史劍權(quán)，王雋，趙國紅，張創(chuàng)業(yè)，劉毅

·論著·

肺結(jié)核病不同進(jìn)程中差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

史劍權(quán)，王雋，趙國紅，張創(chuàng)業(yè)，劉毅

101149 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（史劍權(quán)），結(jié)核內(nèi)科（王雋）；101500 北京市密云區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)二科（趙國紅）；100120 北京市肛腸醫(yī)院內(nèi)科（張創(chuàng)業(yè)）；101149 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所/首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科院耐藥結(jié)核病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌免疫室（劉毅）

通過生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)挖掘，探討肺結(jié)核發(fā)病過程中基因表達(dá)的變化，尋找潛在的生物標(biāo)志物，分析肺結(jié)核發(fā)生、發(fā)展和治療的分子機(jī)制。從 GEO 數(shù)據(jù)庫下載不同病程肺結(jié)核患者的全血基因芯片數(shù)據(jù)集，利用 R 語言篩選差異表達(dá)基因，并進(jìn)行 GO 和 KEGG 分析，構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵基因。結(jié)核潛伏期患者和活動性結(jié)核患者共獲得 71 個差異基因，治療后結(jié)核患者和活動性結(jié)核患者共獲得561個差異基因。在疾病不同病程中，差異基因富集于大量免疫相關(guān)過程和通路，如對 I 型和 II 型干擾素的應(yīng)答、免疫受體激活、參與炎性小體復(fù)合物形成、T 細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞脫顆粒、中性粒細(xì)胞相關(guān)免疫應(yīng)答等過程和功能，NOD 樣受體信號、RIG 樣受體信號、細(xì)胞因子與受體相互作用、結(jié)核、自噬等通路。篩選出 CXCL10、ISG15、OAS3、XAF1、OAS1、IFIT3、GBP1、RSAD2、GBP5、IFI44 是結(jié)核潛伏期患者和活動性結(jié)核患者間的前十位關(guān)鍵基因；IL-10、NOTCH1、MMP9、SPI1、CREB1、CTNNB1、JUN、ELAVL1、HSPA5、CYCS 是活動性結(jié)核患者和治療后結(jié)核患者間的前十位關(guān)鍵基因。肺結(jié)核病不同進(jìn)程中的差異表達(dá)基因的功能富集等分析結(jié)果表示與免疫應(yīng)答密切相關(guān)，CXCL10、ISG15、OAS3、XAF1、OAS1、IFIT3、GBP1、RSAD2、GBP5、IFI44、IL-10、NOTCH1、MMP9、SPI1、CREB1、CTNNB1、JUN、ELAVL1、HSPA5、CYCS 等關(guān)鍵差異基因有作為診斷標(biāo)記物的可能。

結(jié)核??； 差異表達(dá)基因； 生物信息學(xué)

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，主要由結(jié)核分枝桿菌（，）感染引起，目前是全世界十大死因之一，也是單一感染性疾病的首要死亡原因[1-2]。近些年來，我國對于結(jié)核病的防治已經(jīng)取得極大進(jìn)展，但仍是世界上結(jié)核病負(fù)擔(dān)較重的國家之一。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的 2020 全球結(jié)核病報(bào)告指出[3]，2019 年我國新發(fā)結(jié)核病約 83.3 萬人，居世界第三位。同時(shí)，COVID-19 全球大流行的對公眾心理健康和社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成極大影響和負(fù)擔(dān)的嚴(yán)峻背景，給結(jié)核病的控制帶來了極大挑戰(zhàn)。

全球約有四分之一的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，但大多數(shù)人可能處于潛伏感染狀態(tài)，而不是發(fā)病狀態(tài)。在從潛伏感染進(jìn)展到活動性結(jié)核的過程中，免疫系統(tǒng)起著重要作用。同時(shí)，近年來研究認(rèn)為結(jié)核病不僅是一種感染性疾病，也是一種免疫性疾病。免疫系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌感染的識別、反應(yīng)和相互作用將極大地影響疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[4]，然而具體的作用機(jī)制尚不完全明確。本文通過對數(shù)據(jù)庫中健康對照者、結(jié)核潛伏期患者、活動性結(jié)核患者以及治療后結(jié)核患者的全血轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選差異基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期找到與免疫相關(guān)或能成為潛在生物標(biāo)志物的差異分子，為了解結(jié)核的發(fā)病機(jī)制和診斷治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)選擇

