王麗華，林東翔，張玉潔，李 燕，陸婷婷，周 蓉

(南京市產品質量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210028)

N-亞硝基胺化合物是具有-N-N=O官能團物質的總稱，是一類很強的化學致癌物質，在已發(fā)現(xiàn)的300多種N-亞硝基胺化合物中，約有90%能使40種受試動物發(fā)生腫瘤。N-亞硝基胺可通過呼吸道、消化道以及皮膚的吸收進入體內從而誘發(fā)癌變。大量的動物試驗表明，它們在人體內可能會將DNA烷基化，最終誘發(fā)癌癥，其致癌性已經被公認。橡膠制品中的N-亞硝基胺主要來自以仲胺為基礎的硫化促進劑和硫磺給予體分解后給出仲胺，然后與空氣中或配合劑中的氮氧化物(NOx)在酸性條件下生成穩(wěn)定的N-亞硝基胺[1]。在特定的環(huán)境下，橡膠制品中的N-亞硝基胺被釋放出來，從而有可能對人體造成巨大的危害。嬰幼兒鞋是指鞋號不大于170 mm，3周歲以下嬰幼兒穿用的鞋，嬰幼兒鞋是兒童用品中重要的一類，其質量安全對于兒童的成長和健康有重要的影響。兒童及嬰幼兒群體處于生理、心理和認知成長的發(fā)育時期，受行為能力和心智水平的限制，自我保護意識較弱，極易受到外界環(huán)境和產品的影響和傷害[2]。例如嬰幼兒好奇心強，有時會吸吮鞋子，這會使童鞋和孩子的皮膚，眼睛甚至口腔直接接觸，從而導致鞋子表面上殘留的有害物質傷害嬰幼兒的身體健康，N-亞硝基胺就是其中一類。考慮到兒童群體的特殊性，若日常穿用的鞋的橡膠部件中N-亞硝基胺含量不符合要求，所造成的危害比成年人更加嚴重。因此應對兒童鞋中N-亞硝基胺含量高度重視。強制性標準GB 30585《兒童鞋安全技術規(guī)范》中要求，嬰幼兒鞋橡膠部件中不應檢出N-亞硝基胺。我國另外兩個標準GB 250365-2010《布面童膠鞋》和GB 25038-2010《膠鞋健康安全技術規(guī)范》，也對橡膠部件中N-亞硝基胺規(guī)定為不得檢出。

目前N-亞硝基胺的檢測方法主要有分光光度法[3]、氣相色譜-熱能分儀儀聯(lián)用法[4]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[5-7]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法[8]、高效液相色譜法[9]以及液相色譜-串聯(lián)質譜法[10]。由于氣相色譜-熱能分儀儀聯(lián)用法儀器比較昂貴，且適用性比較窄，氣相色譜-串聯(lián)質譜和液相色譜-串聯(lián)質譜法儀也比較貴，很多實驗室也都不具備。GB 30585-2014中規(guī)定嬰幼兒鞋中橡膠部件中亞硝基胺的檢測方法為GB/T 24153給定的測試方法：氣相色譜-質譜檢測方法，是一個比較通用的方法，所用色譜柱也是實驗室檢測最常規(guī)的色譜柱類型。但實驗研究發(fā)現(xiàn)，12種亞硝基胺物質中的其中兩種亞硝基胺化合物N-亞硝基-N-甲基苯胺(NMPhA)和N-亞硝基-N-乙基苯胺(NEPhA)在標準規(guī)定的進樣口溫度為260 ℃下會分解成N-甲基苯胺(MPhA)和N-乙基苯胺(EPhA)，這是因為這兩種物質具有熱不穩(wěn)定性[11]。因此，按照標準GB/T 24153[12]規(guī)定的方法實際樣品檢測中當檢測出這兩種物質時，有可能是樣品種含有的MPhA或EPhA，就會造成假陽性結果。

本研究主要建立一種高效液相法來準確測定NMPhA和NEPhA，作為標準規(guī)定方法的一種補充，當用標準方法檢測出這兩種亞硝基胺時，進一步使用高效液相方法進行定性和定量，以避免假陽性的結果，提高檢測準確度，滿足檢測需求。

