金壬順，張貞洪，靳 鑫，侯少輝，李井春 ，郭 慶

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

1 前言

近年來，世界范圍內(nèi)環(huán)境污染問題仍備受關(guān)注，其中較為常見的空氣污染物苯并芘（Benzo（a）pyrene，BaP），對人和動物具有致癌性，同時對生殖健康也具有嚴(yán)重的影響[1-2]。在生殖上研究表明，BaP可以通過產(chǎn)生過量活性氧（Reactive oxyeng，ROS）降低卵母細胞減數(shù)分裂能力[3]。因此，長時間的霧霾天氣對人和動物生殖造成的嚴(yán)重影響不可忽視，明確BaP對卵母細胞損傷的潛在機制，將為解決這一問題提供理論參考依據(jù)。

對BaP在生殖上影響的研究越來越多，高濃度BaP對雄性和雌性小鼠的性腺都具有嚴(yán)重的影響。雄性小鼠體內(nèi)實驗研究表明，長時間且高濃度的BaP環(huán)境下的雄性小鼠雄激素含量顯著下降，并引起生殖細胞損傷[4]。同時，體外實驗研究也表明BaP會增加睪丸支持細胞凋亡率[5]。而BaP對雌性動物的損傷上主要表現(xiàn)為降低卵巢功能，引起早期卵巢衰竭[6]、抑制卵泡生長、使卵泡閉鎖[7]、排卵失敗和抑制孕酮分泌等降低妊娠率[8]。在妊娠期間BaP通過破壞雌激素和孕激素的分泌引起小鼠胚胎附植的失敗[9]。在對卵母細胞的影響上，BaP主要通過損傷DNA、破壞紡錘體形態(tài)和功能等抑制卵母細胞成熟[2]。此外，研究表明，BaP可以通過破壞Sonic hedgehog（SHH）信號通路相關(guān)基因和蛋白的表達破壞骨骼肌細胞的生長[10]。同時，SHH信號通路活性對卵母細胞成熟至關(guān)重要[11-13]。SHH信號通路主要功能是調(diào)控細胞生長、增殖和分化[14]。研究報道表明，SHH信號通路關(guān)鍵組成部分（SHH配體、PTCH1受體、SMO受體、GLI1轉(zhuǎn)錄因子）在豬卵母細胞中有其mRNA和蛋白的表達[11-12]。而且，在豬卵母細胞IVM和胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)液中添加SHH重組（rSHH）蛋白可顯著促進體外授精（IVF）胚胎的發(fā)育能力[13]。

因此，基于骨骼肌細胞中研究表明BaP對SHH信號通路的破壞作用，同時，在豬卵母細胞IVM過程中SHH信號通路起到至關(guān)重要的作用。因此，本研究檢測BaP在豬卵母細胞IVM過程中對SHH信號通路的影響，從而初步判斷BaP損傷卵母細胞的潛在機制。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本實驗應(yīng)用的豬卵巢取自大慶市屠宰場。分離屠宰后的母豬卵巢放置于含有預(yù)熱的生理鹽水的保溫瓶中，在2 h內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇摇?/p>

2.2 實驗方法

2.2.1 豬卵母細胞采集及IVM培養(yǎng)

將使用保溫瓶運輸?shù)綄嶒炇业穆殉灿妙A(yù)熱的生理鹽水清洗3遍，并清除多余的組織，使用搭配18號針頭的注射器抽取直徑為2～6 mm卵泡中的卵母細胞。選取胞質(zhì)致密均勻，且含有3層以上卵丘細胞的卵丘細胞-卵母細胞復(fù)合體（COCs），用含有Hepes（4-羥乙基哌嗪乙磺酸生物緩沖液）的卵母細胞洗液洗滌3遍后放置于含有10%pFF（豬卵泡液）、10 IU/mL hCG（絨毛膜促性腺激素）、10 IU/mL PMSG（孕馬血清促性腺激素）的NCSU-37培養(yǎng)液中，并在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。

2.2.2 檢測卵母細胞減數(shù)分裂進程

利用透明質(zhì)酸酶脫去成熟時期COCs上的卵丘細胞，置于含有蔗糖的胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)液中，顯微鏡下挑出含有第一極體的成熟卵母細胞，并計算IVM效率。

2.2.3 qPCR

收集豬卵母細胞，利用Dynabeads mRNA DIRECTTM試劑盒提取其總RNA，并使用SuperScript?III First-Strand合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Agilent Mx3005P系統(tǒng)對合成的cDNA進行實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果使用經(jīng)典的2-△△Ct法統(tǒng)計分析。

2.2.4 免疫熒光染色

分別收集對照組和BaP處理組MII期豬卵母細胞，并按如下步驟進行，在含有1%PVA的PBS（PBSPVA）溶液中洗滌3～5次，4%多聚甲醛中固定1 h，PBS-PVA中洗滌3～5次，1%Triton X-100的96孔板中通透30 min，2%BSA的PBS中封閉1 h，4℃且避光的條件下與一抗共孵育過夜，與二抗共同避光的條件下孵育1 h，PBS-PVA中洗滌3次，Hoechst33342染色細胞核，顯微鏡下照相。