從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI，https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中下載基因表達(dá)芯片 GSE54992、GSE19491。本研究選取兩組芯片中健康受試者42 例、結(jié)核潛伏期患者 75 例、活動性結(jié)核患者63 例、治療后結(jié)核患者 25 例的全血轉(zhuǎn)錄組測序芯片數(shù)據(jù)為研究對象，將其分別命名為健康受試者 HD 組、結(jié)核潛伏期患者 LTBI 組、活動性結(jié)核患者TB 組、治療后結(jié)核患者 TB after treatment 組。

1.2 數(shù)據(jù)處理和差異表達(dá)基因篩選

利用 R 語言的“l(fā)imma”包篩選芯片數(shù)據(jù)不同組別的差異基因。差異基因的篩選條件為差異倍數(shù) |log2FoldChange| > 1或 2，adjust < 0.05。分別對四組芯片中 HD-LTBI、TB-LTBI、TB-TB after treatment 進(jìn)行分析比較，篩選結(jié)核疾病進(jìn)展中差異表達(dá)基因。通過繪制主成分分析圖和火山圖，將差異表達(dá)基因的結(jié)果可視化。

1.3 差異基因的GO 和KEGG 富集分析

利用 R 語言的“Cluster Profiler”包對已篩選的差異表達(dá)基因分別進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）生物學(xué)功能富集分析、京都基因與基因組大百科全書（Kyoto Encyclopedia for Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析。其中 GO 包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。認(rèn)為< 0.05 為富集有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 差異基因編碼蛋白的相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選

利用 Cytoscape 軟件對篩選出的差異基因構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步通過CytoHubba 模塊篩選得到 10 個最有意義的 Hub 基因。韋恩圖分析不同病程患者篩選出的差異基因中的共有基因，與篩選得到的前十位最有意義的 Hub 基因中的共有基因，進(jìn)一步篩選更有意義的關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核進(jìn)展過程中不同階段全血差異基因篩選

通過預(yù)處理后的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行主成分分析后，發(fā)現(xiàn)四個組別的基因表達(dá)存在明顯差異，能夠分為四群（圖 1A）。根據(jù) |log2FoldChange| > 1 或 2 且< 0.05 的差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核潛伏期患者LTBI 組與健康受試者 HD 組共篩選到差異基因 4 個，其中 2 個上調(diào)，2 個下調(diào)（圖 1B）；結(jié)核潛伏期患者 LTBI 組與活動性結(jié)核 TB 患者組共篩選到差異基因 71 個，其中 52 個上調(diào)，19 個下調(diào)（圖 1C），前 10 位上調(diào)和下調(diào)差異基因見表 1 和表 2；活動性結(jié)核患者 TB 組與治療后結(jié)核患者 TB after treatment 組共篩選到差異基因561 個，其中 293 個上調(diào)，268 個下調(diào)（圖 1D），前 10 位上調(diào)和下調(diào)差異基因見表 3 和表 4。

Figure 1 Identification of different expression genes (DEGs) in the development of TB patients (A: PCA analysis; B: Volcanic map of differential genes between healthy subjects and latent tuberculosis patients; C: Volcanic map of differential genes between latent tuberculosis patients and active tuberculosis patients; D: Volcanic map of differential genes between active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis)

表 1 TB-LTBI 前 10 位差異上調(diào)基因

2.2 差異基因 GO 和 KEGG 富集分析

對篩選出的差異基因進(jìn)行 GO 和 KEGG 的富集分析，GO 分析結(jié)果應(yīng)用氣泡圖進(jìn)行展示，橫軸代表富集因子的比例，縱軸代表差異基因參與排名前 10 位的細(xì)胞組成、生物過程和分子功能。圓形越大代表某通路富集的基因數(shù)越多，顏色越紅代表.adjust 越小，富集越顯著。KEGG 通路富集結(jié)果應(yīng)用橫向柱形圖進(jìn)行可視化處理，紅色柱子代表上調(diào)基因的通路富集結(jié)果，藍(lán)色柱子代表下調(diào)基因的富集結(jié)果（圖2）。

