張俊亞，隋倩雯，魏源送*

（1.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境模擬與污染控制國家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100085；2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，水污染控制實(shí)驗(yàn)室，北京 100085；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

我國是畜禽養(yǎng)殖大國，畜禽養(yǎng)殖污染居全國污染物排放首位[1]。畜禽養(yǎng)殖糞污富含有機(jī)質(zhì)、氮、磷、重金屬、有機(jī)污染物和病原微生物，但隨著我國生態(tài)環(huán)境保護(hù)力度的不斷加強(qiáng)和新時(shí)代的生態(tài)文明建設(shè)，畜禽糞污處理處置也發(fā)生了相應(yīng)的變化。畜禽糞污污染控制早期以有機(jī)污染防控為主（COD 當(dāng)量），強(qiáng)調(diào)有機(jī)物去除、轉(zhuǎn)化和腐熟，解決土地利用中的黑臭和燒苗等問題；隨后發(fā)展成為以無機(jī)污染防控為主（重金屬、氮、磷等），減少重金屬在植物中的富集和農(nóng)業(yè)面源污染等問題；目前，畜禽糞污中生物污染的防控仍未引起足夠重視，亟需加強(qiáng)相關(guān)研究。2020 年10月17 日，為了維護(hù)國家安全，防范和應(yīng)對(duì)生物安全風(fēng)險(xiǎn)，我國頒發(fā)了《中華人民共和國生物安全法》，并將生物安全定義為國家有效防范和應(yīng)對(duì)危險(xiǎn)生物因子及相關(guān)因素威脅，生物技術(shù)能夠穩(wěn)定健康發(fā)展，人民生命健康和生態(tài)系統(tǒng)相對(duì)處于沒有危險(xiǎn)和不受威脅的狀態(tài)，生物領(lǐng)域具備維護(hù)國家安全和持續(xù)發(fā)展的能力[2]。危險(xiǎn)生物因子（Dangerous biological agents，DBAs）具有潛伏周期長、隱匿性強(qiáng)、溯源分析難等特點(diǎn)，如當(dāng)前對(duì)全球生物安全造成重大威脅的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2），其溯源分析是世界性科學(xué)難題[3-4]。1984 年美國歷史上發(fā)生的沙門氏菌感染恐襲事件，是在一年以后才被認(rèn)定是人為故意傳播導(dǎo)致的生物安全事件[5]。因此，識(shí)別潛在的DBAs，鑒定DBAs可能導(dǎo)致的生物安全事故，明確DBAs 在環(huán)境中的歸趨，進(jìn)而提前開發(fā)有效管控DBAs 的醫(yī)療措施等是預(yù)防生物安全事故、保障生物安全的重要研究領(lǐng)域。

隨著時(shí)代的發(fā)展，生物安全領(lǐng)域的范疇逐漸從人體健康保障擴(kuò)展到動(dòng)植物、環(huán)境等領(lǐng)域[5]。尤其是近年來畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的集約式、規(guī)模化發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域的生物安全問題引起了人們的廣泛關(guān)注。畜禽養(yǎng)殖行業(yè)是世界范圍內(nèi)動(dòng)物疫情暴發(fā)的熱點(diǎn)區(qū)域，如禽流感、非洲豬瘟（African swine fever，ASF）等動(dòng)物疫情的暴發(fā)，不僅影響到了食品的安全供應(yīng)，而且引發(fā)了人畜共患病的擔(dān)憂，始終是生物安全領(lǐng)域不可忽視的重大問題之一[6-7]。我國生物安全法第三章中亦將防控重大新發(fā)突發(fā)傳染病、動(dòng)植物疫情列為生物安全重要內(nèi)容[2]。此外，全球耐藥性（Antibiotic resistance）問題也是當(dāng)前學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)，由此引起的“超級(jí)細(xì)菌（Super bugs）”在世界范圍內(nèi)的傳播也成為政府部門普遍關(guān)注的潛在DBAs[8-9]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World health organization，WHO）估算，如果不采取有效措施，到2050 年，全球每年將有1 000 萬人因耐藥性問題而失去生命，超過因癌癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)[10]。聯(lián)合國環(huán)境署已將耐藥性問題列為國際新型環(huán)境問題之一，而抗生素污染控制亦是2021 年我國兩會(huì)期間重要關(guān)鍵詞，并將成為我國“十四五”期間迫切解決的環(huán)境問題之一[11-14]。因此，應(yīng)對(duì)微生物耐藥成為我國生物安全法適用的重要活動(dòng)之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國約52%的抗生素用于畜禽養(yǎng)殖行業(yè)，這導(dǎo)致畜禽廢棄物成為環(huán)境中抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的重要來源[15-18]，而ARGs 在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的傳播是當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

綜上所述，基于我國生物安全法的要求，畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的生物安全主要體現(xiàn)在動(dòng)物疫情和微生物耐藥問題。而畜禽糞污之于生物安全，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：（1）畜禽糞污是環(huán)境中ARGs 重要的源和匯，如何防控畜禽糞污中ARGs 的傳播是適用于我國生物安全法中有關(guān)微生物耐藥的防控；（2）導(dǎo)致動(dòng)物疫情的病原體如禽流感病毒、非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）能夠賦存于畜禽糞污中而進(jìn)行傳播，如何實(shí)現(xiàn)畜禽糞污中病原體的有效控制，減少動(dòng)物疫情的傳播是適用于我國生物安全法的內(nèi)容之一。圍繞DBAs 在畜禽糞污中的環(huán)境行為開展研究，對(duì)畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域開展生物安全控制工作具有重要意義。因此，本文以畜禽糞污中DBAs（ARGs 和病原體）為研究對(duì)象，從畜禽養(yǎng)殖行業(yè)污染物控制的角度，覆蓋源頭-生物處理-末端利用，通過文獻(xiàn)綜述解析DBAs 在環(huán)境中的行為，總結(jié)畜禽糞污處理處置中DBAs 在環(huán)境中的行為及對(duì)其控制的研究進(jìn)展，為畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的生物安全控制，防范畜禽養(yǎng)殖行業(yè)疫情，防控畜禽養(yǎng)殖源DBAs 向環(huán)境擴(kuò)散提供參考和借鑒。

