解新宇，趙越，張書(shū)博，楊紅宇，魏自民，張旭，趙麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

堆肥是易腐有機(jī)垃圾處理的主要方式之一[1]。易腐有機(jī)垃圾主要來(lái)源于農(nóng)業(yè)與工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物、畜禽糞便，以及人類活動(dòng)產(chǎn)生的生活及餐廚垃圾[2-3]。易腐有機(jī)垃圾中富含大量生物可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微生物可通過(guò)自身生物氧化作用代謝這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生大量能量[4-5]。這些能量一部分被微生物正常活動(dòng)利用，另一部分以熱能的形式散失，促進(jìn)堆肥發(fā)酵物升溫[6-7]。因此，堆肥過(guò)程中微生物的活性對(duì)于發(fā)酵溫度的變化至關(guān)重要。

當(dāng)堆肥原料的起始溫度低于20.0 ℃時(shí)，堆肥進(jìn)程溫度的動(dòng)態(tài)變化可分成4 個(gè)階段，其中，除升溫、高溫和降溫階段外，堆肥進(jìn)程還要經(jīng)歷一個(gè)從低溫到20 ℃的階段，這一階段對(duì)于微生物的大量繁殖和堆肥進(jìn)程的啟動(dòng)具有重要意義，被稱為起爆階段[8-10]。溫度是堆肥起爆進(jìn)程中與微生物活動(dòng)密切相關(guān)的因素。當(dāng)堆肥發(fā)酵物周圍環(huán)境溫度過(guò)低時(shí)，微生物活性減弱，其代謝活動(dòng)產(chǎn)生的熱量很快散失到空氣中，會(huì)導(dǎo)致堆肥進(jìn)程很難快速起爆。在這種低溫環(huán)境下，如果堆體小，發(fā)酵物受外界環(huán)境溫度影響更為嚴(yán)重，即使微生物有活性，分解有機(jī)組分產(chǎn)生的熱量對(duì)于堆肥升溫來(lái)說(shuō)也是微乎其微，因此堆肥很難起爆，甚至失??；如果發(fā)酵物體積過(guò)大甚至成一定規(guī)模，還會(huì)造成土地的浪費(fèi)，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致二次污染。此外，這種大堆體堆肥還存在升溫慢、溫度不均勻等問(wèn)題，有些部位達(dá)不到正常起爆溫度（20.0 ℃），會(huì)導(dǎo)致有機(jī)垃圾堆肥進(jìn)程起爆不完全[6]。因此，如何實(shí)現(xiàn)低溫條件下堆肥的快速起爆是亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。

為了確保堆肥進(jìn)程的正常起爆，保證微生物正常的代謝活動(dòng)，提高有機(jī)垃圾去除效率，研究者采用了一系列的保溫加熱措施，如采用外加熱水套的方式保證內(nèi)部秸稈堆肥發(fā)酵的順利起爆[11]；還有一些研究者分別利用電加熱[12]及沼氣加熱[13]的方式幫助堆肥快速起爆升溫。雖然這些加熱技術(shù)可以提升生物反應(yīng)器的溫度，并在較低的環(huán)境溫度下保證有機(jī)垃圾堆肥進(jìn)程的正常運(yùn)行，但既不節(jié)能，也不經(jīng)濟(jì)。特別是對(duì)于大型的堆肥工廠，加熱成本將占整個(gè)運(yùn)行成本的很大一部分。因此，本研究擬采用生物強(qiáng)化接種技術(shù)提升堆肥起爆效率，為冷涼地區(qū)有機(jī)垃圾高質(zhì)資源化技術(shù)提供新途徑，具有理論與實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 菌株活化

試驗(yàn)用菌株來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，篩選自冬季低溫土壤樣品。供試低溫菌為混合菌劑，經(jīng)宏基因組測(cè)序，確認(rèn)其屬于Pseudomonas及Psychrobacter。將菌種于-80.0 ℃超低溫冰箱中取出緩凍后，吸取200.0μL 菌液接入20.0 mL 經(jīng)過(guò)高溫滅菌的LB 活化培養(yǎng)基中，于20.0 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h后，置于4.0 ℃培養(yǎng)箱中備用。