健康人群與結(jié)核潛伏期患者之間篩選出的差異基因較少，無法進(jìn)行 GO 和 KEGG 富集分析（結(jié)果未展示），其原因可能與樣本選擇和數(shù)量相關(guān)，同時(shí)也側(cè)面反映出潛伏期患者難以診斷鑒別的臨床現(xiàn)狀。結(jié)核潛伏期患者與活動性結(jié)核患者相比，差異基因多富集于與免疫相關(guān)的生物過程和功能，主要包括對病毒的防御應(yīng)答、對 I 型和 II 型干擾素的應(yīng)答、免疫受體激活、碳水化合物結(jié)合、免疫球蛋白結(jié)合、參與炎性小體復(fù)合物形成等，上調(diào)基因主要富集于 NOD 樣受體信號、RIG 樣受體信號、病毒感染等通路，下調(diào)基因主要富集于病毒蛋白與細(xì)胞因子和受體相互作用、細(xì)胞因子與受體相互作用和原發(fā)性免疫缺陷通路（圖 2A、2C、2E、2G）?；顒有越Y(jié)核患者與經(jīng)過治療后的結(jié)核患者相比，差異表達(dá)基因主要涉及 T 細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞脫顆粒、中性粒細(xì)胞相關(guān)免疫應(yīng)答、細(xì)胞黏附分子連接等生物過程和分子功能，上調(diào)基因主要富集于抗利尿激素調(diào)節(jié)的水重吸收、結(jié)核、病毒蛋白與細(xì)胞因子和受體相互作用、硫胺素代謝、AMPK 信號途徑、細(xì)胞因子與受體相互作用等通路，下調(diào)基因主要富集于 RNA 降解、自噬、p53 信號途徑、各種 N-聚糖的生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工等通路（圖2B、2D、2F、2H）。

表 2 TB-LTBI 前 10 位差異下調(diào)基因

表 3 TB-TB after treatment 前 10 位差異上調(diào)基因

表 4 TB-TB after treatment 前 10 位差異下調(diào)基因

圖 2 GO 和 KEGG 富集分析（A：結(jié)核潛伏期患者與活動性結(jié)核患者差異基因生物過程分析；B：活動性結(jié)核患者與治療后結(jié)核患者差異基因生物過程分析；C：結(jié)核潛伏期患者與活動性結(jié)核患者差異基因細(xì)胞組成分析D：活動性結(jié)核患者與治療后結(jié)核患者差異基因細(xì)胞組成分析；E：結(jié)核潛伏期患者與活動性結(jié)核患者差異基因分子功能分析；F：活動性結(jié)核患者與治療后結(jié)核患者差異基因分子功能分析；G：結(jié)核潛伏期患者與活動性結(jié)核患者差異基因通路富集分析；H：活動性結(jié)核患者與治療后結(jié)核患者差異基因通路富集分析）

Figure 2 GO and KEGG enrichment analysis (A: Biological process analysis of differential genes between latent tuberculosis patients and active tuberculosis patients; B: Biological process analysis of differential genes between patients with active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis; C: Cell components analysis of differential genes between latent tuberculosis patients and patients with active tuberculosis; D: Cell components analysis of differential genes between patients with active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis; E: Molecular function analysis of differential genes between latent tuberculosis patients and active tuberculosis patients; F: Molecular function analysis of differential genes between patients with active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis; G: Pathway enrichment analysis of differential gene pathways between latent tuberculosis patients and active tuberculosis patients; H: Enrichment analysis of differential gene pathways between patients with active tuberculosis and patients with post-treatment tuberculosis)

2.3 蛋白互作分析和關(guān)鍵基因篩選

建立 PPI 網(wǎng)絡(luò)后，進(jìn)一步對前十位的 Hub 基因進(jìn)行分析，以篩選潛在生物標(biāo)志物并深入探究結(jié)核病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。潛伏期結(jié)核患者與活動性結(jié)核患者相比，TOP 10 Hub 基因分別為 CXCL10、ISG15、OAS3、XAF1、OAS1、IFIT3、GBP1、RSAD2、GBP5、IFI44（圖 3A）?；顒有越Y(jié)核患者與治療后結(jié)核患者相比，TOP 10 Hub 基因有上調(diào)基因 IL-10、NOTCH1、MMP9、SPI1、CREB1，下調(diào)基因 CTNNB1、JUN、ELAVL1、HSPA5、CYCS（圖3B）。同時(shí)，韋恩圖（圖 3C）結(jié)果顯示 HD-LTBI 組、TB-LTBI 組無共同差異基因；HD-LTBI 組、TB-TB after treatment 組有 2 個共同差異基因，分別是 PSMA7 和 IFI27；LTBI-TB 組、TB-TB after treatment 組有 7 個共同差異基因，分別是 CASP5、FCGR1A、IFIT3、SAMHD1、SLC26A8、TNFSF13M、AP7。