1 畜禽糞污中DBAs的賦存特征

根據(jù)我國生物安全法的內(nèi)容，本文主要從微生物耐藥性和能引起動(dòng)物疫情的病毒等對(duì)DBAs 進(jìn)行分析總結(jié)。從微生物耐藥性的角度，主要是指核酸水平的ARGs 和細(xì)胞水平的耐藥病原菌。從動(dòng)物疫情暴發(fā)的角度，根據(jù)歷年來我國動(dòng)物疫情暴發(fā)的因素，主要是以病毒為主。因此，此部分內(nèi)容主要是分別探討ARGs、耐藥病原微生物和病毒等DBAs 在畜禽糞污中的賦存特征，以期為后續(xù)風(fēng)險(xiǎn)控制和治理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1.1 ARGs

由于抗生素在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的大量使用，畜禽糞便已成為環(huán)境中ARGs 的重要源[15，19]。以我國最大的畜禽養(yǎng)殖行業(yè)——生豬養(yǎng)殖為例，豬糞中檢測到146種ARGs，每克干豬糞中ARGs 的基因拷貝數(shù)高達(dá)1.3×1010，每萬頭存欄生豬養(yǎng)殖場，每天通過豬糞向環(huán)境中釋放的ARGs 的基因拷貝數(shù)高達(dá)4.0×1017±1.3×1017，并且育肥豬釋放的ARGs 遠(yuǎn)超其他生豬養(yǎng)殖階段[19-20]。豬糞中占主導(dǎo)的ARGs 為大環(huán)內(nèi)酯類（ermB，ermF）、四環(huán)素類（tetG，tetM）和磺胺類（sul1，sul2），每克干豬糞中ARGs 的基因拷貝數(shù)（lg 值），ermB 含量為6.47～10.56，ermF 為6.03～10.47，tetG 為6.43～9.82，sul1和sul2為6.19～9.86。從抗生素抗性機(jī)制來看，豬糞中以酶失活（Antibiotic inactivation）和外排泵（Antibiotic efflux）的抗性基因占主導(dǎo)，分別為44.5%和34.3%[20]。豬糞中ARGs 的賦存特征與抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的使用密切相關(guān)。生豬養(yǎng)殖過程中金霉素作為食品添加劑被廣泛使用，而大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是生豬養(yǎng)殖過程中重要的治療用藥物，這導(dǎo)致了四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類ARGs在豬糞中廣泛大量的存在[16]。隨著研究不斷深入，新型ARGs也不斷被發(fā)現(xiàn)，如mcr-1首先在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域被發(fā)現(xiàn)[11]，而目前已在各種環(huán)境樣品中被監(jiān)測到，如污水處理廠、土壤、河流等[21-23]。自2016年發(fā)現(xiàn)mcr-1以來，目前已發(fā)現(xiàn)39 種MCR 的變種ARGs，并推動(dòng)了黏桿菌素在我國畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域的禁用，具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義[24-25]。因此，如何進(jìn)一步識(shí)別和鑒定畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的新型ARGs，做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防也是當(dāng)前領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和值得深入探討的科學(xué)問題。

ARGs 作為環(huán)境中的一種新興污染物，本質(zhì)上屬于脫氧核糖核酸，是一種化學(xué)污染物質(zhì)，但其生物學(xué)特性決定了ARGs 作為環(huán)境中污染物的特異性[26-27]。ARGs 的化學(xué)特性決定了其降解性能，而其生物特性決定了其傳播、增殖特性。ARGs 在環(huán)境中主要是以胞內(nèi)（Intracellular，iARGs）和胞外（Extracellular，eARGs）兩種形式存在，同時(shí)通過轉(zhuǎn)化和細(xì)胞死亡實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)和胞外的轉(zhuǎn)變（圖1）[28]。畜禽糞污中的ARGs以iARGs 為主（占比＞99%），每克干豬糞中iARGs 的基因拷貝數(shù)為2.15×1010，eARGs 的基因拷貝數(shù)為6.29×107；每克干雞糞中iARGs的基因拷貝數(shù)為1.01×1010，eARGs 的基因拷貝數(shù)為4.28×106[29]。ARGs 的化學(xué)污染性質(zhì)主要體現(xiàn)在eARGs 上，ARGs 可在環(huán)境中實(shí)現(xiàn)降解和削減，且是胞外聚合物（Extracellular poly?meric substances，EPS）和溶解性微生物產(chǎn)物（Soluble microbial products，SMP）的重要組成部分，但其生物學(xué)特性決定了eARGs 可通過轉(zhuǎn)化作用進(jìn)入細(xì)胞成為iARGs。iARGs 主要體現(xiàn)ARGs 的生物學(xué)特性，通過宿主菌群的增殖實(shí)現(xiàn)ARGs 的垂直轉(zhuǎn)移（Vertical gene transfer，VGT）；基于轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）和轉(zhuǎn)接（Conjugation）在不同宿主間實(shí)現(xiàn)基因的水平轉(zhuǎn)移（Horizontal gene transfer，HGT）[30]?；诮y(tǒng)計(jì)學(xué)的研究結(jié)果，從ARGs 在畜禽糞污中的整體賦存特征來看，畜禽糞污中的微生物群落結(jié)構(gòu)是ARGs 賦存特性的決定性因子，即VGT 對(duì)整體ARGs 的賦存特性起決定作用[19-20]。如豬糞中微生物以厚壁菌門（Fir?micutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主，這兩類ARGs 是大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類ARGs 重要的宿主菌群，因此也決定了其在豬糞中的主導(dǎo)作用。但對(duì)于某個(gè)ARG 在畜禽糞污中的賦存特征而言，其表現(xiàn)出了多種因素的協(xié)同作用。如水平轉(zhuǎn)移元件（Mobile ge?netic elements，MGEs）intI1 對(duì)sul1 賦存的HGT 作用，而典型sul1 的宿主菌群Pseudomonas和Citrobacter在畜禽糞污中廣泛存在，其VGT作用對(duì)于sul1在畜禽糞污中的賦存亦不可忽視。但很難界定哪種作用貢獻(xiàn)更大，這是因?yàn)閱未蜨GT 的發(fā)生，可以通過VGT 作用不斷被擴(kuò)大[30]。此外，尚無有關(guān)畜禽糞污中ARGs 的HGT發(fā)生頻率的研究，iARGs和eARGs間的轉(zhuǎn)化研究也鮮有報(bào)道，這些都是值得深入研究的科學(xué)問題。

