楊昊虹，宋更選，王慧琳，孫志霞，王琳璇，謝惠春

(青海師范大學(xué) 青藏高原藥用動(dòng)植物資源青海省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008)

高脂血癥是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的重要因素，它可引起血管內(nèi)皮功能障礙形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生[1].研究證實(shí)，中藥在降血脂方面具有重要作用.近年來，研究發(fā)現(xiàn)中藥大黃有效活性成分主要由蒽醌及其衍生物、苷類化合物、鞣質(zhì)類、花青素類、多糖等組成[2]，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗炎、保肝及抗衰老以及降血脂等藥理作用[3-7].大黃總蒽醌(Rhubarb Total Anthraquinones，RTA)作為大黃主要活性成分，包含大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚及其葡糖糖苷等成分[8].目前，許多學(xué)者對(duì)大黃總蒽醌成分分離及提取做了大量研究[9-10]，表明大黃總蒽醌類成分具有廣泛的生物活性和改善肝臟、心血管以及血脂的作用[11-14].因此，本文選用不同劑量的唐古特大黃總蒽醌提取物，研究其對(duì)高脂大鼠血脂以及動(dòng)脈粥樣硬化的影響，為探究唐古特大黃總蒽醌在降血脂與預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，3月齡，體重220±20g，購自青海省西寧市地方病研究所，許可證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第14-002和14-003號(hào).

1.2 試劑及儀器

大黃素對(duì)照品(Emodin)，批號(hào)為0431k3505(sigma公司)；膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒(寧波瑞源生物科技有限公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(中生北控生物科技有限公司)；C-反應(yīng)蛋白(CRP)(山東3V生物工程集團(tuán))；鈣(Ca2+)測定試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)；中藥粉碎機(jī)(山東臨清宏源制藥設(shè)備有限公司)；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠)；美國貝克曼AU2700全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼公司)；輪轉(zhuǎn)精密切片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；KD-T電腦生物組織攤烤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；Nikon ECLIPSE 50i顯微鏡(日本尼康公司).

1.3 藥材及實(shí)驗(yàn)藥物

唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex Regel.)采集自青海省果洛藏族自治州，經(jīng)青海師范大學(xué)曾陽教授鑒定.

唐古特大黃總蒽醌提取物由前期制備，參照前人[15]方法利用大黃素為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，再利用紫外分光光度法測定大黃總蒽醌含量，最終唐古特大黃總蒽醌回收率為3.05%.

2 方法

2.1 分組及處理

將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、模型對(duì)照組、唐古特大黃總蒽醌提取物高、中、低劑量組，每組10只.除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠一次性腹腔注射維生素D3(300000IU·kg-1)后，每日飼以高脂飼料(81.3%基礎(chǔ)飼料、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油)以構(gòu)建高脂大鼠.各組于造模第6周開始灌胃給藥，連續(xù)4周.其中，空白對(duì)照組組與模型對(duì)照組平行給予同體積生理鹽水，陽性對(duì)照組灌胃辛伐他汀4.5mg·kg-1·d-1，總蒽醌提取物高、中、低劑量組分別灌胃大黃總蒽醌1.190g·kg-1·d-1、0.396g·kg-1·d-1和0.132g·kg-1·d-1.

2.2 檢測指標(biāo)及方法

2.2.1 觀察大鼠的體重、飲食、排便等一般精神狀況

2.2.2 血脂及生化指標(biāo)測定

末次給藥后大鼠禁食12h，心臟取血，離心后取上清液分別測定膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)以及鈣(Ca2+)含量.

2.2.3 組織病理檢測

剖腹取大鼠肝臟，清洗血跡并用濾紙吸盡表面水分，精確稱重計(jì)算肝指數(shù).隨后，切取肝臟固定于10%福爾馬林液，石蠟包埋，采用HE常規(guī)染色，光鏡下觀察組織病理變化情況.

取各組大鼠胸主動(dòng)脈制作切片，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，觀察各組病變情況.

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示.兩樣本均數(shù)間采用T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，多樣本采用ANOVA單因素方差分析處理.P<0.05有顯著性差異，P<0.01有極顯著性差異，P>0.05為無顯著性差異.

3 結(jié)果與分析

3.1 各組大鼠體重變化

實(shí)驗(yàn)初期，各組大鼠整體狀態(tài)及飲食量并無明顯變化，模型組體重變化略高于空白對(duì)照組.第6周大黃總蒽醌提取物灌胃后，給藥各組體重隨劑量增加均呈不同程度的下降，尤以大黃總蒽醌高劑量組下降最為明顯.模型組于第8周左右時(shí)出現(xiàn)行動(dòng)欠活潑、精神萎靡、進(jìn)食量減少等癥狀，體重也有所下降，各組體重變化見表1.