2.4 免疫浸潤分析

隨后通過 CIBERSORT 算法對健康人群和活動性結(jié)核患者的全血轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了 22 種免疫細(xì)胞浸潤分析并繪制了免疫細(xì)胞浸潤豐度圖（圖 4）。結(jié)果顯示，無論是在健康人群還是活動性結(jié)核患者中，單核細(xì)胞在免疫微環(huán)境中豐度最高。通過比較后發(fā)現(xiàn)，活動性結(jié)核患者外周血中 CD8+T 細(xì)胞、活化的 NK 細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等均顯著增高，記憶 B 細(xì)胞、幼稚 CD4+T 細(xì)胞、活化的記憶 CD4+T 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、靜息的 NK 細(xì)胞比例有所降低。

3 討論

結(jié)核病是一種主要由結(jié)核分枝桿菌感染而引起的嚴(yán)重危害健康的慢性呼吸道傳染性疾病，主要累及肺部，同時(shí)也累及全身的其他組織器官[1]。宿主免疫反應(yīng)與結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，但其具體的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，一般認(rèn)為以細(xì)胞免疫為主，近年來固有免疫的作用日益受到重視[4-6]。本研究通過將 GEO 數(shù)據(jù)庫中的研究對象分為健康人群、結(jié)核潛伏期患者、活動性結(jié)核患者、治療后結(jié)核患者四個組別，對全血轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因篩選，并進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和生物信息學(xué)分析，以揭示結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，篩選診斷和治療的生物標(biāo)志物。

對差異基因進(jìn)行 GO 和 KEGG 功能分析的結(jié)果提示多富集于免疫相關(guān)的功能和通路，如 NOD 樣和 RIG 樣受體相關(guān)信號通路，通路中的蛋白與固有免疫和適應(yīng)性免疫抗病毒感染密切相關(guān)[7-10]。細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞因子與其受體相互作用、細(xì)胞因子及其受體與病毒蛋白的相互作用相關(guān)基因也大量富集，宿主免疫微環(huán)境與病毒的相互作用極大影響疾病的進(jìn)展過程。我們發(fā)現(xiàn)，活動性結(jié)核患者與治療后結(jié)核患者相比，差異基因富集于 T 細(xì)胞活化和大量中性粒細(xì)胞相關(guān)途徑。Abengozar-Muela 等[11]發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染肉芽腫中 CD68+巨噬細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞明顯增多，我們的全血免疫細(xì)胞浸潤分析也得到了類似的結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌增殖能夠延遲 CD4+T 細(xì)胞啟動，使得 T 輔助體（Th）1 向 Th17 反向分化，增加了肺中性粒細(xì)胞，從而降低長期生存[5]。蔣秀娣等[12]發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染期間，患者外周血中性粒細(xì)胞的 CD64、TLR2 和 TLR4 的表達(dá)水平均明顯升高，且其吞噬功能下降明顯。結(jié)核分枝桿菌依賴活性氧（ROS）誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）形成，NETs 能夠捕獲和殺傷結(jié)核分枝桿菌，同時(shí)參與免疫調(diào)節(jié)和機(jī)體病理損傷過程[13]。

圖 3 PPI 互作分析和關(guān)鍵基因篩選

Figure 3 Intersection analysis of PPI network and crucial genes screening

Figure 4 Analysis of immune cell infiltration in healthy subjects and tuberculosis patients