1.2 耐藥病原微生物

畜禽糞污中含有大量病原微生物，典型的細(xì)菌種類包括大腸桿菌（Escherichia coli）、腸球菌（Enterococ?cus）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staph?ylococcus aureus）、彎曲桿菌（Campylobacter）等，在獸用抗生素的作用下，耐藥病原菌對(duì)養(yǎng)殖場及周邊環(huán)境造成較大威脅。腸球菌（Enterococcus）和金黃色葡萄球菌是畜禽養(yǎng)殖源典型的革蘭氏陽性病原菌；沙門氏菌和大腸埃希氏菌（大腸桿菌）是畜禽養(yǎng)殖源典型的革蘭氏陰性病原菌。對(duì)公眾危害較大的耐藥病原菌包括具有碳青霉烯、廣譜頭孢菌素和/或氟喹諾酮耐藥性的腸桿菌科細(xì)菌，具有喹諾酮耐藥性的彎曲桿菌，具有甲氧西林耐藥性的金黃色葡萄球菌以及具有糖肽類耐藥性的腸球菌等，其攜帶的ARGs 如blaCTX-M、blaVIM、blaNDM、blaOXA-48-like、blaOXA-23、mcr、armA、vanA、cfr和optrA 的關(guān)注度最高[31]。從豬糞水中分離的典型病原微生物，如不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、Escherichia、叢毛單胞菌（Comamonas）、Enterococcus、假單孢菌（Pseudomonas），普遍具有多重耐藥性，同時(shí)攜帶sul和tet等多種ARGs，并同時(shí)攜帶一類整合子基因intI1[32]。

近年來宏基因組方法被用于鑒定病原菌或耐藥病原菌在環(huán)境中的分布，F(xiàn)ANG 等[33]分析了典型病原菌在豬糞污染的河流底泥（艱難梭菌Clostridium difficile、結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis），河水（弗氏志賀氏菌Shigella flexneri、百日咳博氏菌Bordetella pertussis）及溫室土壤（炭疽桿菌Bacillus anthracis，羊氏布魯氏菌Brucella melitensis）中的分布，并發(fā)現(xiàn)其具有多重耐藥性。宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組聯(lián)用可用于揭示ARGs 的賦存與表達(dá)，LIU 等[34]指出質(zhì)粒介導(dǎo)ARGs 較染色體ARGs 具有更高的表達(dá)。JIA等[35]發(fā)現(xiàn)紫外處理會(huì)導(dǎo)致污水中大環(huán)內(nèi)酯-林可霉素-鏈陽霉素B（MLSB）的抗性基因表達(dá)增高?；诖?，如何區(qū)分耐藥病原微生物ARGs 賦存、表達(dá)與耐藥病原菌毒力（Virulence）之間的關(guān)系，從耐藥病原微生物的角度，解析畜禽糞污中耐藥性問題可能導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)，仍是值得深入探討的主題。

1.3 典型病毒

畜禽糞污中富含大量的病毒，但有關(guān)畜禽糞污中病毒組（Virome）的研究非常有限。2021 年發(fā)表的有關(guān)牛糞污中病毒組的研究表明，牛糞污中發(fā)現(xiàn)7 682種病毒操作分類單元（Virus operational taxonomic units，vOTUs），種類繁多，其中91%的病毒屬于有尾噬菌體目（Caudovirales），10%的vOTUs屬于溫和型噬菌體（Temperate phages），說明牛糞污中以烈性噬菌體（Lytic phages）為主。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，只有兩個(gè)vOTUs 為已知，分別為Mycoplasma bacteriophageL2 和Streptococcus phageJavan630，絕大多數(shù)病毒無法做進(jìn)一步分類，說明牛糞污中絕大多數(shù)病毒目前仍然未知[36]。有關(guān)畜禽糞污中病毒組的研究，未知領(lǐng)域較多，還需要進(jìn)一步深入開展。

