李丹蘋，莫穎禧，吳 姝，韓培培，李麗媚，趙 軍，張海山，李 萍

[1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究自治區(qū)級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530021；4.頜面外科疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），南寧 530021；5.廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)口腔感染性疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；6.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021；7.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021]

口腔癌是多見的頭頸部腫瘤，侵襲性高，易于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，臨床上以口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)最為多發(fā)，占其發(fā)病率的90%。OSCC 通常發(fā)生在舌前2/3、牙齦、口腔底部、唇頰黏膜、牙槽嵴、硬腭以及磨牙后三角區(qū)[1]。盡管手術(shù)、化療、放療、造血細(xì)胞移植和靶向治療已經(jīng)取得良好的效果[2]，但腫瘤侵襲、頜面部破壞、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血源性傳播，仍使OSCC 成為一種致命的畸形性疾病[3]。因此，尋找有效的OSCC 診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，探究存在的信號(hào)通路及可能機(jī)制，能大幅提升OSCC患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶（TypeⅡtransmembrane serine protease,TTSP）家族是本世紀(jì)初新揭示的一種蛋白酶家族[4]，早期研究表明，TTSPs在上皮組織中廣泛表達(dá)[5]，并在上皮分化、鐵代謝等多種生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用[6]。近年來(lái)有關(guān)TTSPs致癌作用的研究不斷進(jìn)展，已證明TTSPs 參與了上皮癌變，與癌癥復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡率密切相關(guān)[7]，還具有靶向治療癌癥的潛力[8-10]?？缒そz氨酸蛋白酶11B(transmembrane serine protease 11B,TMPRSS11B)屬于TTSP 家族。TMPRSS11B 蛋白由一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域組成，具有催化三聯(lián)體及結(jié)合底物的殘基。主要位于上皮細(xì)胞表面，在子宮頸癌、食道癌和頭頸癌中明顯下調(diào)[11]。有研究表明，TMPRSS11B 可能在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展上發(fā)揮作用[12]。然而，TMPRSS11B 在OSCC 中的研究甚少，為探究與OSCC 發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)志物，本文重點(diǎn)探索了TMPRSS11B 基因在OSCC 中的表達(dá)變化，及其與OSCC 患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù) 從癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（UCSC Xena，http://xena.ucsc.edu/)中檢索并下載頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck，HNSC) 的TCGA數(shù)據(jù)集，包括mRNA信息和相應(yīng)的臨床參數(shù)。篩選出牙槽嵴、頰粘膜、口底、舌、唇和硬腭等口腔各部位的數(shù)據(jù)[13]，并剔除掉mRNA表達(dá)及臨床參數(shù)不完全的數(shù)據(jù)，分析TMPRSS11B在OSCC 患者組織和口腔正常組織中的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2 生存分析和診斷價(jià)值分析 提取TCGA 樣本中OSCC 患者的生存數(shù)據(jù)，以TMPRSS11BmRNA水平的中位數(shù)作為截?cái)嘀?。將OSCC 患者分為兩組，TMPRSS11B 高表達(dá)組和低表達(dá)組，以O(shè)SCC 所致死亡作為所有患者的預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)，利用Kaplan-Meier 法作生存曲線，分析兩個(gè)分組的患者的生存率；采取受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）來(lái)判斷TMPRSS11B 診斷OSCC的敏感性和特異性；采用曲線下面積(area under the curve,AUC) 分 析TMPRSS11B 的 診 斷 價(jià)值；采用約登指數(shù)確定TMPRSS11B的最佳臨界值。

1.3 GeneMANIA預(yù)測(cè)TMPRSS11B互作基因

Gene MANIA數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)通過(guò)大量基因組學(xué)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)找到功能相似的基因的網(wǎng)站[14]。在其主頁(yè)（http://genemania.org）搜索TMPRSS11B，定義物種為人，并根據(jù)基因間的現(xiàn)有的相互作用找到可能相同功能的基因，從而繪制出TMPRSS11B 的互作基因網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析 打開DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)[the database for annotation,visualization and integrated discovery (https://david.ncifcrf.gov/)]對(duì)TMPRSS11B 進(jìn)行GO(gene ontology，GO)功能注釋和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。

