陸洪省，吳玉斌，張 瑤

(山東科技大學(xué)安全與環(huán)境工程學(xué)院，山東 青島 266590)

傳統(tǒng)的雙室微生物燃料電池（Microbial fuel cell，即MFC）是由陽(yáng)極室與陰極室組成，中間由質(zhì)子交換膜隔開(kāi)[1]，由于使用質(zhì)子交換膜導(dǎo)致成本昂貴，通常膜（如使用Nafion117膜）的成本占全部費(fèi)用的50%[2]以上，所以，本研究是以鹽橋?yàn)橘|(zhì)子交換通道，節(jié)省了大量成本。

產(chǎn)電細(xì)菌的種類很多，包括變形桿菌Proteobacteria、厚壁菌Firmicutes、土桿菌Geobacteraceae、擬桿菌Bacteriodetes及放線菌Actinobacteria[3]等。在多種細(xì)菌存在的條件下，研究MFC電子傳遞非常復(fù)雜，因此，考察單一產(chǎn)電細(xì)菌的電子傳遞機(jī)理，就成為提高M(jìn)FC產(chǎn)電性能的重要途徑之一。

目前，全世界平均每年排放約500萬(wàn)t鉛，其中大部分會(huì)進(jìn)入土壤[4]。在我國(guó)320個(gè)重金屬重點(diǎn)污染區(qū)中，鉛是最嚴(yán)重的污染元素之一[5]?，F(xiàn)階段，對(duì)于重金屬鉛污染的土壤進(jìn)行治理的方法有物理化學(xué)法和生物修復(fù)法，其中，物理化學(xué)法對(duì)土壤攪動(dòng)大，費(fèi)用高，而生物修復(fù)法見(jiàn)效慢，且極易受土壤理化性質(zhì)以及氣候環(huán)境條件的影響，所以，利用微生物燃料電池（MFC）方法富集或去除土壤中重金屬鉛的報(bào)道非常少！

本研究首先從活性污泥中分離產(chǎn)電細(xì)菌，將此單一產(chǎn)電細(xì)菌在陽(yáng)極室中培養(yǎng)，而陰極室中填充土壤，利用土壤雙室MFCs裝置進(jìn)行研究以下研究：在土壤中添加葡萄糖對(duì)MFC產(chǎn)電性能的影響；陰極室土壤中Pb2+在MFC條件下的遷移規(guī)律；產(chǎn)電細(xì)菌的生理生化性質(zhì)以及分類學(xué)位置，以此為利用土壤MFCs富集土壤中的重金屬同時(shí)產(chǎn)生電能提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 MFC實(shí)驗(yàn)裝置

采用雙室MFC，實(shí)驗(yàn)裝置如（圖1）所示。中間為陽(yáng)極室，兩邊為兩個(gè)陰極室，陰極室暫命名為1號(hào)和2號(hào)陰極室。陽(yáng)極室尺寸30 cm×30 cm×20 cm（長(zhǎng)×寬×高），兩個(gè)陰極室尺寸相同，均為20×20×15 cm（長(zhǎng)×寬×高）。陽(yáng)極石墨板尺寸為10 cm×10 cm×0.5 cm（長(zhǎng)×寬×厚），面積為100 cm2；陰極石墨板的尺寸均為5.0 cm×4.5 cm×0.4 cm（長(zhǎng)×寬×厚），板面面積為22.5 cm2，陽(yáng)極室與陰極室（1號(hào)和2號(hào)）分別用鹽橋連接。分別在1號(hào)和2號(hào)陰極室中填充土壤，土壤取自山東科技大學(xué)校園內(nèi)，土壤取來(lái)后應(yīng)先進(jìn)行風(fēng)干、研碎和過(guò)篩（目）。

圖1 微生物燃料電池裝置示意圖

鹽橋制作過(guò)程：準(zhǔn)確稱取4 g瓊脂加入到盛有200 ml蒸餾水的燒杯中，加熱使瓊脂完全溶解。再稱量60 g KCl加入到燒杯中，繼續(xù)加熱，使KCl完全溶解，趁熱將混合液注入到U型塑料管中，塑料管兩口朝上，直至溶液溢出管口[6]。

1.2 產(chǎn)電細(xì)菌的分離與純化

在陽(yáng)極室中添加乙酸鈉液體培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)產(chǎn)電細(xì)菌。培養(yǎng)基組成（g·L-1）為：乙酸鈉為0.8，NH4Cl為0.31，KCl為0.13，Na2HPO4·12H2O為3.75，NaH2PO4·H2O為4.9，1 000 mL去離子水，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.2，其中，在配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入20 g瓊脂，配制半固體培養(yǎng)基時(shí)加入4 g瓊脂，液體和固體培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min后使用。

產(chǎn)電細(xì)菌分離于活性污泥的方法：將10 mL活性污泥加入到盛有190 mL的乙酸鈉液體培養(yǎng)基的三角瓶中，恒溫振蕩（130 r/min，30 ℃）培養(yǎng)4 d，取15 μL培養(yǎng)液劃線培養(yǎng)到乙酸鈉固體培養(yǎng)基上，30 ℃靜置培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，挑選單菌落，并多次重復(fù)劃線，直至菌落形態(tài)等一致，將分離純化的菌株保存在半固體培養(yǎng)基中，待用。