2.3 實驗設(shè)計

2.3.1 不同濃度BaP處理對豬卵母細胞IVM能力的影響

收集豬卵母細胞進行IVM培養(yǎng)，并分別在IVM培養(yǎng)液中添加不同濃度BaP（0 μM BaP、100 μM BaP、200 μM BaP）處理42 h。使用透明質(zhì)酸酶去除卵丘細胞后挑選出含有第一極體的成熟卵母細胞，并計算IVM效率。

2.3.2 BaP處理對豬卵母細胞SHH信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達量的影響

為了進一步驗證BaP破壞豬卵母細胞IVM能力的因素，在實驗一的基礎(chǔ)上，收集對照組和抑制卵母細胞成熟的低濃度BaP處理組卵母細胞。使用qPCR技術(shù)檢測SHH信號通路關(guān)鍵基因（SHH、PTCH1、SMO、GLI1）mRNA表達量。

2.3.3 BaP處理對豬卵母細胞SHH信號通路關(guān)鍵蛋白表達量的影響

為了進一步確認BaP處理對豬卵母細胞IVM影響的因素，分別收集對照組和抑制卵母細胞成熟的低濃度BaP處理組卵母細胞，使用免疫熒光染色技術(shù)檢測SHH信號通路起始蛋白（SHH）和作用蛋白（GLI1）表達情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度BaP處理對豬卵母細胞IVM能力的影響

實驗結(jié)果顯示，相比于對照組，各BaP濃度處理組卵母細胞IVM效率均顯著降低（76.5% vs 68.1%、50.6%、38.2%，P＜0.05，表1）。

表1 不同濃度BaP處理對豬卵母細胞IVM能力的影響

3.2 BaP處理對豬卵母細胞SHH信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達量的影響

實驗一結(jié)果顯示50 μM的BaP處理可以顯著地降低豬卵母細胞IVM能力，因此本實驗分別收集對照組和50 μM BaP處理組的卵母細胞，通過qPCR分析SHH信號通路關(guān)鍵基因的表達。結(jié)果顯示，相比于對照組，BaP處理組中SHH、PTCH1、SMO、GLI1基因mRNA表達量均顯著下降（P＜0.05，圖1）。

圖1 BaP處理對豬卵母細胞SHH信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達的影響

3.3 BaP處理對豬卵母細胞SHH信號通路關(guān)鍵蛋白表達量的影響

為進一步檢測BaP對豬卵母細胞SHH信號通路的影響，收集對照組和50 μM BaP處理組成熟卵母細胞進行免疫熒光染色，檢測SHH信號通路起始蛋白（SHH）和作用蛋白（GLI1）表達情況。結(jié)果顯示，相比于對照組，BaP處理組中GLI1和SHH蛋白表達量均顯著降低（P＜0.05，圖2）。

圖2 BaP處理對豬卵母細胞SHH信號通路關(guān)鍵蛋白表達量的影響

4 討論與結(jié)論

BaP是空氣污染的主要來源之一，BaP對多種細胞具有致癌性，其機制主要是和細胞內(nèi) DNA形成共價加合物[15]。而在對卵母細胞的研究上，BaP會導(dǎo)致卵母細胞內(nèi)ROS含量增加、破壞線粒體功能從而降低卵母細胞IVM 效率和成熟質(zhì)量及后期胚胎發(fā)育能力，但具體機制尚不清楚。在骨骼肌細胞的研究中進一步發(fā)現(xiàn)，BaP 通過抑制SHH信號通路破壞細胞的生長，因此本研究主要探討B(tài)aP破壞豬卵母細胞IVM的潛在機制是否通過破壞SHH信號通路實現(xiàn)的。

本研究在豬卵母細胞IVM培養(yǎng)液中添加不同濃度BaP檢測其對IVM能力的影響。結(jié)果顯示，相比于對照組，各BaP處理組卵母細胞IVM效率均顯著的低于對照組，并隨著BaP濃度的增加IVM效率進一步下降, 這與之前研究報道BaP對卵母細胞的損傷相一致[2]。此外，為了進一步檢測BaP破壞豬卵母細胞IVM效率的機制，本研究檢測出50 μM BaP處理后豬卵母細胞SHH信號通路相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達量均顯著地低于對照組。這與BaP可以通過破壞SHH信號通路降低骨骼肌細胞生長相似[10]。因此，本研究初步證明了空氣污染物BaP可能通過破壞SHH信號通路降低豬卵母細胞IVM。為進一步理解 BaP 損傷卵母細胞提供理論基礎(chǔ)，為尋找降低BaP對動物和人類生殖損傷方法提供理論依據(jù)。