1.2 供試材料

試驗(yàn)采用雞糞及稻殼作為堆肥原料進(jìn)行堆肥試驗(yàn)。雞糞主要來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物養(yǎng)殖基地，稻殼來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田。采集到的雞糞由于水分較大，需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)牧罆裉幚?，水分含量達(dá)到50%～60%時(shí)完成晾曬，將原料放入保鮮冷室備用。此外，對(duì)堆肥原料進(jìn)行理化指標(biāo)的測(cè)定，堆肥初始物料的理化性質(zhì)如表1所示。

表1 原料的基本性質(zhì)Table 1 Physical and chemical characteristics of raw materials

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

堆肥起爆試驗(yàn)設(shè)置接種低溫菌（CT 組）與未接種（CK 組）兩個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行。堆肥裝置內(nèi)部下層撒一層生物炭，并用枯枝覆蓋，以增加空隙，加大接觸面積，而后將雞糞與稻殼按照測(cè)定比例混合，將活化的混合菌劑以1.5%的比例（濃度為1.0×108CFU·mL-1）接入堆肥并混勻，調(diào)節(jié)水分至60%左右，碳氮比至20～30[14]。每組試驗(yàn)堆體質(zhì)量（濕質(zhì)量）約為12.0 kg，置于10.0 ℃冷室中，通氣量為0.5 L·kg-1·h-1，插入溫度測(cè)定裝置，放入冷室2 h 后開(kāi)始每隔2 h 觀察溫度，并記錄有效溫度。圖1 為試驗(yàn)用裝置圖。堆肥裝置主體為PVC 材質(zhì)，裝置長(zhǎng)360.0 mm、寬350.0 mm、高450.0 mm，容積約為56.7 L。

堆肥起爆試驗(yàn)根據(jù)溫度變化取樣，每次分別從堆肥裝置上、中、下3 個(gè)位置分別取樣，每次取樣量約600.0 g，并且隨機(jī)分成3 份，分別貯存于4.0 ℃保鮮室、-80.0 ℃低溫（液氮浸泡后）及常溫避光室。常溫避光室樣品風(fēng)干后粉碎過(guò)篩。

1.4 測(cè)試方法

1.4.1 總有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定

將烘干水分的樣品放入馬弗爐中，于（550.0±5.0）℃灼燒，4 h 后關(guān)閉電源，待溫度降低到100.0～150.0 ℃后，將樣品取出，放入干燥器中。待溫度降低到室溫后稱質(zhì)量，重復(fù)此步驟，直至樣品達(dá)到恒質(zhì)量為止，計(jì)算樣品質(zhì)量差值，即可得到各樣品總有機(jī)質(zhì)含量[15]。

1.4.2 碳水化合物含量測(cè)定

采用酸水解法測(cè)定堆肥起爆進(jìn)程樣品碳水化合物含量[16]。稱取樣品過(guò)0.25 mm 篩，置于帶塞玻璃試管內(nèi)，加入0.1 mL 12 mol·L-1硫酸溶液消解，并加熱煮沸，獲得待測(cè)液。取0.5 mL 待測(cè)液，順次加入0.5 mL水、1.0 mL 5%苯酚溶液及5.0 mL 濃硫酸溶液混勻。將試管靜置1.0 h，在485 nm 波長(zhǎng)下，以稀釋的硫酸溶液（V硫酸∶V水=5∶2）作參比，測(cè)定各個(gè)樣品的吸收值，根據(jù)差值計(jì)算碳水化合物含量。

1.4.3 粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定堆肥樣品中粗蛋白含量[17]。稱取1.0 g新鮮堆肥樣品，放入適量PBS緩沖液冰浴研磨后，放入2.0 mL 濃度為0.1%的三氟乙酸溶液，將混合物在4 ℃下振蕩2 h。將振蕩后的混合物取出，1 000 r·min-1離心5 min，取上清液依據(jù)考馬斯亮藍(lán)試劑盒（碧云天）進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