1.3 MFC的運(yùn)行及產(chǎn)電性能的計(jì)算

將分離純化到的菌株接種到陽(yáng)極室中的乙酸鈉液體培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基的組成同1.2），在30 ℃條件下培養(yǎng)8 d，細(xì)菌掛膜完成。然后利用鹽橋?qū)㈥?yáng)極室分別與兩陰極室相連，最后連接數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，此時(shí)，MFCs開(kāi)始運(yùn)行。在陽(yáng)極室中利用厭氧袋創(chuàng)造厭氧環(huán)境，陰極室中土壤定期進(jìn)行補(bǔ)濕，將MFCs置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中；電池性能數(shù)據(jù)用RDAM-4017模塊進(jìn)行采集，電壓電流分析軟件用數(shù)控6.1，其中輸出電壓（U）每10 S采集一次數(shù)據(jù)；外接5位可變直流電阻箱（型號(hào)：TAS986）。其中，電流通過(guò)公式I=U/R計(jì)算得出，式中I 為電流，U為輸出電壓，R 為外回路電阻，內(nèi)阻、電壓-電流密度（V-J）以及功率-電流密度（P-J）測(cè)定均參照文獻(xiàn)[7]中進(jìn)行，陰極石墨板面積用來(lái)計(jì)算電流密度。

1.4 陰極室土壤中Pb2+濃度測(cè)定

在MFCs運(yùn)行結(jié)束后，分別取距離陰極石墨板等距離處的土壤，如（圖2）所示，即1號(hào)陰極室1和4（0cm處），2和5（5 cm處），3和6（10 cm處）位置的土壤，2號(hào)陰極室7和10（0cm處），8和11（5 cm處），9和12（10 cm處）的土壤各50 g，分別溶入200 mL去離子水中，充分?jǐn)嚢?、靜置，測(cè)定上清液中Pb2+的濃度，以平均值作為最終土壤中Pb2+濃度。Pb2+濃度測(cè)定采用原子吸收分光光度計(jì)（型號(hào)：TAS986）法，具體測(cè)定方法應(yīng)按照原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定步驟進(jìn)行。

圖2 陰極室土壤的采集（導(dǎo)線處即為陰極電極板所在處）

1.5 產(chǎn)電細(xì)菌生理生化性質(zhì)的分析及DNA的提取、測(cè)序、系統(tǒng)分類學(xué)位置的確定

產(chǎn)電細(xì)菌生理生化性質(zhì)測(cè)定按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法進(jìn)行。該方法是利用柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒（UNIQ-10）對(duì)產(chǎn)電細(xì)菌DNA進(jìn)行提取，提取方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增用引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物，由上海生物工程公司對(duì)菌株16S rDNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的16S rDNA序列通過(guò)DDBJ（DNA Data Bank of Japan）數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast進(jìn)行相似性比對(duì)，再利用CustalX2.0和Mega5（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟件創(chuàng)建系統(tǒng)樹，創(chuàng)建方法為鄰接法（Neighbor-Joining）。

2 結(jié)果

2.1 MFC輸出電流密度和電壓的分布

當(dāng)MFC運(yùn)行0～10 d，在土壤中添加葡萄糖跟未添加葡糖糖的兩種條件下，電壓升高幅度很慢，且兩種處理?xiàng)l件下電壓值均低于10 mV，但運(yùn)行10 d后，土壤在兩種處理?xiàng)l件下MFC產(chǎn)生的電壓均在迅速增大，且土壤中添加葡萄糖的MFC產(chǎn)生的電壓明顯要高于未添加葡萄糖土壤的MFC產(chǎn)生的電壓，在MFCs運(yùn)行15 d之后，兩種處理?xiàng)l件下的電壓值變化幅度變小，此時(shí)土壤中添加葡萄糖的MFC產(chǎn)生的電壓遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于土壤中未添加葡萄糖的MFC產(chǎn)生的電壓，如圖3所示。

圖3 土壤在兩種處理?xiàng)l件下MFCs的輸出電壓曲線

為了表征土壤在兩種處理?xiàng)l件下MFC的電化學(xué)性能，本研究采用電流密度（Current density）-電壓（Voltage）進(jìn)行說(shuō)明，如（圖4）所示。外加電阻變化范圍為200～900 000 Ω，從（圖4）中可以看出，當(dāng)外電阻在5 000～900 000 Ω變化時(shí)，土壤中添加葡萄糖電池的電壓（1號(hào)陰極室）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于土壤中未添加葡萄糖電池的電壓（2號(hào)陰極室），且1號(hào)陰極室最大電壓是65.5 mV，2號(hào)陰極室最大電壓是24.8 mV；而當(dāng)外電阻在200～5 000 Ω之間變化時(shí)，兩者（1號(hào)陰極室和2號(hào)陰極室）所產(chǎn)生的電壓非常接近。