1.5 細(xì)胞和組織 人口腔上皮細(xì)胞（HOEC細(xì)胞）、口腔癌細(xì)胞株（CAL27、SAS 細(xì)胞）均購(gòu)于上海雅吉生物科技有限公司。收集2020年6～12月廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院病理科55 例OSCC 組織及配對(duì)的相鄰非癌組織石蠟塊（距離腫瘤邊緣至少5 cm處）。其中男19 例，女36 例，年齡27～91 歲，平均58 歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)兩位高水平病理醫(yī)師診斷為口腔鱗狀細(xì)胞癌的患者；（2）術(shù)前未受任何放、化療、免疫療法或靶藥療法的患者；（3）臨床材料完備的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）拒絕參加實(shí)驗(yàn)的患者；（2）有其他惡性腫瘤或全身性疾病的患者；（3）病理診斷不明晰的患者。本研究已獲廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)倫理審批（批號(hào)：2021028），并得到所有招募患者的知情同意。

1.6 試劑 Gibco 培養(yǎng)基、10%胎牛血清和100 U青霉素/鏈霉素，DEPC-Treated Water、Trizol 試劑、PowerUP SYBER Green Master MIX和TMPRSS11B多克隆抗體（貨號(hào)：PA5-31481）購(gòu)于賽默飛公司（美國(guó)）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒The TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis superMix 購(gòu)于北京全式生物科技有限公司。PV-6000免疫組化通用型試劑盒、EDTA（pH=9）抗原修復(fù)液、DAB 顯色試劑盒和碳酸鋰飽和溶液均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng) HOEC 細(xì)胞使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，SAS、CAL27用DMEM-F12培養(yǎng)，配置10%濃度的胎牛血清和1%濃度的青霉素/鏈霉素，將細(xì)胞放至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為37 ℃，CO2體積為5%，濕度為飽和濕度。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）

HOEC、CAL27、SAS 細(xì)胞RNA 由TRIzol 提取，后將其逆轉(zhuǎn)為互補(bǔ)DNA（cDNA）。RT-qPCR 采用StepOnePlus?實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)賽默飛公司)進(jìn)行。使用SYBER Green 試劑盒進(jìn)行qRTPCR。反應(yīng)體系總體積為20μL[10 ulSYBER Green（2×），7 μL DEPC 水，1 μL cDNA，1 μL 上游引物，1μL 下游引物]。引物序列為：TMPRSS11B：正向：5'-GTAAGCTGGGGTGATGGATGT-3'，反 向：5'-ATCCTTATCTGTGGCTTTGGGA-3'。GAPDH：正向：5'-GCTCAGACACCATGGGGAAG-3'，反向：5'-CCC-CTTCATTGACCTCAACTACA-3'。反應(yīng)條件為，98 ℃預(yù)變性30 s，1 輪循環(huán)。98 ℃15 s，65 ℃60 s，72 ℃90 s 40輪循環(huán)。內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)是GAPDH，每個(gè)樣品提供3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平算法為2-ΔΔCt方法。

1.9 免疫組織化學(xué)(IHC)染色 組織石蠟塊切片，厚4μm。將切片置于二甲苯中脫蠟，再于梯度酒精（100%，95%，85%和75%）中水化。采用EDTA修復(fù)液（pH=9）在高壓鍋修復(fù)5 min，常溫至徹底冷卻。之后使用內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑孵育10 min。滴加TMPRSS11B抗體（1∶250)，孵育一夜。次日采用酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG孵育20 min?，F(xiàn)配DAB，爾后滴加染色。在蘇木精中染色30 s，并在0.5%的鹽酸中分化，在碳酸鋰中反藍(lán)。在梯度酒精（75%，85%和95%）中脫水。在二甲苯中透明，用中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。IHC片由2名病理醫(yī)師單獨(dú)打分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色程度和染色面積對(duì)TMPRSS11B 蛋白的表達(dá)做半定量分析。先通過(guò)低倍鏡（×100）尋找OSCC細(xì)胞和（或）正?？谇击[狀上皮細(xì)胞，然后換成高倍鏡（×400)。打分者挑取10個(gè)視野，在每一視野下觀察100 個(gè)完整OSCC 細(xì)胞和/或正?？谇击[狀上皮細(xì)胞。無(wú)陽(yáng)性著色計(jì)0 分，著色強(qiáng)度呈淺黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，棕褐色計(jì)3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜10%判0 分；10%～40%判1分；＞40%～70%判2 分；≥70%判3 分。兩標(biāo)準(zhǔn)得分的乘積作為TMPRSS11B 最末分。評(píng)分＜3 分為低表達(dá)，≥3分為高表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，配對(duì)樣本采取配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 檢驗(yàn)法進(jìn)行生存分析，采用AUC 判評(píng)TMPRSS11B 的診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMPRSS11B在OSCC組織中mRNA水平

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出287例口腔癌標(biāo)本和31 例正?？谇粯?biāo)本。與正?？谇唤M織相比，TMPRSS11B 在OSCC 組織的mRNA 水平明顯下調(diào)（t=7.058，P＜0.05)，見圖1。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中OSCC 組織TMPRSS11B mRNA 水平下調(diào)