1.4.4 油脂含量測(cè)定

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》（GB 5009.6—2016）中的索氏抽提法對(duì)不同時(shí)段堆肥樣品油脂含量進(jìn)行測(cè)定[18]。首先取2.0～5.0 g 風(fēng)干后的樣品置于已烘干并稱過(guò)質(zhì)量的濾紙上，用細(xì)線繩捆綁包裝后再稱質(zhì)量，將其置于索氏抽提裝置中，在索氏抽提的底部收集瓶中裝入2/3體積的石油醚作為溶劑，石油醚的沸程為30.0～60.0 ℃。將裝置置于加熱套中，蒸餾溫度依據(jù)石油醚冷凝成液體的速度而定，一般為40.0～45.0 ℃，蒸餾時(shí)間10 h（回流液無(wú)黃色即視為蒸發(fā)結(jié)束）。蒸發(fā)后，將回流器中的樣品包取出（105.0±1.0）℃下烘干后置于干燥器中，稱其質(zhì)量。利用下式進(jìn)行粗油脂含量的計(jì)算。

式中：m0為濾紙質(zhì)量，g；m1為樣品包裝后質(zhì)量，g；m2為蒸發(fā)、干燥后樣品質(zhì)量，g。

1.4.5 pH及電導(dǎo)率（EC）

稱取不同測(cè)定時(shí)間段的新鮮堆肥樣品1.0 g，置于20.0 mL 錐形瓶中，按照1∶20（m∶V）的比例加入雙蒸水后，將錐形瓶放入搖床中200 r·min-1振蕩2 h[19]。將瓶中的浸提液利用普通定性濾紙過(guò)濾，采用多功能pH計(jì)同時(shí)測(cè)定pH及EC。

1.4.6 16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)

本試驗(yàn)的16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序由天津諾禾致源有限公司完成。DNA 檢測(cè)合格后，基于IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái)，利用單端測(cè)序方式，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行單端測(cè)序。測(cè)序得到的數(shù)據(jù)根據(jù)以下流程進(jìn)行分析：通過(guò)上述平臺(tái)得到的測(cè)序數(shù)據(jù)全部為fastq 格式，利用軟件過(guò)濾以及拆分后，即可以進(jìn)行OTUs（Opera?tional taxonomic units）分類分析[20]。隨后，依據(jù)OTUs的結(jié)果對(duì)物種進(jìn)行注釋，得到的數(shù)據(jù)就是相應(yīng)的物種豐度及其分布情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Canoco 5.1 進(jìn)行NMDS 分析，采用GraphPad Prism 9 完成數(shù)據(jù)繪圖，采用R 中的vegan實(shí)現(xiàn)方差分解分析（Variation partitioning analysis，VPA）和相似性百分比分析（SIMPER）。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫菌強(qiáng)化堆肥起爆進(jìn)程中溫度變化

堆肥是一個(gè)微生物自熱過(guò)程，微生物通過(guò)分解有機(jī)組分放熱促進(jìn)堆體升溫[21]。低溫菌強(qiáng)化冬季堆肥試驗(yàn)溫度變化見(jiàn)圖2。環(huán)境溫度在5.0～10.0 ℃浮動(dòng)。CK組溫度雖然呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但上升緩慢，且溫度上限并沒(méi)有在120 h 內(nèi)突破20.0 ℃，無(wú)法快速起爆。而CT 組在18 h 時(shí)快速通過(guò)起爆期，溫度達(dá)到20.1 ℃，并在36 h 溫度達(dá)到了50.2 ℃，此時(shí)CK 組的溫度僅為15.8 ℃。CT 組溫度最高可達(dá)到56.2 ℃，但達(dá)到溫度峰值后開(kāi)始下降，直至20.0 ℃左右后保持穩(wěn)定。