表1 各組大鼠體重變化表(n=10，Mean±SD)

續(xù)表

3.2 各組血脂及生化指標(biāo)比較

結(jié)果表明(表2)，大黃總蒽醌各劑量組以及陽性對(duì)照組TC、TG、LDL-C極顯著(P<0.01)低于模型組但均高于空白組，其中尤以大黃總蒽醌高劑量組降低最為顯著.與模型組相較，給藥各組HDL-C均有不同程度的升高，然而均極顯著(P<0.01)低于空白組，大黃總蒽醌高劑量組升高至空白組同一水平.

表2 唐古特大黃總蒽醌對(duì)大鼠血脂水平的影響(n=10，Mean±SD)

測定結(jié)果表明(表3)，模型組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、ALP指標(biāo)均升高(P<0.01).與模型組比較，大黃總蒽醌各劑量組各項(xiàng)指標(biāo)隨著蒽醌劑量的增加呈下降趨勢，其中大黃總蒽醌高劑量效果優(yōu)于陽性對(duì)照組，能夠極顯著降低ALT、AST、ALP指標(biāo).

表3 唐古特大黃總蒽醌對(duì)大鼠肝臟生化指標(biāo)的影響(n=10，Mean±SD)

陽性組、大黃總蒽醌高、中劑量組CRP較模型組極顯著降低(P<0.01)，大黃總蒽醌中劑量組低于陽性組和大黃總蒽醌高劑量組，而大黃總蒽醌低劑量組并無顯著性差異.與模型組相較，陽性對(duì)照組、大黃總蒽醌低劑量組血Ca2+值不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各劑量組血Ca2+隨著總蒽醌劑量的增加呈下降趨勢，尤以高劑量血降Ca2+極顯著(P<0.01)，見表4.

表4 唐古特大黃總蒽醌對(duì)大鼠Ca2+和CRP的影響(n=10，Mean±SD)

3.3 各組大鼠組織病理變化

大鼠肝指數(shù)結(jié)果顯示(表5)，給藥組大鼠肝系數(shù)隨著大黃蒽醌濃度呈正相關(guān)，其中大黃總蒽醌高劑量肝指數(shù)與模型組相比較具有顯著性差異(P<0.05)，大黃總蒽醌低劑量組不具顯著性差異.

表5 各組大鼠肝系數(shù)比較(n=10，Mean±SD)

光鏡檢查結(jié)果顯示(圖1)，模型組(B)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹，核仁擠壓至邊緣且核膜增厚，同時(shí)細(xì)胞間隙出現(xiàn)膽汁淤積現(xiàn)象，肝組織可見明顯脂肪變性.與模型組相較，各給藥組均有不同程度好轉(zhuǎn)，脂肪變性減弱，脂滴減少，未出現(xiàn)明顯膽汁淤積現(xiàn)象，其中大黃總蒽醌高劑量組(F)病變顯著減輕，中劑量組(E)和低劑量組(D)差異不大，然而各給藥組相對(duì)于正常對(duì)照組肝細(xì)胞腫大，核膜增厚清晰可見.

主動(dòng)脈組織學(xué)形態(tài)檢查結(jié)果見圖2，空白組大鼠(A)胸主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜和外膜結(jié)構(gòu)完整且清晰可見，未見異常改變.模型組(B)內(nèi)皮下有大量泡沫細(xì)胞堆積以及脂質(zhì)堆積，中膜平滑肌細(xì)胞有不同程度的萎縮，內(nèi)膜表面纖維組織增生，具有明顯的病變形態(tài).大黃總蒽醌高劑量組(F)血管內(nèi)膜明顯變薄且厚度大致均一，結(jié)構(gòu)完整，彈性內(nèi)膜連續(xù)，表面光滑，在中膜層中彈性膜連續(xù)無斷裂，平滑肌環(huán)形緊湊排列，平滑肌細(xì)胞形態(tài)和大小正常且分布均勻，與中、低劑量組(E、D)相比主動(dòng)脈病變稍輕，無病變的主動(dòng)脈壁、內(nèi)膜、中膜、外膜均清晰可見，各層結(jié)構(gòu)正常，且內(nèi)皮細(xì)胞下有泡沫細(xì)胞明顯少于中、低劑量組，因此大黃總蒽醌高劑量組的藥效更為突出.