2.2 Kaplan-Meier 曲 線分析TMPRSS11B 在OSCC中的預(yù)后價(jià)值 生存分析結(jié)果顯示，TMPRSS11B轉(zhuǎn)錄水平與OSCC 預(yù)后相關(guān)，與TMPRSS11B 高表達(dá)組相比，低表達(dá)組患者總生存率較低(P＜0.05)，見圖2。

圖2 TMPRSS11B低表達(dá)組的OSCC患者預(yù)后不良

2.3 TMPRSS11B的mRNA水平對(duì)OSCC的診斷價(jià)值 基于287例OSCC組織與31例正?？谇唤M織的mRNA水平，檢測(cè)出TMPRSS11B mRNA的AUC為0.793（95%CI：0.697～0.889，P＜0.05），提示TMPRSS11B 可能作為OSCC 的診斷指標(biāo)（P＜0.05），見圖3。此外，TMPRSS11B的靈敏度為94.5%，特異度為59.4%，其最佳臨界值（AUC）為0.716。

圖3 OSCC中TMPRSS11B的轉(zhuǎn)錄水平的ROC曲線

2.4 TMPRSS11B 的互作基因及其GO 分析和KEGG 通路分析 TMPRSS11B 的相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)以TMPRSS11B為中心點(diǎn)，多個(gè)互作基因呈扇形展開，基因節(jié)點(diǎn)的大小與互作強(qiáng)度呈正比，TMPRSS11B的互作基因根據(jù)互作強(qiáng)度由強(qiáng)到弱順序分別為

TMPRSS11E、KIF9、TMPRSS11D、LHFPL1、KLK13、COX7B2、SERPINB13、LDHAL6B、RHOV、1-Dec、CRISP3、TAS2R7、USP26、PRSS27、HERC3、MYOCD、IFNB1、OR2L13、HS3ST2、SCEL，見圖4。

圖4 GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)TMPRSS11B 的基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

GO分析顯示，TMPRSS11B及其相互作用基因的生物過(guò)程主要涉及角化細(xì)胞分化、角質(zhì)化和多肽交聯(lián)等11個(gè)方面(P＜0.05)，細(xì)胞成分集中在胞外外泌體、角化包膜、細(xì)胞間黏附連接等15項(xiàng)(P＜0.05)，分子功能集中在結(jié)構(gòu)分子活性、鈣離子結(jié)合和鈣粘蛋白結(jié)合參與細(xì)胞—細(xì)胞黏附等8 項(xiàng)(P＜0.05)，見圖5。

圖5 TMPRSS11B互作基因的GO分析

KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，與TMPRSS11B 共表達(dá)基因密切相關(guān)的通路為代謝途徑、花生四烯酸代謝、PPAR信號(hào)通路、細(xì)胞色P45代謝、AMPK信號(hào)通路和軸突導(dǎo)向等，見圖6。

圖6 TMPRSS11B互作基因的KEGG通路分析

2.5 RT-qPCR法檢測(cè)TMPRSS11B在口腔癌細(xì)胞中的mRNA 水平 口腔癌細(xì)胞株（CAL27、SAS）中的TMPRSS11B 的mRNA 水平較正?？谇簧掀ぜ?xì)胞HOEC明顯降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 OSCC細(xì)胞中TMPRSS11B的mRNA水平降低

2.6 IHC染色法分析TMPRSS11B蛋白在OSCC中的表達(dá)情況 IHC 結(jié)果顯示，OSCC 組織中TMPRSS11B 蛋白的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性染色面積的乘積低于相應(yīng)的癌旁組織（P＜0.0001））（表1），IHC評(píng)分如圖8A 所示。TMPRSS11B 蛋白免疫組化染色主要見于細(xì)胞質(zhì)，在正?？谇簧掀じ鲗颖磉_(dá)明顯，多呈深黃或黃棕色著色，在基底層和棘層著色尤深。這與在OSCC 細(xì)胞中呈鮮明對(duì)比，后者著色率較之少，且多呈淡黃色或無(wú)著色(圖8B)。

圖8 TMPRSS11B蛋白在OSCC中的表達(dá)情況

表1 OSCC組織和癌旁組織中TMPRSS11B表達(dá)情況

表1 OSCC組織和癌旁組織中TMPRSS11B表達(dá)情況

2.7 TMPRSS11B蛋白表達(dá)與OSCC臨床病理特征的關(guān)系 基于IHC 染色評(píng)分，將OCSS 患者分為兩組，TMPRSS11B 高表達(dá)組和TMPRSS11B 低表達(dá)組。進(jìn)一步分析TMPRSS11B蛋白表達(dá)水平與臨床特點(diǎn)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，TMPRSS11B 蛋白表達(dá)與OSCC 腫瘤分級(jí)相關(guān)，且TMPRSS11B 蛋白表達(dá)越低，分化趨勢(shì)越差(P＜0.05) ；TMPRSS11B蛋白水平與OSCC 患者的年齡、性別、TMN 分期和腫瘤直徑無(wú)明顯關(guān)系(P＞0.05)，見表2。