1 實 驗

1.1 主要儀器和試劑

儀器：Agilent 1260Infinity II超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器；超聲波清洗機，上海安譜實驗科技股份有限公司；BUCHI R-300旋轉蒸發(fā)儀，瑞士步琦有限公司；固相萃取裝置：配有真空泵，上海安譜實驗科技股份有限公司；XS204電子天平，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司。

試劑；甲醇，乙腈為色譜純，TEDIA試劑有限公司；N-亞硝基-N-甲基苯胺NMPhA和N-亞硝基-N-乙基苯胺NMPhA、N-甲基苯胺(MPhA)和N-乙基苯胺(EPhA)標準樣品，上海安譜實驗科技股份有限公司；超純水(MilliQ制備)。

1.2 標準溶液制備

分別準確稱取每種亞硝基胺標準物質0.10 g(精確至 0.1 mg)，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液，裝于棕色試劑瓶中保存。臨用時根據(jù)需要將標準儲備液用甲醇稀釋成適當濃度的標準工作溶液。

1.3 樣品溶液制備

按照GB/T 24153給定的方法制備試樣溶液，整個實驗的操作過程如下，取有代表性的試樣，用適當工具碎至邊長為 3 mm以下的顆粒，混勻。從混勻后的試樣中稱取5.0 g試料，至于錐形瓶中，加入30 mL甲醇，于超聲波發(fā)生器中超聲提取30 min，提取液轉移至濃縮瓶中，再往錐形瓶中加入20 mL甲醇，重復提取一次，合并提取液。濃縮瓶置于旋轉蒸發(fā)儀上，真空度控制在21.3～16.3 kPa，于35 ℃水浴中緩慢濃縮至稍少于4.5 mL，取下濃縮瓶，于漩渦混勻器上充分旋轉振蕩 1 min，將濃縮液中的樣液移入5 mL棕色容量瓶中。另取0.5 mL甲醇淋洗濃縮瓶壁，于漩渦混勻器上充分旋轉振蕩1min后，移入容量瓶合并，用甲醇定容至5 mL，搖勻。將C18固相萃取小柱致于固相萃取裝置上，用5 mL甲醇淋洗C18小柱。準確吸取2.0 mL樣液注入小柱，流出液收集于離心管中。然后用緩慢氮氣流吹至2 mL,樣液搖勻后裝入棕色進樣小瓶中，密封冷藏待測。

1.4 儀器色譜條件

色譜條件：色譜柱Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流動相：甲醇:水=65:35(體積比)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量10 μL；二極管陣列檢測器檢測。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

分別對NMPhA、NEPhA、MPhA以及EPhA標準溶液在200～400 nm波長范圍內進行光譜掃描，圖1為NMPhA的光譜掃描結果，NEPhA的光譜掃描結果與NMPhA類似，圖2為MPhA的光譜掃描結果，EPhA的光譜掃描結果與NMPhA類似。從圖1和圖2可以看出NMPhA、NEPhA和MPhA、EPhA的最大特征吸收波長不同，NMPhA和NEPhA在270nm處有強吸收，MPhA和EPhA在240 nm處有強吸收，由此可通過光譜定性鑒別NMPhA和MPhA、NEPhA和EPhA。為了更好的定性定量NMPhA和NEPhA，綜合考慮選擇檢測波長為270 nm。

圖1 NMPhA標準溶液光譜掃描圖

圖2 MPhA標準溶液光譜掃描圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了乙腈:水=(65:35)、甲醇:水=(65:35)為流動相對兩種亞硝基胺的分離效果，結果表明，兩種溶劑都能夠對兩種亞硝基胺進行有效分離，但由于乙腈的淋洗能力較強，出峰時間相對甲醇較短，且標準中樣品前處理萃取溶劑為甲醇，因此綜合考慮選擇甲醇/水作為流動相。

考察了甲醇:水比例分別為80:20、70:30、65:35、 60:40、50:50時兩種亞硝基胺的分離效果，結果表明，甲醇:水比例分別為80:20、70:30時，出峰時間相對較短，峰形較窄，當甲醇:水比例為60:40、50:50時，出峰時間相對較長，特別是50:50時，無法在10 min內分離，同時峰寬相對較寬，綜合考慮，選擇甲醇:水=(65:35)作為流動相。