本文主要從生物安全的角度，分析導(dǎo)致重大動(dòng)物疫情的典型病毒在畜禽糞污中的賦存特征，而非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）導(dǎo)致的非洲豬瘟（African swine fever，ASF）疫情對(duì)我國生豬養(yǎng)殖行業(yè)的影響巨大[37-38]。ASF目前尚無有效治療方法和疫苗防控措施，致死率近100%[39]。ASFV 屬于非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）、非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus），是目前唯一已知的dsDNA蟲媒病毒[40]。ASFV的自然宿主為非洲疣豬，ASFV 在自然宿主體內(nèi)表現(xiàn)為亞臨床（subclinical）特性，但感染家豬和野豬后，表現(xiàn)為一種高度傳染性和致死性的出血性病毒病[41]。自我國2018 年8 月首例ASF 病例確診以來，ASFV 在我國境內(nèi)傳播迅速，且范圍廣，給畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)造成極大經(jīng)濟(jì)損失[42]。生豬感染ASFV后，ASFV能夠在畜禽糞污中體現(xiàn)，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的環(huán)境穩(wěn)定性。有研究表明，ASFV在畜禽糞污中能夠穩(wěn)定存在超過100 d[6]。但也有研究表明，ASFV 在豬糞中的存活時(shí)間同溫度有較大關(guān)系，在4 ℃條件下保存，8 d 依然有傳染性，而在37 ℃下能夠保留3～4 d[43]。值得注意的是，ASFV 作為一種dsDNA 病毒，DNA 在環(huán)境中的持久性為基于畜禽糞污提前預(yù)警ASF的暴發(fā)提供了可能。例如，有研究表明，感染ASF的野外疣豬尸體填埋一段時(shí)間（18～440 d）后，基于PCR 的方法仍能夠檢測到ASFV 的DNA 片段，但通過培養(yǎng)方法無法獲得ASFV，這說明病毒已經(jīng)被成功滅活，但是其核酸DNA 卻擁有更長的半衰期[44]。目前有關(guān)ASFV在畜禽糞污中的含量研究較少，疫情發(fā)展同畜禽糞污中ASFV 豐度之間的關(guān)系亦尚未可知。探討畜禽糞污中ASFV 與疫情的關(guān)系，開發(fā)畜禽糞污中ASFV 核酸殘留的快速監(jiān)測方法，對(duì)預(yù)防疫情、明確疫情發(fā)展趨勢具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)依據(jù)，值得深入探討。

2 畜禽糞污處理處置過程中DBAs的歸趨特征

本節(jié)主要從畜禽糞污處理處置的技術(shù)路線開展DBAs的歸趨特征解析。目前我國畜禽糞污的處理處置方式以最終去向劃分，主要包括資源化利用和達(dá)標(biāo)排放[45]。資源化利用又包括堆肥-土地利用、厭氧發(fā)酵-土地利用，堆肥和厭氧是核心生物處理工藝，而土地利用是最終歸宿。達(dá)標(biāo)排放指畜禽養(yǎng)殖廢水經(jīng)生物處理，達(dá)到國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)后，向周邊環(huán)境進(jìn)行排放。畜禽糞污處理方式不同、受納環(huán)境不同，使得畜禽糞污中的DBAs 歸趨存在較大差別。本節(jié)內(nèi)容主要以厭氧和堆肥等生物處理工藝為主要研究對(duì)象，考察DBAs 的歸趨，明確關(guān)鍵工藝參數(shù)對(duì)生物安全風(fēng)險(xiǎn)因子的影響。

2.1 畜禽糞污厭氧消化過程中DBAs的賦存與歸趨特征

根據(jù)我國2030年“碳達(dá)峰”和2060年“碳中和”的需求，厭氧消化作為畜禽糞污重要的資源化利用方式，將成為我國畜禽糞污處理處置的重要手段，其對(duì)環(huán)境中ARGs 傳播與擴(kuò)散的控制作用也得到了廣泛證實(shí)[46-47]。因此，如何實(shí)現(xiàn)厭氧消化產(chǎn)甲烷和ARGs削減的協(xié)同耦合是同步實(shí)現(xiàn)畜禽糞污資源化和抗生素抗性污染控制的關(guān)鍵。

整體而言，厭氧消化能夠?qū)崿F(xiàn)ARGs 的總體削減，對(duì)ARGs 的HGT 作用具有一定的抑制作用[48-49]。多項(xiàng)研究表明，厭氧消化對(duì)豬糞中高豐度ermB 能夠有效削減[50-52]。BENERAGAMA 等[53-54]發(fā)現(xiàn)中溫和高溫厭氧消化對(duì)豬糞中多重耐藥抗性基因均有很高的去除作用，去除率最高達(dá)到100%。但在某些特定ARGs 和一定條件下卻存在相反的結(jié)論，例如SUN等[55]研究了厭氧消化過程中tetC、sul2、ermB、gyrA 的豐度變化，發(fā)現(xiàn)其增加了2倍以上。SUI等[56-57]的研究也指出在某一養(yǎng)殖場糞污厭氧消化中，ARGs、intI1的豐度（lg 值）分別升高了0.41 和0.51，即使高溫厭氧消化也不能降低某些ARGs 的豐度。這些結(jié)果同厭氧消化的工藝操作條件具有較大關(guān)系[48-49]，影響畜禽糞污中ARGs 歸趨的因素繁多，包括反應(yīng)器構(gòu)型[58-59]、操作條件[52，60-61]、底物組成差異[62]等，如單相和兩相反應(yīng)器對(duì)厭氧消化中ARGs 歸趨差別的影響，工藝操作條件如固體停留時(shí)間（SRT）、含固率（TS%）、溫度等對(duì)ARGs 轉(zhuǎn)歸的影響[59，63]，以及雞糞和豬糞厭氧消化中ARGs 歸趨的差別。但綜合因素解析，微生物群落結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是厭氧消化中決定ARGs 歸趨的主導(dǎo)因素，特定條件下某種宿主菌群的大量增殖/衰減，不可避免地會(huì)導(dǎo)致所攜帶的ARGs 的富集/削減。有研究表明，ARGs 的宿主菌群同時(shí)亦是厭氧消化中重要的功能菌群[64-65]。ZHANG 等[66]研究了微生物群落結(jié)構(gòu)（Microbial community，MC）、MGEs、重金屬（Heavy metal，HMs）和ARGs 的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三者對(duì)ARGs 影響最大的是MC，其次是MGEs 和HMs，這一結(jié)論在不同研究中均得到了證實(shí)[55，67-68]。這說明ARGs 在厭氧消化中的歸趨主要是由其宿主菌群，即VGT所決定。厭氧消化條件的改變，導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)的演替，作為ARGs 的宿主菌群必然會(huì)影響到其歸趨特征。但MGEs介導(dǎo)的HGT對(duì)厭氧消化中ARGs的作用亦不容忽視，MGEs 同ARGs 共存于同一基因重疊群（Contigs）的情況廣泛存在，攜帶有ARGs 的質(zhì)粒在厭氧消化中的轉(zhuǎn)接現(xiàn)象也被廣泛驗(yàn)證[48，69]。但是，厭氧消化中ARGs 的HGT 頻率有待進(jìn)一步深入研究，其對(duì)ARGs 歸趨的總體貢獻(xiàn)雖然有限，但不容忽視。雖然ARGs 在畜禽糞污厭氧消化中存在，但是否表達(dá)并行使功能，相關(guān)研究依然缺乏。此外，在已知ARGs 在厭氧消化中行為和歸趨機(jī)制的基礎(chǔ)上，如何開展ARGs 的特異性或靶向控制是當(dāng)前領(lǐng)域的研究前沿。