干擾素在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用[14]。γ-干擾素釋放試驗(yàn)也在臨床上成為診斷結(jié)核感染的一種重要技術(shù)手段[15]。我們的分析結(jié)果表明，活動性結(jié)核患者與結(jié)核潛伏期患者相比，干擾素相關(guān)基因表達(dá)增加且多為排名靠前的關(guān)鍵基因。趨化因子 CXCL10，又稱干擾素誘導(dǎo)蛋白IP-10，是 CXCR3 的配體之一[16]。IL-18/IL-37/IP-10 信號復(fù)合物作為鑒別結(jié)核活動性和潛伏性的潛在生物標(biāo)志物[17]，CXCL10 還被認(rèn)為與肺結(jié)核治療不良結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，可以作為一種預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物[18]。此外，Xu 等[19]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素 B-245 β 鏈（CYBB）、基質(zhì)金屬肽酶 9（MMP9）和 CXCL10 通過趨化和激活巨噬細(xì)胞抵抗結(jié)核分枝桿菌感染，可作為脊柱結(jié)核治療的分子靶點(diǎn)，改善患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。2'-5'寡聚腺苷酸合成酶（OAS）是一種干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白，通過激活 RNA 切割通路被稱為抗病毒反應(yīng)系統(tǒng)的介質(zhì)。OAS1、OAS2 和 OAS3 在許多區(qū)分活性結(jié)核和潛伏結(jié)核感染的基因表達(dá)特征中表達(dá)上調(diào)，其基因表達(dá)與分枝桿菌的致病性和毒力有關(guān)，能夠限制細(xì)胞內(nèi)致病性分枝桿菌的復(fù)制，增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子的分泌[20]，OASs 還具有其他細(xì)胞功能，包括誘導(dǎo)凋亡、增強(qiáng) IFNα/β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫細(xì)胞受體調(diào)節(jié)和自噬。Leisching 等[21]認(rèn)為，在結(jié)核的晚期，通過 OAS 激活持續(xù)的 RNaseL 表達(dá)增強(qiáng) I 型IFN 信號，OAS 也可表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)能力。鳥苷酸結(jié)合蛋白（guanylate-binding protein, Gbp）家族基因，是 IFN-γ 誘導(dǎo)的鳥苷三磷酸酶（GTPase）超家族的一部分，能夠通過激活細(xì)胞降解機(jī)制，保護(hù)細(xì)胞免于潛藏侵入的致病菌造成的侵害，GBP1 缺陷和功能喪失后能夠賦予對李斯特菌或分枝桿菌感染的細(xì)胞自主免疫。盡管感染后 Gbp 大量產(chǎn)生，但其具體功能和機(jī)制仍需進(jìn)一步探究[22]。

篩選活動性結(jié)核患者與治療后結(jié)核患者的關(guān)鍵基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗炎細(xì)胞因子 IL-10 為最顯著上調(diào)基因，IL-10 影響 IFN-γ 的分泌，被認(rèn)為與結(jié)核分枝桿菌的免疫逃避及潛伏性感染有關(guān)[23]。然而目前不同研究結(jié)果關(guān)于 IL-10 的結(jié)果并不一致，夏小學(xué)等[24]發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核治療前后結(jié)核患者血清 IL-10 表達(dá)水平無明顯變化。還有研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者治療過程中，治療兩個月末與治療前血清 IL-10 顯著增加，而治療六個月末又恢復(fù)到治療前水平[25]。初治、復(fù)治肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者外周血 IL-10 水平顯著回升[26]。不同人群隊(duì)列的結(jié)果不同，這可能與選取的治療時(shí)間點(diǎn)有關(guān)，說明同一種細(xì)胞因子在疾病的不同階段處于動態(tài)變化過程，與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。此外，人種差異也會影響分析結(jié)果。我們的數(shù)據(jù)來源主要是外國受試者，所處的環(huán)境和接受的治療方法的差異都可能導(dǎo)致結(jié)果有所差異。NOTCH1 基因在活動性結(jié)核患者外周血中表達(dá)顯著高于潛伏期患者和正常對照者，可能參與肺結(jié)核患者外周血中 Th1/Th2 比例變化，尤其與 Th2 細(xì)胞比例異常升高相關(guān)。CTNNB1 在結(jié)核病中可能起關(guān)鍵作用，其低表達(dá)與感染發(fā)病有關(guān)[27]。除了篩選關(guān)鍵 Hub 基因外，還通過韋恩圖篩選了不同階段結(jié)核患者的差異基因交集，有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)干擾素誘導(dǎo)基因 IFIT3 是結(jié)核潛伏期患者、活動性結(jié)核患者、治療后結(jié)核患者的共同差異基因，也是篩選潛伏期和活動期患者的關(guān)鍵 Hub 基因。IFIT 是重要的 IFN 誘導(dǎo)基因，包括 IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5，與抗病毒感染關(guān)系密切，與既往研究結(jié)果相一致[28]。關(guān)于 IFIT3 等其他干擾素誘導(dǎo)基因在結(jié)核進(jìn)展中的具體分子機(jī)制并不十分明確，有研究發(fā)現(xiàn)被結(jié)核分枝桿菌感染人類 THP-1 單核細(xì)胞分泌的微粒子 I 型干擾素誘導(dǎo)蛋白，ISG15、IFIT1、IFIT2 和 IFIT3 表達(dá)大量增加，促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加，這些蛋白可能成為結(jié)核分枝桿菌感染的潛在生物標(biāo)志物[29]。