2.2 低溫菌強(qiáng)化堆肥起爆進(jìn)程中微生境因子變化

有機(jī)組分的分解轉(zhuǎn)化是堆肥升溫的主要熱量來(lái)源[22]。在低溫堆肥起爆階段，微生物通過(guò)在有氧條件下分解轉(zhuǎn)化堆肥中的簡(jiǎn)單有機(jī)組分（如糖類、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)）來(lái)獲取能量，并放出熱量[23]。本試驗(yàn)中，3 種有機(jī)組分變化情況見(jiàn)圖3a～圖3d。由圖可知，與CK組相比，CT 組中的有機(jī)質(zhì)、碳水化合物、粗蛋白及油脂含量均呈下降趨勢(shì)。其中，蛋白質(zhì)與油脂含量在36～48 h 下降量多于0～36 h。因此，低溫菌接種強(qiáng)化了有機(jī)組分的快速分解，促進(jìn)了堆體的快速升溫。

pH 及EC 是堆肥過(guò)程中衡量微生物活動(dòng)的重要指標(biāo)[24]。pH 變化見(jiàn)圖3e，CK 組0～48 h 堆肥pH 呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，相比于CT 組，CK 組堆肥pH 變化較平緩。CT 組中，pH 在0～48 h 迅速下降到5.80 左右，說(shuō)明此時(shí)微生物代謝旺盛，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)。隨后，CT 組中pH 變化趨于平穩(wěn)。pH 的動(dòng)態(tài)變化揭示了堆肥進(jìn)程中不同的微生物活動(dòng)狀態(tài)。

堆肥進(jìn)程中EC可以衡量無(wú)機(jī)鹽以及有機(jī)酸的含量，能間接反映堆肥體系中微生物利用無(wú)機(jī)鹽的情況，從而判斷微生物的活動(dòng)[25]。本試驗(yàn)堆肥中EC 的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖3f。CT 組與CK 組中EC 都在1.5～2.5 mS·cm-1波動(dòng)。CK 中EC 整體變化趨勢(shì)不同于CT 組，間接證實(shí)了接菌與未接菌試驗(yàn)組微生物活動(dòng)不同。

2.3 低溫菌強(qiáng)化堆肥起爆進(jìn)程中細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化

堆肥起爆期細(xì)菌群落的變化可以反映堆肥整體細(xì)菌群落演替狀況，同時(shí)也能明確接種低溫菌屬在堆肥中的變化情況[7]，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，在門水平上，CT 組中多數(shù)菌門在接種菌初期相對(duì)豐度最高，如Bacteroidetes、Actinobacteria、Verrucomicrobia 及Fibro?bacteres 等。Firmicutes 菌門在CT 組中36、48 h 及CK組的48 h相對(duì)豐度高于其他時(shí)間。此外，門水平相對(duì)豐度結(jié)果表明，接種低溫菌初期，堆肥中群落多樣性相對(duì)較高。

屬水平上，接種菌屬Pseudomonas在CT 組的36 h及48 h 相對(duì)豐度較高，是此階段的優(yōu)勢(shì)微生物菌屬。而Psychrobacter在堆肥溫度20.0 ℃左右時(shí)相對(duì)豐度較高。圖4b為屬水平上TOP 15的細(xì)菌群落相對(duì)豐度變化情況。結(jié)果表明，接種低溫菌的CT 試驗(yàn)組群落多樣性較高。隨著堆肥溫度的升高，CT 中Weissella及Staphylococcus等菌屬相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)。CK組群落多樣性低于CT 組，且整個(gè)過(guò)程中Weissella為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬。另外，雖然接種菌Pseudomonas及Psychrobacter在CK試驗(yàn)組中也存在，但其相對(duì)豐度較低，且整體相對(duì)豐度在該時(shí)間段內(nèi)呈下降趨勢(shì)。

2.4 低溫菌強(qiáng)化堆肥起爆進(jìn)程biomarkers分析

NMDS 分析可以將多維變量簡(jiǎn)化到低維度，并通過(guò)對(duì)各指標(biāo)之間距離的定位分析來(lái)確定變量之間的相似性[26]。圖5a 為各試驗(yàn)組在堆肥初始、36 h 及48 h時(shí)細(xì)菌群落NMDS 分析結(jié)果。通過(guò)比較各組各相鄰取樣時(shí)間點(diǎn)之間的距離變化可知，CT 組與CK 組相比，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。堆肥初期接種低溫菌后，CT 組的細(xì)菌群落與CK 組初期的細(xì)菌群落存在明顯差異。CT 組中，與堆肥初期接菌后的群落結(jié)構(gòu)相比，36 h 及48 h 時(shí)的堆肥群落結(jié)構(gòu)差異較大。綜上表明，低溫菌的添加促進(jìn)了微生物群落結(jié)構(gòu)的演變。