有關(guān)ASFV 在厭氧消化中的歸趨研究較少。但DAVIES 等[70]基于ASFV 在畜禽糞污半衰期的研究表明，畜禽糞污中的ASFV 在37 ℃條件下保存3～4 d 后仍然保持有感染性，并認(rèn)為在厭氧消化條件下，通過pH和代謝產(chǎn)物的作用，能夠削減ASFV在畜禽糞污中的半衰期[70]。但也有研究表明，40 ℃、4 h能夠?qū)崿F(xiàn)豬糞中ASFV 的滅活，并指出高溫厭氧消化在數(shù)小時(shí)內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)ASFV 的滅活，中溫厭氧消化在數(shù)天內(nèi)也能實(shí)現(xiàn)ASFV 的滅活[6]。通常畜禽糞污厭氧消化的SRT保持在15～30 d，能夠?qū)崿F(xiàn)ASFV 的有效削減和控制。但目前有關(guān)厭氧消化對(duì)ASFV 滅活作用的研究均為實(shí)驗(yàn)室添加后的觀察，缺乏現(xiàn)場研究，開展ASFV 在實(shí)際畜禽糞污厭氧消化中的行為，探討其核酸DNA在厭氧消化過程中的行為，對(duì)于減少畜禽糞污污染導(dǎo)致的ASFV傳播具有重要意義。

2.2 畜禽糞污堆肥過程中DBAs的賦存與歸趨特征

堆肥對(duì)畜禽糞污中ARGs 的削減作用雖然存在相反的結(jié)果，但目前仍以削減為主。如在羊糞好氧堆肥過程中發(fā)現(xiàn)，雖然抗生素被有效削減，但tet和sul等ARGs 的豐度富集了9 倍[71]。在雞糞堆肥的現(xiàn)場研究中發(fā)現(xiàn)，ARGs 的相對(duì)豐度削減了67.3%以上[72]。有關(guān)牛糞和豬糞堆肥的研究也都表明了堆肥工藝對(duì)ARGs 的有效削減作用，但不同研究中ARGs 的削減/去除率差別較大，這同堆肥的不同工藝條件息息相關(guān)，如輔料的類型及用量、曝氣條件、工藝條件、溫度變化等[73-75]。從總體來看，堆肥對(duì)于畜禽糞污中的ARGs 能夠?qū)崿F(xiàn)較好的控制。如畜禽糞污中的mcr-1在規(guī)?；＜S堆肥中，22 d 后便低于檢出限[76]。雖然tetX、tetM、sul1 等在有關(guān)豬糞堆肥的研究中得到富集[77]，但這種富集普遍歸因于宿主菌群的變化，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化在堆肥過程中依然起主導(dǎo)作用。高溫期對(duì)于畜禽糞污堆肥過程中ARGs 的削減起到了關(guān)鍵作用，超高溫堆肥（＞70 ℃）對(duì)畜禽糞污中ARGs 能夠起到更好的削減作用[78]。此外，堆肥對(duì)畜禽糞污中ARGs 的表達(dá)具有較好的削減作用，并且不同階段ARGs的表達(dá)變化情況差別較大[79]。堆肥對(duì)四環(huán)素類ARGs 表達(dá)的削減效果明顯，而對(duì)磺胺類和喹諾酮類ARGs 的表達(dá)無作用，并在高溫期有所增加。進(jìn)一步研究表明，ARGs 的表達(dá)同其宿主的活性具有顯著相關(guān)性。畜禽糞污中ARGs 的組成在堆肥升溫期、高溫期、降溫期和后腐熟期發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，這同ARGs宿主菌群隨外界條件改變而進(jìn)行的演替呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。但目前有關(guān)畜禽糞污中iARGs 和eARGs在堆肥過程中的演替和歸趨特征研究尚缺乏。

堆肥對(duì)腸道病毒具有較好的滅活作用[80-81]，目前尚無有關(guān)畜禽糞污中ASFV 在堆肥過程中的變化和演替研究。但ASFV 的抗熱性較差，在60 ℃下經(jīng)過10 min，或者在55 ℃下經(jīng)過30 min，ASFV便會(huì)失去活性，堆肥工藝一般需要55 ℃至少維持5 d 以上，足以實(shí)現(xiàn)ASFV 的滅活。但需要進(jìn)一步開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證研究。此外，ASFV 滅活后殘留的dsDNA 在堆肥中的殘留也值得關(guān)注，作為ASFV 在環(huán)境中行為的生物標(biāo)記物，需對(duì)其開展進(jìn)一步研究。