本研究利用生物信息學(xué)分析的方法對不同病程的結(jié)核患者血液中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選和進(jìn)一步分析，證明了 CXCL10、ISG15、OAS3、XAF1、OAS1、IFIT3、GBP1、RSAD2、GBP5、IFI44、IL-10、NOTCH1、MMP9、SPI1、CREB1、CTNNB1、JUN、ELAVL1、HSPA5、CYCS等有作為診斷標(biāo)記物的可能，未來需要對國內(nèi)結(jié)核患者進(jìn)行進(jìn)一步的深入驗(yàn)證和分析。這些結(jié)果對深入了解結(jié)核的發(fā)病機(jī)制以及篩選結(jié)核診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

[1] Torres-Juarez F, Trejo-Martínez LA, Layseca-Espinosa E, et al. Platelets immune response against Mycobacterium tuberculosis infection. Microb Pathog, 2021, 153:104768.

[2] Lin Y, Zhu NY, Jiang JD, et al. Screening and activity of Mycobacterium tuberculosis FtsZ inhibitors. Chin Med Biotechnol, 2015, 10(2):109-112. (in Chinese)

林媛, 朱寧嶼, 蔣建東, 等. 結(jié)核分枝桿菌FtsZ抑制劑的篩選和活性研究. 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2015, 10(2):109-112.

[3] World Health Organization. Global tuberculosis report 2020. Geneva: World Health Organization, 2020. https://www.who.int/teams/global- tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2020.

[4] Philips JA, Ernst JD. Tuberculosis pathogenesis and immunity. Annu Rev Pathol, 2012, 7:353-384.

[5] Xu W, Snell LM, Guo M, et al. Early innate and adaptive immune perturbations determine long-term severity of chronic virus and Mycobacterium tuberculosis coinfection. Immunity, 2021, 54(3):526- 541, e7.

[6] Alemnew B, Hoff ST, Abebe T, et al. Ex vivo mRNA expression of toll-like receptors during latent tuberculosis infection. BMC Immunol, 2021, 22(1):9.

[7] Yin L. The role and mechanism of intracellular model molecule NLRP6 in mycobacterium tuberculosis infection. Suzhou: Soochow University, 2017. (in Chinese)

殷亮. 胞內(nèi)模式分子NLRP6在結(jié)核分枝桿菌感染過程的作用與機(jī)制研究. 蘇州: 蘇州大學(xué), 2017.

[8] Hu S, Du X, Huang Y, et al. NLRC3 negatively regulates CD4+ T cells and impacts protective immunity during Mycobacterium tuberculosis infection. PLoS Pathog, 2018, 14(8):e1007266.

[9] Cheng Y, Schorey JS. Extracellular vesicles deliver Mycobacterium RNA to promote host immunity and bacterial killing. EMBO Rep, 2019, 20(3):e46613.

[10] Mortaz E, Adcock IM, Tabarsi P, et al. Interaction of pattern recognition receptors with mycobacterium tuberculosis. J Clin Immunol, 2015, 35(1):1-10.

[11] Abengozar-Muela M, Esparza MV, Garcia-Ros D, et al. Diverse immune environments in human lung tuberculosis granulomas assessed by quantitative multiplexed immunofluorescence. Mod Pathol, 2020, 33(12):2507-2519.

