2 3種組織中代謝物3-OH BaP含量與BaP的時間效應(yīng)關(guān)系

        在BaP暴露下,厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中3-OH BaP含量隨暴露時間的變化如圖4~圖6所示。

        圖4 厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)中3-OH BaP與BaP的時間效應(yīng)關(guān)系Fig.4 Time effect relationship between 3-OH BaP and BaP in visceral mass of M.coruscus

        圖6 厚殼貽貝閉殼肌中3-OH BaP與BaP的時間效應(yīng)關(guān)系Fig.6 Time effect relationship between 3-OH BaP and BaP in closed shell muscle of M.coruscus

        在富集階段,富集前期(1~6 d),厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)中3-OH BaP含量各濃度組間差異不顯著,富集后期(10 d)高濃度組3.0μg·L-1內(nèi)臟團(tuán)中3-OH BaP含量顯著高于0.2μg·L-1和1.0 μg·L-1濃度組(P<0.05),除第1天外,厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)中3-OH BaP含量各濃度組與對照組均有顯著差異(P<0.05)。厚殼貽貝外套膜中3-OH BaP含量在整個富集階段,均表現(xiàn)為3.0μg·L-1濃度組顯著高于0.2μg·L-1和1.0μg·L-1濃度組(P<0.05),且與對照組有顯著差異(P<0.05)。第1天,厚殼貽貝閉殼肌中3-OH BaP含量濃度組間差異不顯著(P<0.05),第3、6、10天,各濃度組差異顯著(P<0.05)。

        在清水釋放階段,厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中3-OH BaP含量均隨釋放時間的增加而減少,各組織中3-OH BaP含量仍隨BaP暴露濃度增加而增加。厚殼貽貝各組織中代謝物3-OH BaP含量的釋放率變化規(guī)律表現(xiàn)為內(nèi)臟團(tuán)(44.7%~52.0%)>外套膜(41.5%~43.5%)>閉殼?。?9.4%~28.1%)。

        圖5 厚殼貽貝外套膜中3-OH BaP與BaP的時間效應(yīng)關(guān)系Fig.5 Time effect relationship between 3-OH BaP and BaP in the outer membrane of M.coruscus

        2.3 3種組織3-OH BaP含量與BaP累積量的劑量效應(yīng)關(guān)系

        在不同BaP暴露濃度下,厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中BaP累積量與3-OH BaP含量變化的相關(guān)關(guān)系如表2所示。厚殼貽貝在暴露階段末期(10 d),內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中代謝物3-OH BaP含量隨著BaP實際累計量的增加而增加。各濃度組內(nèi)臟團(tuán)中BaP實際累積量與3-OH BaP含量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.920~0.944;外套膜中3-OH BaP含量與BaP累積量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.833~0.936;閉殼肌中3-OH BaP含量與BaP累積量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.899~0.941,均表現(xiàn)為顯著的正相關(guān)。

        表2 富集階段末期3個組織中3-OH BaP與BaP含量變化的相關(guān)關(guān)系Tab.2 Correlation between 3-OH BaP and BaP content in three tissues of M.coruscus exposed to BaP at the end of enrichment period

        3 討論

        3.1 BaP脅迫下的3種組織BaP累積量的時間效應(yīng)關(guān)系

        本研究結(jié)果表明,在富集階段,厚殼貽貝暴露在不同濃度BaP溶液中,其內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中BaP富集含量均表現(xiàn)為劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)的正相關(guān)關(guān)系。因為BaP自身具有較高的辛醇-水分配系數(shù)(Kow)和較高的疏水性,丙酮助溶后可提高其生物利用性,增加了厚殼貽貝對BaP的富集作用[9],在水溶液環(huán)境中易被生物體吸收。SKARPHéeINSDóTTIR等[13]研究了BaP對藍(lán)貽貝DNA加合物形成的影響,發(fā)現(xiàn)貽貝體內(nèi)BaP濃度隨著暴露時間的延長而增加,本研究結(jié)果與其一致。水生生物可以產(chǎn)生有效的解毒機制來消除污染物,但這種機制是需要時間來逐步釋放的,且并不能完全消除污染物[14]。在清水釋放階段結(jié)束時,從圖1~圖3可明顯看出,各組織中BaP仍有殘留。

        3.2 BaP脅迫下3種組織BaP的累積量和3-OH BaP含量的變化特征

        本研究顯示,3個組織對BaP的吸收速率大小為內(nèi)臟團(tuán)>外套膜>閉殼肌,這種組織差異性可能與不同組織的生化組成和生理特性有關(guān)。PAHs具有很強的親脂性,已有研究證明,組織內(nèi)的脂質(zhì)含量是生物對親脂性多環(huán)芳烴累積的重要和決定性因素[15],而脂肪含量高的組織更容易富集多環(huán)芳烴[16]。外套膜和閉殼肌的脂肪含量為3.1%[17],內(nèi)臟團(tuán)中的消化盲囊脂肪含量最高達(dá)16.1%[18],導(dǎo)致了內(nèi)臟團(tuán)相對較高的BaP富集能力。

        在清水釋放階段(11~15 d),3個組織中BaP含量在釋放階段前期迅速降低,3個組織對BaP釋放率大小表現(xiàn)為內(nèi)臟團(tuán)>外套膜>閉殼肌。生物體內(nèi)各組織對BaP的釋放主要受控于新陳代謝活動、擴散作用以及排泄作用[19],內(nèi)臟團(tuán)中含有各種代謝酶,能夠?qū)aP轉(zhuǎn)化為代謝物或直接排出以降低其含量,從而維持機體較低的污染濃度[20],外套膜中BaP的排出主要通過血細(xì)胞的滲出進(jìn)行,相對于內(nèi)臟團(tuán)多種酶的作用來說要弱得多[21];而閉殼肌基本由肌球蛋白和肌動蛋白組成,無代謝、消化等功能[22]。

        3.3 BaP脅迫下代謝產(chǎn)物3-OH BaP作為生物標(biāo)志物

        目前,3-OH BaP在環(huán)境監(jiān)測中常作為生物暴露于BaP的生物標(biāo)志物[23]。本研究顯示,厚殼貽貝3個組織中BaP實際累積量與3-OH BaP含量變化均呈明顯的正相關(guān)性。由于不同濃度的BaP在進(jìn)入生物體后,各組織呈現(xiàn)出一種防御解毒反應(yīng),激活了細(xì)胞內(nèi)混合功能氧化酶,將BaP轉(zhuǎn)化為羥基代謝物,BaP濃度越高,生物的這種應(yīng)激反應(yīng)就越強烈[24]。在外界BaP持續(xù)不斷地脅迫下,生物機體通過混合功能氧化酶激活轉(zhuǎn)化為主要羥基化合物3-OH BaP產(chǎn)生解毒反應(yīng)[25]。因而厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中3-OH BaP含量變化與BaP暴露時間呈顯著時間效應(yīng)關(guān)系(表2)。由此可見,厚殼貽貝暴露在BaP水溶液環(huán)境中,代謝產(chǎn)物3-OH BaP的含量變化可以較好地反映環(huán)境中BaP的污染水平,并表征厚殼貽貝被BaP污染后的應(yīng)激效應(yīng),能夠作為BaP的環(huán)境監(jiān)測中貝類生物較靈敏的生物標(biāo)志物。

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