2.3 畜禽糞污土地利用過程中DBAs的賦存與歸趨特征

目前，畜禽糞污產(chǎn)品（如堆肥、沼液、沼渣等）土地利用對(duì)土壤中ARGs 普遍具有富集作用，且該作用因土壤類型而異，這一點(diǎn)在不同研究中已經(jīng)得到了充分證實(shí)[82-85]。根據(jù)已有研究，對(duì)于畜禽糞污產(chǎn)品的土地利用過程，可以提出如下假設(shè)：在0～10 d，土壤內(nèi)源微生物因?yàn)闋I養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入，開始大幅增殖，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變；在10～30 d，源于畜禽糞污的外源微生物，由于無法適應(yīng)土壤環(huán)境逐漸衰減、死亡，其所攜帶的ARGs 也逐漸釋放至環(huán)境中發(fā)生降解；隨著時(shí)間的推移（＞30 d），雖然絕大部分ARGs能夠恢復(fù)到初始值，但由于某些eARGs 在環(huán)境中的可持續(xù)性，使ARGs的豐度仍然高于空白組。豬糞施用土壤后的結(jié)果也表明，耐藥性微生物在130 d后，其頭孢類耐藥菌的豐度仍然高于空白組，并且這類得到富集的頭孢類耐藥菌是來自土壤而非豬糞[86]。豬糞污中耐藥沙門氏菌和大腸桿菌的賦存時(shí)間受環(huán)境因素影響較大，耐藥菌濃度在沙質(zhì)土壤中衰減速率受糞污施用時(shí)間和降雨頻次影響[87]，耐藥病原菌在壤質(zhì)土中的賦存時(shí)間較其他類型土壤（沙土、黏土）短[87-88]。這些都說明畜禽糞污進(jìn)入土壤后對(duì)土壤中ARGs 和耐藥菌（Antibi?otic resistant bacteria，ARB）所帶來的影響的復(fù)雜性，一方面，外源微生物由于無法適應(yīng)土壤環(huán)境，導(dǎo)致ARGs 的宿主菌群死亡，釋放出eARGs，由于eARGs在環(huán)境中的可持續(xù)性，半衰期遠(yuǎn)高于其宿主菌群；另一方面，土壤內(nèi)源微生物由于畜禽糞污所帶來的營養(yǎng)物質(zhì)、選擇壓力等因素，導(dǎo)致內(nèi)源ARB 的快速增殖，從而引起ARGs 和ARB 的進(jìn)一步增殖。這些結(jié)果進(jìn)一步說明在土壤中，微生物群落結(jié)構(gòu)的演替依然是ARGs 歸趨的主導(dǎo)因素，而這一結(jié)論已經(jīng)得到了廣泛證實(shí)[89-92]。

從長期施用畜禽糞污對(duì)土壤中ARGs 歸趨的影響來看，ARGs均得到富集，微生物群落也發(fā)生了顯著變化，短期施用效果的研究能夠說明單次施用帶來的影響，這種影響雖然能夠使ARGs 和ARB 得到富集，但作用有限；長期施用條件下，土壤環(huán)境逐漸發(fā)生改變，使得更多的畜禽糞污源微生物能夠適應(yīng)土壤環(huán)境，并逐漸累積，直到達(dá)到一種土壤微生物和畜禽糞污源微生物的一個(gè)平衡，這種平衡的建立，很可能需要10～20 a，甚至更長時(shí)間。但無論是長期還是短期施肥所帶來的效應(yīng)，微生物群落結(jié)構(gòu)依然是ARGs 在土壤中歸趨的主導(dǎo)因素，即土壤內(nèi)源微生物增殖、外源微生物衰減和eARGs 殘留綜合作用下的結(jié)果。但土壤中ARGs 的HGT 依然在發(fā)生，并且畜禽糞污產(chǎn)品的施用增加了土壤中ARGs 水平轉(zhuǎn)移發(fā)生的頻率[93]。雖然HGT 發(fā)生的頻率有限，對(duì)土壤中ARGs 歸趨的貢獻(xiàn)有限，但其帶來的風(fēng)險(xiǎn)不可預(yù)估。土壤微環(huán)境如土壤類型對(duì)于HGT的發(fā)生具有顯著影響[94-95]（圖2）。前期研究表明，黃土中HGT 對(duì)ARGs 歸趨的貢獻(xiàn)明顯高于紅土和黑土[96-97]。但目前有關(guān)畜禽糞污中ARGs 在土壤中歸趨的研究，缺乏iARGs 和eARGs 的區(qū)分，明確不同類型eARGs和iARGs在土壤中的歸趨，對(duì)于控制其在土壤中的行為具有重要的指導(dǎo)作用。

雖然對(duì)畜禽糞污土地利用過程中ASFV 的環(huán)境行為研究缺乏，但是對(duì)于ASFV 在不同土壤類型中的穩(wěn)定性研究表明，土壤pH、土壤結(jié)構(gòu)和溫度對(duì)ASFV的穩(wěn)定性具有顯著影響[98]。ASFV 在無菌沙土中能夠存活至少3周，沙灘沙土中存活2周以上，庭院土壤中存活1 周，沼澤土壤中存活3 d，但在酸性森林土壤中并未篩選出活性ASFV，通過使用檸檬酸（Citric acid）和氫氧化鈣（Calcium hydroxide）改變土壤pH 后，各類型土壤樣品中均未再篩選出活性ASFV。因此，在考察受ASFV 感染的畜禽糞污土地利用過程中，應(yīng)充分考慮到土壤類型，并采用適當(dāng)?shù)南敬胧?，以減少土壤中活性ASFV 所帶來的風(fēng)險(xiǎn)。畜禽糞污土地利用過程中環(huán)境因素等對(duì)病毒組的影響仍然需要深入研究，無論是土壤內(nèi)源病毒還是外源病毒，目前研究均比較有限，亟需深入開展相關(guān)研究，這對(duì)識(shí)別、鑒定、控制新興DBAs 在環(huán)境中的傳播風(fēng)險(xiǎn)具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