注：圖中箭頭所指為泡沫細(xì)胞圖2 不同處理組胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化(×400)

4 討論

高脂血癥是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的重要因素[16].研究結(jié)果表明，血漿中TC、TG水平升高，與LDL結(jié)合后形成LDL-C轉(zhuǎn)運(yùn)至動(dòng)脈管壁，造成脂質(zhì)沉積引起慢性炎癥反應(yīng)加速AS的發(fā)展[17].然而，HDL-C含量與AS形成呈負(fù)相關(guān)，能夠抵制動(dòng)脈粥樣硬化的形成.因此，改善脂質(zhì)代謝是預(yù)防AS形成的一個(gè)關(guān)鍵因素.本研究結(jié)果表明，唐古特大黃總蒽醌提取物干預(yù)后，大鼠TC、TG、LDL-C的含量減少，HDL-C含量升高，尤以高劑量組效果最為顯著，這與前人研究結(jié)果一致[18-20]，說明大黃總蒽醌能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝進(jìn)而改善AS的形成，但是其作用存在劑量效應(yīng)性.

AS的發(fā)生往往伴隨著脂肪肝等肝臟疾病的出現(xiàn)，脂肪過度攝入導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂甚至造成肝損傷，因此脂肪堆積在肝臟，影響肝細(xì)胞的功能造成結(jié)締組織增生，最終導(dǎo)致肝硬化.AS通常會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，甚至?xí)?dǎo)致脂肪肝.長期高脂食物的攝入導(dǎo)致肝臟脂肪變性，引起肝臟代謝功能異常，從而促進(jìn)AS的形成.本研究中，高脂飲食導(dǎo)致模型組大鼠血脂、膽固醇水平增高，造成肝組織損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性及點(diǎn)狀壞死，致使血清AST、ALT和ALP顯著升高.從表3中發(fā)現(xiàn)，大黃總蒽醌能明顯改善AST、ALT、ALP水平，減輕高脂飲食造成的肝損害，間接說明了對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用，且組織切片結(jié)果顯示大黃總蒽醌從改善肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞形態(tài)、脂肪變性程度等方面對(duì)肝臟進(jìn)行保護(hù)，說明大黃總蒽醌對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂所引起的脂肪肝有較好改善作用，從而進(jìn)一步預(yù)防AS的發(fā)病.

血鈣升高可誘發(fā)高鈣血癥[21]，高鈣血癥與高脂血癥協(xié)同會(huì)造成動(dòng)脈管壁受損，引起脂蛋白滲透內(nèi)膜，進(jìn)而誘發(fā)AS斑塊[22].本實(shí)驗(yàn)中，與高脂模型組相較，大黃總蒽醌給藥組的血鈣含量降低，這一結(jié)果證明了大黃總蒽醌有一定的清除血鈣的能力，從而抑制血管鈣化.除此之外，大量實(shí)驗(yàn)證明炎癥細(xì)胞因子也是導(dǎo)致AS的一個(gè)關(guān)鍵原因[23].CRP作為炎癥敏感性指標(biāo)，其含量與AS的形成呈正相關(guān).本研究中，大黃總蒽醌給藥組以及陽性組的CRP值極顯著(P<0.01)低于模型組，說明大黃總蒽醌具有一定的抗炎作用，進(jìn)而影響AS的形成，其機(jī)制可能是由于大黃總蒽醌能夠有效地減輕肝損傷，從而減少CRP的分泌.

大量研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的發(fā)生與機(jī)體脂質(zhì)代謝異常作用密切相關(guān).因此，設(shè)法調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝水平是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的積極途徑之一[24].本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠構(gòu)建高脂大鼠模型，高脂飼料飼養(yǎng)的大鼠的體質(zhì)量均明顯高于普通飼料組，各組大鼠經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)，高脂飼料組大鼠動(dòng)脈出現(xiàn)平滑肌細(xì)胞增生，并向內(nèi)膜下遷移，內(nèi)膜水腫，明顯的泡沫狀脂質(zhì)顆粒沉積，說明高脂大鼠具有典型的AS癥狀，而大黃總蒽醌對(duì)AS有一定抑制作用，其中高劑量大黃總蒽醌作用下胸主動(dòng)脈修復(fù)效果較好，胸主動(dòng)脈中泡沫細(xì)胞以及血管壁上的病變明顯減少，與陽性對(duì)照組動(dòng)脈壁形態(tài)接近正常對(duì)照組，這一結(jié)果提示大黃總蒽醌對(duì)高脂大鼠主動(dòng)脈的影響隨著劑量的增加效果逐步明顯，至高劑量與辛伐他汀用相似，這與前人研究中大黃活性成分的作用效果有劑量依賴關(guān)系較為一致[25]，造成這一結(jié)果可能與大黃總蒽醌具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)以及保肝作用密切相關(guān)，然而關(guān)于唐古特大黃總蒽醌是如何調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來抑制AS的形成還需進(jìn)一步研究.