SIMPER 是基于分解不同微生物群落之間的差異指數(shù)來(lái)計(jì)算單個(gè)物種對(duì)樣本的差異貢獻(xiàn)度的方法[27]，可以幫助認(rèn)知堆肥起爆進(jìn)程中起主要作用的生物標(biāo)志物。如圖5b 所示，Enterococcus在CT 組及CK組中均對(duì)群落演替有較高貢獻(xiàn)度。值得注意的是，CT中Pseudomonas及Psychrobacter對(duì)群落的演替具有較高貢獻(xiàn)度，說(shuō)明在CT 組中低溫菌對(duì)于群落結(jié)構(gòu)的改變起關(guān)鍵作用，屬于起爆進(jìn)程中促進(jìn)堆肥溫度升高的主要生物標(biāo)志物。

2.5 低溫菌強(qiáng)化堆肥起爆進(jìn)程中細(xì)菌群落與溫度提升響應(yīng)研究

為進(jìn)一步探究低溫菌強(qiáng)化堆肥起爆試驗(yàn)中不同因素對(duì)溫度變化的影響程度，以溫度變化為基礎(chǔ)，探究各組堆肥起爆試驗(yàn)組基礎(chǔ)微生境因子（有機(jī)組分變化量、EC 和pH）、接種菌屬豐度變化及細(xì)菌群落對(duì)溫度變化的驅(qū)動(dòng)作用[28]。VPA 的結(jié)果如圖6 所示。CT組中，從單個(gè)因子解釋量分析，接種菌對(duì)堆體溫度變化的解釋量為17.3%（P＜0.05），微生境因子及細(xì)菌群落變化對(duì)堆肥溫度變化的解釋量?jī)H為0.2%及6.6%（P＜0.05），顯著低于接種菌對(duì)溫度的影響。對(duì)溫度變化影響較大的堆肥因素為微生境因子、接種菌及細(xì)菌群落的交互作用，相關(guān)解釋量為27.1%（P＜0.05）。而CK 組中，雖然接種菌屬也存在，但豐度相對(duì)較低，對(duì)CK 細(xì)菌群落并沒(méi)有顯著影響。因此，CT 中堆體溫度的變化主要受到接種低溫菌豐度的影響，增加低溫菌的豐度可加速有機(jī)垃圾在低溫環(huán)境中的高效起爆。

3 討論

3.1 低溫堆肥起爆進(jìn)程中低溫菌對(duì)堆體溫度變化的影響

我國(guó)北方地區(qū)冬季氣候寒冷，冰凍期時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)垃圾堆肥低溫起爆效率低，堆肥過(guò)程顯著變慢甚至停止，若通過(guò)人工加熱的方法使物料的溫度上升到20.0 ℃以上，則會(huì)大幅增加成本，還可能造成二次污染，不利于堆肥技術(shù)的推廣[29]。因此，本研究借助低溫菌在低溫環(huán)境中高活性的優(yōu)勢(shì)，采用生物強(qiáng)化接種的方式，在短時(shí)間內(nèi)快速將有機(jī)垃圾的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為熱能，加速堆肥溫度的升高[30-32]。微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中的主要生長(zhǎng)要素變化會(huì)直接影響微生物的新陳代謝，影響微生物的數(shù)量以及微生物的群落變化[33]。