3 畜禽糞污中DBAs的控制策略研究

本節(jié)將從防控動(dòng)物疫情和耐藥性的角度，提出畜禽糞污的處理處置策略和建議。畜禽糞污不是動(dòng)物疫情暴發(fā)的原因，卻是動(dòng)物疫情傳播的重要因素，如ASFV 并不源于畜禽糞污，而是來源于自然界中的非洲疣豬，但畜禽糞污對(duì)其傳播卻具有重要作用；而畜禽糞污中耐藥性問題卻相反，畜禽糞污是耐藥性和耐藥病原體傳播和暴發(fā)的重要源，環(huán)境中“超級(jí)細(xì)菌”的產(chǎn)生同畜禽養(yǎng)殖行業(yè)密不可分，而畜禽糞污是向環(huán)境中傳播超級(jí)病原體的重要載體。本文從DBAs 的不同來源，分別提出不同視角的控制策略。

3.1 畜禽糞污中耐藥性的控制

從生物安全風(fēng)險(xiǎn)控制的角度來說，畜禽糞污中耐藥性問題是一種DBAs 的源。畜禽養(yǎng)殖行業(yè)抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致畜禽糞污可能成為“超級(jí)細(xì)菌”的溫床，并通過環(huán)境傳播，從而引起生物安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，加強(qiáng)畜禽養(yǎng)殖行業(yè)耐藥性污染的控制至關(guān)重要。畜禽糞污中耐藥性污染控制的關(guān)鍵在于源頭減量，需要加強(qiáng)生物處理過程控制，明確末端利用風(fēng)險(xiǎn)。從源頭明確耐藥性產(chǎn)生的主要因素，減少抗生素的使用，提倡無抗養(yǎng)殖，并且由于重金屬等其他共選擇化合物的存在，減少飼料中重金屬元素如Cu、Zn、As 等的使用[99]。從ARGs 在畜禽糞污賦存特征及后續(xù)生物處理、土地利用過程中的歸趨來看，生物處理過程是削減ARGs 的關(guān)鍵，因此，加強(qiáng)生物處理過程對(duì)ARGs 和ARB 的削減也是目前研究的熱點(diǎn)之一。例如，通過鐵系化合物的投加實(shí)現(xiàn)厭氧消化中ARGs 的削減[51，64，66，68，100]，高溫厭氧消化對(duì)ARGs 的高效削減[52，101]，沸石粉的投加實(shí)現(xiàn)堆肥過程中ARGs 的控制[52，102-103]，延長堆肥高溫期、超高溫堆肥等對(duì)ARGs的有效控制[78]，γ 射線、紫外消毒等工藝對(duì)ARGs 的削減[104]，這些工藝條件的優(yōu)化和改善有助于削減畜禽糞污生物處理過程中的ARGs。但目前有關(guān)畜禽糞污中ARGs 的削減依然缺乏特異性，上述條件更多是對(duì)整體微生物的滅活或改變，但對(duì)于ARGs 和ARB 的削減缺乏靶向性和針對(duì)性。如何針對(duì)ARB 或ARGs 開展針對(duì)性、特異性的削減是值得深入探討的科學(xué)問題，而噬菌體的篩選和使用為特異性、靶向性控制ARB提供了理論可能。

利用噬菌體殺滅耐藥性細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)抗生素抗性污染的控制是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)，其對(duì)環(huán)境中抗生素抗性的靶向控制具有重要作用。如YU 等[105]將廣譜噬菌體“雞尾酒”以107pfu·mL-1的劑量添加到活性污泥中，成功控制了具有多重耐藥性的E.coliNDM-1，并且沒有影響污泥系統(tǒng)的活性。由于噬菌體在食品和醫(yī)療行業(yè)已廣泛且產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，人們并不擔(dān)心噬菌體本身會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生的不利影響[106-107]。目前影響噬菌體在畜禽糞污中耐藥病原微生物防控使用的因素主要有以下幾個(gè)方面：（1）噬菌體高度專一性導(dǎo)致的較窄宿主譜。針對(duì)這個(gè)問題，開發(fā)基于多種噬菌體并用的“雞尾酒”療法逐漸引起了人們的關(guān)注。有研究者提出建立“噬菌體銀行”以及“噬菌體雞尾酒銀行”，即將已知的噬菌體及其相關(guān)敏感宿主進(jìn)行數(shù)據(jù)分類并構(gòu)建檢索工具，在發(fā)現(xiàn)致病菌后，可以迅速找出相關(guān)敏感噬菌體并調(diào)制出合適的“噬菌體雞尾酒”[108]。（2）噬菌體通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用對(duì)環(huán)境ARGs 的傳播作用。轉(zhuǎn)導(dǎo)是由噬菌體介導(dǎo)的ARGs 水平轉(zhuǎn)移的方式之一。有研究表明，噬菌體是環(huán)境中ARGs 重要的庫，其可能會(huì)攜帶有毒力基因或ARGs，并通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將ARGs 水平轉(zhuǎn)移給宿主菌群[109-110]。因此，在將噬菌體投入實(shí)際環(huán)境應(yīng)用時(shí)，必須明確所使用的噬菌體有無毒性或ARGs。（3）噬菌體對(duì)環(huán)境較敏感，影響因素尚不清晰。環(huán)境參數(shù)的變化對(duì)噬菌體的有效性具有顯著影響，如鹽度、溫度、鈣鎂離子等[111]，針對(duì)不同的應(yīng)用場景，環(huán)境適應(yīng)性研究有待開展。例如，針對(duì)畜禽糞污已成為環(huán)境中ARGs 和耐藥菌的重要源這一問題，利用噬菌體的專一性，開展基于耐藥菌防控的靶向噬菌體篩選，并基于畜禽糞污生物處理環(huán)境，解析噬菌體的環(huán)境適應(yīng)性，對(duì)畜禽糞污資源化利用和達(dá)標(biāo)排放過程中ARGs和耐藥菌的控制具有重要意義。

