吳 積，靳 楨，謝 浩，王彬彬，覃 健，劉 軍

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院骨科，南京 211100

2.南京醫(yī)科大學(xué)研究生院，南京 211166

3.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，南京 211100

硬膜外瘢痕形成是椎板切除術(shù)的常見(jiàn)并發(fā)癥，易引起術(shù)后復(fù)發(fā)性疼痛，如何預(yù)防或減少椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成是目前骨科研究的熱點(diǎn)之一［1-2］。NLRC5是高度保守的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（NLR）家族成員之一，有研究［3-6］表明其參與肝纖維化、皮膚纖維化等的發(fā)展過(guò)程，可能是治療瘢痕形成的一個(gè)理想靶點(diǎn)。本研究初步探討NLRC5在大鼠硬膜外瘢痕形成的表達(dá)與作用，為預(yù)防或減少椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只雄性SD大鼠（3月齡，體質(zhì)量約400 g）購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在無(wú)特定病原體（SPF）環(huán)境中。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，控制溫度（22±2）℃、光照（早上7點(diǎn)至晚上7點(diǎn)）及相對(duì)濕度為（50±5）%。所有實(shí)驗(yàn)程序均在南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用機(jī)構(gòu)委員會(huì)（IACUC）的批準(zhǔn)和監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2 動(dòng)物模型制備

實(shí)驗(yàn)大鼠正常飲水進(jìn)食，隨機(jī)分為手術(shù)組（n=30）和假手術(shù)組（n=30），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照每400 g體質(zhì)量注射1.0 mL 2%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，俯臥位固定。在L1棘突水平做后正中切口，剝離兩側(cè)豎脊肌，顯露L1~3椎板。手術(shù)組切除L1~2全椎板，暴露硬膜，徹底止血；假手術(shù)組不做任何特殊處理。之后將切口層層縫合。術(shù)后大鼠單獨(dú)分籠飼養(yǎng)，允許正?；顒?dòng)。

1.3 硬膜外瘢痕纖維化評(píng)估

術(shù)后4周，每組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行肉眼觀察。重新開放手術(shù)切口，根據(jù)Rydell標(biāo)準(zhǔn)［7］評(píng)估硬膜外瘢痕纖維化程度：0級(jí)，瘢痕組織少，不粘連硬膜；1級(jí)，瘢痕組織輕度粘連硬膜；2級(jí)，瘢痕組織緊密粘連硬膜，難以分離；3級(jí)，瘢痕組織牢固粘連硬膜，不能解剖。

1.4 Masson染色

術(shù)后4周，每組隨機(jī)選取6只大鼠，處死后取硬膜外組織標(biāo)本，將標(biāo)本于10%中性甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后作Masson染色，置于光鏡下觀察硬膜外組織病理學(xué)變化。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平

術(shù)后4周，每組隨機(jī)選取6只大鼠，處死后取硬膜外組織標(biāo)本，采用TRIzol試劑（賽默飛世爾科技公司，中國(guó)）提取組織總RNA，取2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（愛(ài)必夢(mèng)生物科技有限公司，中國(guó)）說(shuō)明進(jìn)行操作。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。引物序列：β-actin上游引物5′-CCCATCTGAGGGTTACGC-3′，下游 引 物5′-TTTAATGTCACGACGATTTC-3′；NLRC5上游引物5'-CGCTCTGTGGCCACTTTCAG-3′，下游引 物5′-TGCCCGCTGTGAGACTTCAT-3′；α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）上游引物5′-GAGCGTGGCTATT CCTTCGTG-3′，下游引物5′-CAGTGGCCATCTCATTT TCAAAGT-3′；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）上游引物5′-GGCAGGGCCAACCACTGTGC-3′，下游引物5′-CA GTGCACTTGCCTGGATGG-3′；Ⅰ型膠原（COLⅠ）上游引物5′-TACAGCACGCTTGTGGAGATG-3′，下游引物5′-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3′。PCR引 物 由 南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析NLRC5、α-SMA、CTGF、COLⅠ的mRNA表達(dá)量。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

術(shù)后4周，每組隨機(jī)選取6只大鼠，處死后取硬膜外組織標(biāo)本，用RIPA裂解緩沖液提取硬膜外組織總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，計(jì)算上樣量，配制分離膠與濃縮膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，經(jīng)PBS洗滌后加入β-actin抗體（8H10D10，CST，美國(guó)）、NLRC5抗體（sc-515668，Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)）、α-SMA抗體（ab32575，Abcam，英國(guó)）和CTGF抗體（ab6992，Abcam，美國(guó)），工作濃度均為1∶1 000，于4℃孵育過(guò)夜。取出后用TBST洗滌，加入相應(yīng)二抗（工作濃度1∶10 000），搖床孵育1 h，TBST洗滌。用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光并拍照保存，采用Image J軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參照計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 ELISA檢測(cè)COLⅠ含量

術(shù)后4周，每組隨機(jī)選取6只大鼠，處死后取硬膜外組織標(biāo)本，勻漿后取上清液，嚴(yán)格按照COLⅠ ELISA試劑盒（北京龍?zhí)炜萍加邢薰?，中?guó)）使用說(shuō)明書檢測(cè)上清液中COLⅠ含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠模型建立和大體觀評(píng)價(jià)