[12] Jiang XD, Yao XY, Duan AH, et al. Changes in neutrophil CD64, TLR2 and TLR4 expression and its effect on immune response during tuberculosis infection. Int J Lab Med, 2019, 40(14):1770-1772. (in Chinese)

蔣秀娣, 姚曉陽, 段愛華, 等. 結(jié)核病感染期間中性粒細(xì)胞CD64,TLR2和TLR4表達(dá)變化及其對免疫反應(yīng)的影響. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2019, 40(14):1770-1772.

[13] Rao JY, Li JM. Research progress in the extracellular trapping net of tuberculosis neutrophils. Chin J Cell Mol Immunol, 2020, 36(4): 360-364. (in Chinese)

饒佳月, 李俊明. 結(jié)核病中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的研究進(jìn)展. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2020, 36(4):360-364.

[14] Sun Y, Zhang W, Dong C, et al. Mycobacterium tuberculosis MmsA (Rv0753c) interacts with STING and blunts the type I interferon response. mBio, 2020, 11(6):e03254-19.

[15] Pebriany D, Anwar AI, Djamaludin W, et al. Successful diagnosis and management of tuberculosis verrucosa cutis using antituberculosis therapy trial approach. Pan Afr Med J, 2020, 37:216.

[16] Shang X, Wang L, Liu Y, et al. Diagnostic value of CXCR3 and its ligands in spinal tuberculosis. Exp Ther Med, 2021, 21(1):73.

[17] Wawrocki S, Seweryn M, Kielnierowski G, et al. IL-18/IL-37/IP-10 signalling complex as a potential biomarker for discriminating active and latent TB. PLoS One, 2019, 14(12):e0225556.

[18] Kumar NP, Moideen K, Nancy A, et al. Plasma chemokines are baseline predictors of unfavorable treatment outcomes in pulmonary tuberculosis. Clin Infect Dis, 2021, 73(9):e3419-e3427.

[19] Xu G, Xue J, Jiang J, et al. Proteomic analysis reveals critical molecular mechanisms involved in the macrophage anti-spinal tuberculosis process. Tuberculosis (Edinb), 2020, 126:102039.

[20] Leisching G, Cole V, Ali AT, et al. OAS1, OAS2 and OAS3 restrict intracellular M. tb replication and enhance cytokine secretion. Int J Infect Dis, 2019, 80S:S77-S84.

[21] Leisching G, Wiid I, Baker B. OAS1, 2, and 3: significance during active tuberculosis? J Infect Dis, 2018, 217(10):1517-1521.

[22] Kim BH, Shenoy AR, Kumar P, et al. A family of IFN-gamma-inducible 65-kD GTPases protects against bacterial infection. Science, 2011, 332(6030):717-721.

[23] Zhu TT, Pu P, Liu H, et al. Research progress on role of IL-10 in immunodulation during mycobacterium tuberculosis infection. China Anim Husbandry Vet Med, 2017, 44(5):1462-1467. (in Chinese)

竺婷婷, 卜棚, 劉晗, 等. IL-10在結(jié)核分枝桿菌感染和免疫中作用的研究進(jìn)展. 中國畜牧獸醫(yī), 2017, 44(5):1462-1467.

[24] Xia XX, Chen J, Lu HQ, et al. Different serum levels of TNF-α, IFN-γ, IL-10 and IL-17 in pulmonary tuberculosis before and after anti-tuberculosis treatment. Chin J Microecology, 2013, 25(3):306- 308. (in Chinese)

夏小學(xué), 陳江, 盧火佺, 等. 抗結(jié)核治療對肺結(jié)核病患者血清TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-17表達(dá)差異的影響. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2013, 25(3):306-308.

[25] Lao SH, Xie B, Dong HP, et al. Dynamic survey of IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-17A, IL-4, IL-6 and IP10 in serum during treatment of patients with pulmonary tuberculosis. Mod Hosp, 2016, 16(8):1172- 1174. (in Chinese)

勞穗華, 謝貝, 董海平, 等. 肺結(jié)核治療過程中血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平動態(tài)觀察. 現(xiàn)代醫(yī)院, 2016, 16(8):1172-1174.