在優(yōu)化的色譜條件下對四種濃度均為1.0 μg/mL的混合標準溶液進行測定，圖3是四種混合標準溶液的液相色譜圖，結果表明，在選定的色譜條件下可以有效分離四種標準物質，其中NMPhA和NEPhA保留時間分別為4.320 min和5.555 min，MPhA和EPhA的保留時間分別4.707 min和6.334 min。因此通過高效液相可以解決嬰幼兒鞋橡膠部件中亞硝基胺氣質檢測中出現(xiàn)假陽性的問題。

圖3 四種亞硝基胺液相色譜圖

2.3 標準曲線、線性相關性及檢出限

在選定的色譜條件下進一步對該分析方法進行方法學驗證。

配置濃度均為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的NMPhA和NEPhA標準溶液，在優(yōu)化的液相色譜條件下進樣測定，以濃度x為橫坐標，以峰面積為縱坐標y，進行線性回歸計算，得到濃度-峰面積線性關系曲線，NMPhA的線性回歸方程為：y=33.60270x-3.02975，相關系數(shù)R2為0.99949，NEPhA的回歸線性方程為：y=23.90825x-3.12566，相關系數(shù)R2為0.99943，可見兩種亞硝基胺的濃度和峰面積都呈現(xiàn)很好的線性關系，可以用來定量計算。

將一定濃度的兩種亞硝基胺標準溶液逐級稀釋并測定，根據(jù)信噪比(S/N)為3時對應的濃度確定為儀器的檢出限，信噪比(S/N)為10時對應的濃度確定為定量限，利用儀器自帶的軟件進行信噪比計算得出NMPhA的檢出限為0.01 μg/mL,定量限為0.03 μg/mL，NEPhA的檢出限為0.04 μg/mL,定量限為0.11 μg/mL。根據(jù)1.3所述的前處理方法可知兩種亞硝基胺的方法檢出限分別為0.01 mg/kg和0.04 mg/kg.

2.4 檢測方法的精密度、準確度

取經檢測不含這兩種亞硝基胺的嬰幼兒鞋橡膠部件樣品3份進行加標回收試驗，加標濃度分別為0.3 mg/kg、1.0 mg/kg、5.0 mg/kg，按照1.3所述樣品前處理方式進行萃取濃縮并上機定量測定，同時每個加標濃度分別重復測定7次，考察分析方法的精密度，結果見表1。

由表1可知，加標回收率在88.5%～108.6% 之間，RSD在0.86%～2.44%之間，方法具有較好的穩(wěn)定性，表明所建立的分析方法得到的測定結果比較可靠。

表1 兩種亞硝基胺的加標回收率和相對標準偏差實驗結果

2.5 實際樣品測定

從超市及批發(fā)市場等處隨機購買20雙嬰幼兒童鞋，取其橡膠部件按照1.3所述方法進行前處理，并用建立的液相方法進行測定，結果均未檢出這兩種亞硝基胺。

3 結 論

N-亞硝基胺類是禁止在嬰幼兒鞋橡膠部件使用的一類強致癌物質，其中N-亞硝基-N-甲基苯胺和N-亞硝基-N-乙基苯胺按照標準規(guī)定方法檢測易產生假陽性結果，導致誤判。因此，本研究建立了一種高效液相色譜法來分離和測定兩種亞硝基胺，以甲醇:水=65:35(體積比)為流動相，在波長為 270 nm，流動相流量為1.0 ml/L，采用Eclipse XDB-C18色譜柱和二極管陣列檢測器進行測定，兩種亞硝基胺在0.2～ 10 mg/L范圍下內呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.999，樣品加標回收率在88.5%～108.6%，相對標準偏差RSD<5%，檢出限分別為0.01 mg/kg和0.04 mg/kg。該方法可用于嬰幼兒鞋橡膠部件中N-亞硝基-N-甲基苯胺和N-亞硝基-N-乙基苯胺的定性定量測定，避免假陽性結果，提高檢測準確度。