圖4 電流密度和電壓關(guān)系

從電流密度-功率密度曲線（圖5）中可以看出，外電阻在200～900 000 Ω之間變化時(shí)，土壤中添加葡萄糖（1號(hào)陰極室）以及未添加葡萄糖（2號(hào)陰極室）的兩組MFC，其產(chǎn)生的功率密度非常接近，當(dāng)外電阻為1 300 Ω時(shí)，土壤中添加葡萄糖的MFC產(chǎn)生的最大功率密度為91.95 W·m-2，當(dāng)外電阻為1 400 Ω時(shí)，土壤中未添加葡萄糖的MFC產(chǎn)生的最大功率密度為87.5 W·m-2。

圖5 陰極室中土壤的不同處理對(duì)MFCs功率密度的影響

2.2 不同取樣點(diǎn)土壤中Pb2+的濃度測(cè)定結(jié)果

向陰極室土壤中分別噴灑濃度為16.74 g/L的硝酸鉛溶液900 mL，攪拌均勻后，測(cè)得Pb2+初始濃度為3.125 g/kg。當(dāng)MFCs運(yùn)行結(jié)束后，分別取距離石墨板0 cm、5 cm和10 cm處的土壤50 g，用200 ml去離子水浸泡12 h，在浸泡過(guò)程中不斷攪拌，使土壤中Pb2+溶出到去離子水中，靜置5 h，取上清液，利用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定浸出液中Pb2+的濃度，其測(cè)定過(guò)程按照原子吸收分光光度計(jì)說(shuō)明書操作，在得到Pb2+測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同位置土壤中Pb2+濃度，其結(jié)果如（表1）所示。從（表1）中可以看出，在土壤中添加葡萄糖（1號(hào)陰極室）和未添加葡萄糖（2號(hào)陰極室）的MFCs中，距離電極板越近，土壤中Pb2+濃度越大。通過(guò)比較1號(hào)和2號(hào)陰極室土壤中Pb2+濃度發(fā)現(xiàn)，在距離電極板0 cm處，1號(hào)陰極室土壤中的Pb2+濃度（5.347 g/kg）遠(yuǎn)高于2號(hào)陰極室土壤中Pb2+濃度（4.725 g/ kg），相反，在距離陰極石墨板5 cm和10 cm處土壤中，1號(hào)陰極室土壤中Pb2+濃度明顯低于2號(hào)陰極室土壤中的Pb2+濃度。

表1 距離陰極板不同距離土壤中Pb2+的濃度

2.3 產(chǎn)電細(xì)菌CD-3生理生化性質(zhì)及分類學(xué)位置的分析

2.3.1 菌株CD-3的生理生化性質(zhì)

按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中操作步驟，對(duì)菌株CD-3的生理生化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。菌株CD-3為革蘭氏陰性細(xì)菌，短桿狀，氧化酶、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)為陽(yáng)性，其能利用葡萄糖為碳源，但不能利用阿拉伯糖為碳源。

2.3.2 菌株CD-3的系統(tǒng)分類學(xué)位置

對(duì)菌株CD-3的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增序列提交到DDBJ獲得收錄號(hào)LC012001。用CustalX2.1和Mega5軟件對(duì)菌株CD-3的16S rDNA序列以及同源性較高菌株的16S rDNA序列創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹創(chuàng)建，如圖6所示。從圖6可以看出，菌株CD-3的16S rDNA序列與菌株Ochrobactrum ciceri（DQ647056）的同源性最高，達(dá)98%。因此，菌株CD-3應(yīng)屬于蒼白桿菌屬，并命名為Ochrobactrum sp.CD-3（LC012001）。

圖6 緊鄰法構(gòu)建的基于Ochrobactrum sp.CD-3及相關(guān)菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

在土壤中添加葡萄糖跟未添加葡萄糖的兩種處理?xiàng)l件下，最大功率密度分別為91.95 mW·m-2和87.5 mW·m-2，對(duì)Pb2+遷移的影響前者明顯優(yōu)于后者，且在靠近電極板的位置，添加葡萄糖土壤中的Pb2+濃度遠(yuǎn)高于未添加葡萄糖土壤中的Pb2+濃度，在遠(yuǎn)離電極板土壤中Pb2+濃度正好相反，添加葡萄糖土壤中Pb2+濃度遠(yuǎn)低于未添加葡萄糖土壤中Pb2+濃度。利用最大功率密度求出的MFCs內(nèi)阻來(lái)看，土壤中添加葡萄糖的MFC的內(nèi)阻為1 300 Ω，未添加葡萄糖MFC的內(nèi)阻為1 400 Ω。此根據(jù)來(lái)源于Quan et al.（2013）[8]，An et al.（2013）[9]和Ball（2007）[10]。

本研究中分離到的產(chǎn)電細(xì)菌Ochrobactrum sp.CD-3為革蘭氏陰性，能夠利用乙酸鈉、葡萄糖等為碳源，這與產(chǎn)電細(xì)菌Ochrobactrum anthropi相似。