表2 TMPRSS11B與OSCC患者臨床病理特征中的關(guān)系

3 討論

OSCC是一種侵襲性腫瘤，初期病灶小，通常無(wú)癥狀，65%的OSCC是在晚期確診的[15]。OSCC患者的5 年生存率約50%，因?yàn)榭谇恢辛馨凸茇S富且吻合較多等原因，25%～50%的患者在術(shù)后依然復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[16]。因此，OSCC 的早期診斷十分重要。此外，傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療等手段在治療的同時(shí)也給患者的機(jī)體功能和頜面部美觀帶來(lái)不可逆轉(zhuǎn)的損害，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，基因靶向治療的研究由此趨于熱門，尋找靶向治療基因也為OSCC 的治療開啟了新思路[17]。

口腔覆蓋的復(fù)層鱗狀上皮依賴于基底細(xì)胞增殖，在向外移動(dòng)到外表面的過(guò)程中，經(jīng)歷復(fù)雜的分化過(guò)程，產(chǎn)生棘層、顆粒層、角化層，最終脫落[18]。良好的分化是上皮屏障形成的關(guān)鍵，有研究表明，TTSPs 在人類鱗狀上皮中過(guò)表達(dá)，并在上皮屏障形成中誘導(dǎo)細(xì)胞分化[19]。Miller等[11]的組織陣列分析顯示，TMPRSS11B 在鱗狀上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中丟失，提示TMPRSS11B 的可能通過(guò)參與分化過(guò)程調(diào)控癌癥。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在OSCC 細(xì)胞中TMPRSS11B 的mRNA 水平較正?？谇患?xì)胞下調(diào)。TMPRSS11B 蛋白在OSCC 組織中低表達(dá)，在正常口腔上皮層尤其是基底層和棘層高表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TMPRSS11B 蛋白表達(dá)與腫瘤分級(jí)相關(guān)。在低分化的OSCC 組織中，免疫陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色程度較低，提示TMPRSS11B 的丟失可能與口腔鱗狀上皮在癌變過(guò)程中脫分化有關(guān)。

TMPRSS11B 的相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)顯示，SERPINB13、USP26 等為TMPRSS11B 的互作基因。已有研究表明，這些TMPRSS11B 互作基因與多種癌癥的分化和腫瘤形成相關(guān)[20-21]。GO 富集分析示，TMPRSS11B 及其互作基因富集在角化細(xì)胞分化，角化作用、上皮細(xì)胞分化等生物過(guò)程，和胞外外泌體、角質(zhì)化胞膜等細(xì)胞組分上，從而有可能因表達(dá)失調(diào)影響細(xì)胞分化和上皮屏障形成。KEGG通路富集結(jié)果示，TMPRSS11B 及其互作基因在OSCC 可能通過(guò)代謝途徑、花生四烯酸代謝和PPAR 信號(hào)通路等分子機(jī)制，作用于癌癥的臨床表現(xiàn)和預(yù)后。Updegraff 等[12]曾指出，TMPRSS11B 在肺癌中促進(jìn)乳酸輸出和糖酵解代謝。TMPRSS11B在人肺鱗狀細(xì)胞癌(human lung squamous cell carcinomas,LSCCs)中上調(diào)，并促進(jìn)肺癌的發(fā)生。這與其在鱗狀細(xì)胞癌中已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的表達(dá)下調(diào)和的抑癌作用相反[11]，也與本研究結(jié)果相反，可能是TMPRSS11B 在不同的癌種起著不同的作用。

早期診斷是OSCC有效治療的關(guān)鍵。在本研究中，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TMPRSS11B的表達(dá)與OSCC的預(yù)后和診斷有關(guān)。但由于本研究進(jìn)行的試驗(yàn)較少，有一定的局限性，需要更大樣本量的臨床數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證才能得出可靠的結(jié)論。此外，TMPRSS11B 調(diào)控OSCC 發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚未被揭示。對(duì)TMPRSS11B的進(jìn)一步研究有助于確定其作為OSCC 惡性腫瘤評(píng)估的分子標(biāo)志物的作用。TMPRSS11B 靶基因的研究可能為OSCC 的治療開辟新的途徑。