[26] Zhou A, Xu QL, Li MQ, et al. The dynamic changes of serum TNF-α, IL-1, IL-10 and HMGB-1 during tuberculosis disease progres-sion.J Practical Med, 2017, 33(2):285-288. (in Chinese)

周安, 徐巧玲, 李明強(qiáng), 等. 結(jié)核患者血清TNF-α、IL-1、IL-10和HMGB-1動態(tài)變化及臨床意義. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 33(2):285- 288.

[27] Chen JR, Liu C, Cen JM, et al. Bioinformatic analysis of potential key genes for tuberculosis. J Parasitic Biol, 2020, 15(6):627-633. (in Chinese)

陳家瑞, 劉沖, 岑潔梅, 等. 結(jié)核病潛在關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析. 中國病原生物學(xué)雜志, 2020, 15(6):627-633.

[28] Ambühl LMM, Villadsen AB, Baandrup U, et al. HPV16 E6 and E7 upregulate interferon-induced antiviral response genes ISG15 and IFIT1 in human trophoblast cells. Pathogens, 2017, 6(3):40.

[29] Hare NJ, Chan B, Chan E, et al. Microparticles released from Mycobacterium tuberculosis-infected human macrophages contain increased levels of the type I interferon inducible proteins including ISG15. Proteomics, 2015, 15(17):3020-3029.

Bioinformatics analysis of differentially expressed genes in different stages of pulmonary tuberculosis

SHI Jian-quan, WANG Jun, ZHAO Guo-hong, ZHANG Chuang-ye, LIU Yi

Department of ICU (SHI Jian-quan), Department of Tuberculosis (WANG Jun), Beijing Chest Hospital, Capital Medical University, Beijing 101149, China; Department of Medicine, Miyun District Hospital of Traditional Chinese Medicine, Beijing 101500, China (ZHAO Guo-hong); Department of Medicine, Beijing Rectum Hospital, Beijing 100120, China (ZHANG Chuang-ye); Department of Bacteriology and Immunology, Beijing Key Laboratory on Drug-Resistant Tuberculosis Research, Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute/Beijing Chest Hospital, Capital Medical University, Beijing 101149, China (LIU Yi)

Toexplore the changes in gene expression during the progression of tuberculosis disease by bioinformatics analysis and data mining and to further search for potential biomarkers and analyzing the molecular mechanism of tuberculosis occurrence,development and treatment.Whole blood gene chip data sets of tuberculosis patients with different stages were downloaded from GEO database. Genes with different expression were screened by R language, and then analyzed through GO and KEGG pathway. PPI network was built and Hub gene screening was performed.71 differentially expressed genes were obtained from patients with latent and active tuberculosis, and 561 differentially expressed genes were done from post-treated tuberculosis and active tuberculosis patients. In different course of the disease, the enrichment of differentially expressed genes associated with a large number of immune process and pathways, such as the response to type I and type II interferon, the immune receptor activation, inflammasome complex, T cell activation and neutrophil activation, neutrophil degranulation, neutrophils mediated immunity, NOD-like receptor signaling pathway, RIG-like receptor signaling pathway, cytokines-cytokine receptors interaction, tuberculosis, autophagy. CXCL10, ISG15, OAS3, XAF1, OAS1, IFIT3, GBP1, RSAD2, GBP5 and IFI44 were identified as top 10 Hub genes between latent and active tuberculosis patients. IL-10, NOTCH1, MMP9, SPI1, CREB1, CTNNB1, JUN, ELAVL1, HSPA5 and CYCS are top 10 Hub genes between active and post-treated tuberculosis patients.The functional enrichment of differentially expressed genes at different stages of pulmonary tuberculosis progression was closely related to immune responses. Key differentially expressed genes, such as CXCL10, ISG15, OAS3, XAF1, OAS1, IFIT3, GBP1, RSAD2, GBP5, IFI44, IL-10, NOTCH1, MMP9, SPI1, CREB1, CTNNB1, JUN, ELAVL1, HSPA5 and CYCS, may be used as diagnostic markers.

Tuberculosis; differentially expressed genes; bioinformatics

LIU Yi, Email: liuyilotus@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.006

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)（2020-2-1042）；北京市教育委員會科技計(jì)劃一般項(xiàng)目（KM202010025001）

劉毅，Email：liuyilotus@hotmail.com

2021-03-15