3.2 畜禽糞污中動(dòng)物疫情病原體的控制

從生物安全的角度來看，畜禽糞污是動(dòng)植物疫情病毒的匯，而非源，但其對(duì)動(dòng)植物疫情病毒的傳播起到了一定的作用。以ASFV 為例，ASFV 并非源于畜禽養(yǎng)殖行業(yè)，而是自然界中的病毒進(jìn)入畜禽養(yǎng)殖行業(yè)并傳播，而畜禽糞污起到了其向環(huán)境傳播的載體作用。因此，加強(qiáng)動(dòng)物疫情病原體的鑒別、預(yù)警和防控至關(guān)重要，而畜禽糞污是實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的關(guān)鍵載體，其源頭控制也明顯區(qū)別于畜禽糞污中的耐藥性問題。通過加強(qiáng)畜禽養(yǎng)殖場同外界環(huán)境的接觸，加強(qiáng)從業(yè)相關(guān)人員入舍前的消毒至關(guān)重要?；谛笄菁S污開展動(dòng)物疫情病原體的源頭控制，重在病原體的鑒別和預(yù)警，因此亟需開展相關(guān)動(dòng)物疫情病原體的快速檢測方法研究，如適用于畜禽糞污的ASFV抗原檢測和qPCR檢測方法等[40-41]。

在疫情暴發(fā)期間，加強(qiáng)畜禽糞污生物處理過程和消毒措施，減少因畜禽糞污處置不當(dāng)導(dǎo)致的病毒傳播。例如，可通過增加厭氧消化SRT、延長堆肥高溫期、開發(fā)超高溫堆肥等技術(shù)手段，強(qiáng)化生物處理工藝對(duì)ASFV 等病毒的控制力度，探討紫外消毒、氯/臭氧等化學(xué)藥劑消毒等在畜禽糞污處理不同環(huán)節(jié)的適用性等，保障在畜禽糞污土地利用前實(shí)現(xiàn)其完全滅活。在土地利用過程中，可通過消毒措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)土壤中ASFV 等病毒的滅活。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，能夠?qū)崿F(xiàn)DNA病毒滅活的方法對(duì)于ASFV 病毒均能實(shí)現(xiàn)較好的削減效果，如檸檬酸、氫氧化鈣等[6]。在環(huán)境領(lǐng)域，如何實(shí)現(xiàn)ASFV 等導(dǎo)致動(dòng)植物疫情病毒的特異性控制，也是值得深入探討的主題。

4 總結(jié)與展望

依據(jù)我國生物安全法的相關(guān)要求，本文從環(huán)境工程和環(huán)境微生物學(xué)的角度，針對(duì)畜禽糞污中DBAs 的環(huán)境行為及其控制，總結(jié)了當(dāng)前研究進(jìn)展，并提出今后亟需開展的研究方向。

（1）明確畜禽糞污處理處置過程中的賦存與環(huán)境歸趨特征?；贒BAs 的分子生物學(xué)組成特征，重在防范動(dòng)物疫情的傳播，全面解析核酸（如ARGs）-核酸+蛋白（如病毒）-細(xì)胞結(jié)構(gòu)（如耐藥菌）在畜禽糞污處理處置過程中的賦存與環(huán)境歸趨特征，并深入開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究。

（2）開發(fā)畜禽糞污中新興DBAs 的識(shí)別、鑒定和快速檢測方法。畜禽糞污是DBAs 的匯和源，針對(duì)其開展畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域新興DBAs 的識(shí)別和鑒定，具有可行性和代表性，如新型ARGs 的發(fā)現(xiàn)、畜禽糞污中病毒組的深入研究、新型“超級(jí)細(xì)菌”的識(shí)別等。針對(duì)不同DBAs 特點(diǎn)，充分利用DBAs 遺傳物質(zhì)（DNA/RNA）在環(huán)境中的持久性，開發(fā)快速檢測方法，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物疫情的快速預(yù)警，具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

（3）加強(qiáng)畜禽糞污生物處理過程中DBAs 控制的靶向技術(shù)研發(fā)。目前，針對(duì)畜禽糞污中DBAs 的控制，主要還是依賴于對(duì)微生物的廣譜滅活技術(shù)（紫外、強(qiáng)氧化劑等），缺乏特異性和靶向性，可以利用DBAs的特點(diǎn)，開展靶向性控制技術(shù)研究。如針對(duì)烈性噬菌體對(duì)耐藥菌的靶向性殺滅作用，開展烈性噬菌體的篩選、組合和環(huán)境適用性研究等。

（4）加強(qiáng)畜禽糞污中有機(jī)污染、無機(jī)污染和生物污染的協(xié)同控制技術(shù)研究。畜禽糞污的污染防控，已經(jīng)從有機(jī)污染防控（強(qiáng)調(diào)有機(jī)物去除、轉(zhuǎn)化和腐熟），減少黑臭和施肥燒苗等現(xiàn)象，無機(jī)污染防控（重金屬、氮、磷等），解決重金屬在植物中的富集和面源污染問題，發(fā)展到了生物污染防控，因此，結(jié)合碳達(dá)峰/碳中和的需求，在資源化利用和達(dá)標(biāo)處理的前提下，加強(qiáng)DBAs的控制，開發(fā)有機(jī)污染、無機(jī)污染和生物污染的協(xié)同控制技術(shù)勢在必行。