本研究中，環(huán)境溫度在5.0～10.0 ℃，CK 組在72 h時(shí)達(dá)到20.0 ℃左右，并且維持在該溫度以下直到起爆試驗(yàn)結(jié)束，說(shuō)明在未接種低溫菌的情況下，堆體內(nèi)部的溫度影響了多數(shù)微生物的正常代謝。接種低溫菌的CT試驗(yàn)組，其堆體溫度可迅速升高至20.0 ℃以上，達(dá)到大多數(shù)中溫菌均能生長(zhǎng)的溫度[34]，此時(shí)堆肥進(jìn)程中的多數(shù)微生物被激活，微生物通過(guò)自身分泌的酶蛋白等物質(zhì)迅速分解堆體中的有機(jī)組分，保證了堆肥溫度的進(jìn)一步升高。當(dāng)堆肥起爆進(jìn)程進(jìn)行到48 h 時(shí)，CT 組溫度達(dá)到峰值（56.2 ℃），隨后溫度開(kāi)始下降，直至120 h 起爆試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍平穩(wěn)保持在20.0 ℃左右。但在低溫起爆過(guò)程中存在高溫持續(xù)時(shí)間短、微生物活性降低的現(xiàn)象，究其原因可能是核心微生物必要營(yíng)養(yǎng)源的減少以及高溫引起的微生物活性降低[14，35]。低溫菌按照生長(zhǎng)上限溫度及最適生長(zhǎng)溫度劃分為嗜冷菌和耐冷菌兩種。嗜冷菌的生長(zhǎng)上限溫度約為20.0 ℃，且其最適生長(zhǎng)溫度在15.0 ℃以下；而耐冷菌的最適生長(zhǎng)溫度為20.0～25.0 ℃，并且在0 ℃依然可以存活[36-37]，其生長(zhǎng)溫度窗口較寬，作用時(shí)間更長(zhǎng)[38]。前期經(jīng)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，本研究接種的低溫菌屬于耐冷菌范疇，且其可生長(zhǎng)的溫度上限為45.0 ℃。在堆體溫度達(dá)到50.0 ℃以上后，多數(shù)低溫菌的生存受到高溫的威脅，活性降低。另外，為模擬冬季低溫環(huán)境，堆肥起爆試驗(yàn)進(jìn)程中會(huì)持續(xù)通氣，帶走大部分熱量。在低溫菌活性下降后，其余堆體微生物會(huì)不可避免地受到低溫脅迫，導(dǎo)致起爆后溫度的下降[39-40]。因此，堆肥中溫度的變化可以從堆肥微生境角度表征堆肥整體微生物群落的變化及代謝活性。

3.2 低溫堆肥起爆進(jìn)程中低溫菌對(duì)堆體細(xì)菌群落變化的影響

堆肥是一個(gè)微生物自熱過(guò)程，此過(guò)程中不同時(shí)期的優(yōu)勢(shì)微生物角色各有分工[41-42]。生物自熱過(guò)程的實(shí)質(zhì)為微生物對(duì)有機(jī)組分的生物氧化過(guò)程。低溫起爆堆肥進(jìn)程中生物氧化普遍存在，微生物分解有機(jī)組分釋放熱量，從而促進(jìn)堆肥在低溫環(huán)境中快速起爆。堆體溫度的變化也從側(cè)面表征了堆肥中微生物的代謝及多樣性變化?；?6S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果，從細(xì)菌群落門和屬水平相對(duì)豐度的變化可以確定，接種低溫菌可以改變微生物群落多樣性和豐度。Fir?micutes 在堆肥起爆進(jìn)程各時(shí)期均屬于優(yōu)勢(shì)微生物菌門，與以往報(bào)道一致[43-44]。