動(dòng)物模型建立4周后，假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)瘢痕組織，Rydell瘢痕纖維化評(píng)估均為0級(jí)；手術(shù)組硬膜外瘢痕組織增生，Rydell瘢痕纖維化評(píng)估1級(jí)2只、2級(jí)4只（圖1）。

圖1 大鼠腰椎椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕Fig. 1 Epidural scar formation after lumbar laminectomy in rats

2.2 大鼠硬膜外組織Masson染色

Masson染色顯示，假手術(shù)組大鼠硬膜外組織結(jié)構(gòu)完整，界限清晰，無(wú)異常纖維增生；手術(shù)組大鼠硬膜外組織結(jié)構(gòu)破壞，可見(jiàn)大量纖維細(xì)胞（圖2）。

圖2 2組大鼠硬膜外組織Masson染色（×400）Fig. 2 Masson staining of epidural tissues in 2 groups of rats（×400）

2.3 NLRC5在大鼠硬膜外組織中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，手術(shù)組大鼠硬膜外組織NLRC5、CTGF、α-SMA和COLⅠ的mRNA表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，手術(shù)組大鼠硬膜外組織NLRC5、CTGF、α-SMA的蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，手術(shù)組大鼠硬膜外組織中COLⅠ含量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)2組大鼠硬膜外組織中 NLRC5、CTGF、α-SMA 和 COLⅠ的mRNA的表達(dá)Fig. 3 Expressions of NLRC5，CTGF，α-SMA and COLⅠ mRNA of epidural tissues in 2 groups of rats detected by real-time quantitative PCR

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)2組大鼠硬膜外組織中 NLRC5、CTGF、α-SMA的蛋白表達(dá)Fig. 4 Expressions of NLRC5，CTGF and α-SMA protein of epidural tissues in 2 groups of rats detected by Western blotting

圖5 ELISA法檢測(cè)2組大鼠硬膜外組織中COLⅠ的含量Fig. 5 Content of COLⅠ of epidural tissues in 2 groups of rats detected by ELISA

3 討 論

椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成具體的發(fā)生機(jī)制尚不明確，與血腫形成、炎性細(xì)胞因子積累、成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成等多種因素加速手術(shù)創(chuàng)傷后硬膜外手術(shù)區(qū)纖維粘連的形成有關(guān)。椎板切除術(shù)后，硬膜外組織在各種免疫細(xì)胞因子刺激下，成纖維細(xì)胞趨向于廣泛增殖，產(chǎn)生膠原，釋放細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致硬膜外瘢痕粘連的形成［8-9］。除了通過(guò)改進(jìn)術(shù)式減少損傷外，目前應(yīng)用于術(shù)后瘢痕防治的方法主要包括藥物防治和人工材料防治，例如五味子提取物［1］、絲裂霉素C［10-11］、新型防粘膜E8004［12］、生物蛋白膠［13］等。多數(shù)藥物作用時(shí)間較短，長(zhǎng)期使用副作用大，而人工材料在體內(nèi)作為異物遠(yuǎn)期療效欠佳，都有一定的局限性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者仍在探索更好的高分子材料及藥物來(lái)防治硬膜外瘢痕形成［14］。目前，抑制參與膠原蛋白過(guò)度合成和細(xì)胞增殖因素是治療硬膜外瘢痕粘連的一種策略。

近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)NLRC5可能是治療瘢痕的新靶點(diǎn)，沉默NLRC5可通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路減少細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度表達(dá)，抑制瘢痕形成的表型和標(biāo)志物 CTGF、α-SMA和COLⅠ的表達(dá)［6］。NLR是一組細(xì)胞內(nèi)蛋白，介導(dǎo)對(duì)病原體相關(guān)分子模式或其他胞質(zhì)危險(xiǎn)信號(hào)的識(shí)別［15-17］。NLRC5是高度保守的NLR家族成員之一，主要在骨髓和淋巴譜系細(xì)胞中表達(dá)，能夠有效抑制機(jī)體的天然免疫和炎性反應(yīng)［18］。有研究［19］發(fā)現(xiàn)，NLRC5在人纖維化肝臟組織及CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化組織中表達(dá)量均升高，而抑制NLRC5的表達(dá)可明顯抑制肝星狀細(xì)胞的活化增殖，提示NLRC5可能與肝纖維化形成有關(guān)。

目前NLRC5在硬膜外瘢痕組織的表達(dá)及作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明，大鼠椎板切除術(shù)后4周發(fā)生了明顯的硬膜外瘢痕形成，且手術(shù)組NLRC5、CTGF、α-SMA和COLⅠ的mRNA表達(dá)較假手術(shù)組增高，NLRC5、CTGF和α-SMA的蛋白表達(dá)和COLⅠ含量也較假手術(shù)組增高，提示NLRC5可能參與椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕形成的過(guò)程，但具體的分子機(jī)制仍有待于后期研究進(jìn)一步闡明。本研究為研究預(yù)防硬膜外瘢痕形成的治療靶點(diǎn)提供了新的思路。