屬水平上，由SIMPER 結(jié)果可知，接種菌屬在堆肥整體群落變化中起關(guān)鍵作用。接種菌Pseudomonas為堆肥中常見(jiàn)的細(xì)菌菌屬，其多數(shù)菌種可在低溫環(huán)境中生存，并正常進(jìn)行分解代謝活動(dòng)[45]。Pseudomonas可在低溫寡營(yíng)養(yǎng)的廢水中去除硝酸鹽[46-47]，還可以在低溫環(huán)境中高效分解油脂類物質(zhì)，去除污染物[48]。此外，接種低溫菌顯著增加了CT 組中初始Pseudomonas的豐度，而CK 組中Pseudomonas的初始含量較低，且不是堆肥進(jìn)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，因此并不能幫助堆肥在短時(shí)間內(nèi)快速起爆。Psychrobacter是耐冷菌種的典型代表，其在低溫脅迫下依然可以有效分解環(huán)境中的硝基苯及硝基苯酚等物質(zhì)[49]，還可以通過(guò)鼠李糖脂等生物表面活性劑高效乳化油污[50]。因此，接種后低溫菌對(duì)堆肥中有機(jī)組分的分解起促進(jìn)作用，幫助堆體啟動(dòng)升溫。Psychrobacter在CT 組整個(gè)堆肥進(jìn)程中雖然不是高豐度菌屬，但其在起爆進(jìn)程中對(duì)微生物群落的演替起著重要的作用。通常，在微生物網(wǎng)絡(luò)中，每種微生物都有其獨(dú)特的生態(tài)位，一些微生物在過(guò)程中扮演“生產(chǎn)者”，又稱“礦工”[51]，一些微生物在過(guò)程中扮演“消費(fèi)者”，又稱“領(lǐng)導(dǎo)者”?！跋M(fèi)者”可以指揮“生產(chǎn)者”完成某項(xiàng)生命活動(dòng)，“生產(chǎn)者”可依靠自身優(yōu)勢(shì)分解物質(zhì)，為“消費(fèi)者”提供營(yíng)養(yǎng)源[52]。上述現(xiàn)象在各種微生物生態(tài)過(guò)程中十分常見(jiàn)[53]。因此，豐度并不是判斷微生物相互作用能力的唯一標(biāo)準(zhǔn)，低豐度微生物也可以是影響微生物群落的主導(dǎo)因素。在本研究中，Psychrobacter和Pseudomonas為堆肥起爆進(jìn)程中其他微生物群落演替的生物標(biāo)志物，可以作為幫助堆肥快速起爆升溫的“激活劑”。

3.3 低溫堆肥起爆進(jìn)程中的主要響應(yīng)調(diào)控因素

由VPA 結(jié)果可知，接種低溫菌后堆肥中影響溫度變化的主要因素為接種菌、細(xì)菌群落及微生境因子的聯(lián)合交互作用。在起爆進(jìn)程中，單個(gè)因素對(duì)溫度的影響小于多個(gè)因素對(duì)其的影響，說(shuō)明若想調(diào)控堆體溫度，使溫度快速升高，需考慮多重因素。此外，對(duì)比單個(gè)因素的貢獻(xiàn)解釋量，接種菌的豐度是影響溫度變化的最主要因素，說(shuō)明若想更快更高效地改善堆肥進(jìn)程溫度，提升效率，需首要考慮低溫菌的豐度和數(shù)量，改變堆體內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)[52]。還可根據(jù)有機(jī)垃圾和微生物的特性，分質(zhì)按需調(diào)控堆肥微生境因子，幫助低溫菌增長(zhǎng)并在低溫環(huán)境中代謝有機(jī)組分，促進(jìn)堆體快速升溫。本研究得出的改良調(diào)控措施能夠快速增加有機(jī)組分的分解量，增加堆體溫度提升效率，為進(jìn)一步提高低溫復(fù)合菌在冷涼環(huán)境中的作用效果提供理論支撐。低溫菌強(qiáng)化堆肥起爆進(jìn)程的研究對(duì)堆肥發(fā)展具有重要意義，未來(lái)將得到更加廣泛的應(yīng)用。

4 結(jié)論

（1）低溫菌強(qiáng)化可促進(jìn)冷涼環(huán)境畜禽糞便堆肥溫度的快速提升，使畜禽糞便堆肥在18 h 即通過(guò)起爆期，48 h達(dá)到56.2 ℃。

（2）低溫菌通過(guò)快速分解畜禽糞便中的有機(jī)組分，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為熱能，幫助堆體快速升溫，保證了堆肥的正?？焖賳?dòng)。

（3）低溫菌強(qiáng)化接種改變了堆體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，接種菌Pseudomonas及Psychrobacter是堆肥細(xì)菌演替的“激活劑”，可以激發(fā)堆肥發(fā)酵進(jìn)程細(xì)菌群落的演替。此外，堆肥溫度的改變是微生境因子、低溫菌豐度及細(xì)菌群落交互作用的結(jié)果。增加低溫菌的豐度和數(shù)量有利于加速低溫堆肥起爆進(jìn)程。