劉新　宋春艷　牟嘉欣　劉愷迪　王桂清

摘要：為開(kāi)發(fā)枝頂孢生防制劑，以黑麥草為靶標(biāo)植物，采用比色法分析菌核生枝頂孢次生代謝物對(duì)黑麥草保護(hù)酶活性的影響。結(jié)果表明，代謝物對(duì)黑麥草體內(nèi)可溶性蛋白含量和PAL酶、SOD酶活力主要表現(xiàn)為抑制作用，對(duì)EST酶活力表現(xiàn)為促進(jìn)作用;對(duì)PPO酶活力則表現(xiàn)為前期促進(jìn)后期（5～12 d）抑制。

關(guān)鍵詞：菌核生枝頂孢;誘導(dǎo)抗病性;次生代謝物;保護(hù)酶

中圖分類號(hào)：S643+6;TQ929? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1674-1161（2021）06-0020-04

近年來(lái)，生物防治研究越來(lái)越受到重視，使得植物內(nèi)生菌（Endophyte）成為炙手可熱的研究對(duì)象。枝頂孢屬真菌（Acremonium sp.）是已知的具有殺蟲(chóng)抑菌活性的內(nèi)生菌種屬之一，通過(guò)激發(fā)植物本身的防御體系使其獲得局部或系統(tǒng)的抗病能力。為明確枝頂孢菌的誘抗作用，以菌核生枝頂孢（A.sclerotigenum）為靶標(biāo)，以黑麥草為研究對(duì)象，利用比色法測(cè)定分析枝頂孢次生代謝物對(duì)寄主幼苗保護(hù)酶活性的影響，為開(kāi)發(fā)枝頂孢生防制劑和研制植物抗病性誘導(dǎo)劑奠定理論基礎(chǔ)和提供應(yīng)用實(shí)例。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

靶標(biāo)菌為菌核生枝頂孢由聊城大學(xué)植物病理研究室提供。在無(wú)菌條件下將已活化的枝頂孢菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板中央，于25±1 ℃下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿并產(chǎn)孢。

1.2 次生代謝物提取

將培養(yǎng)好的菌種置于超凈臺(tái)內(nèi)，用0.7 cm×0.7 cm的打孔器打45個(gè)菌餅，接種到裝有300 mL不同液體培養(yǎng)基的錐形瓶（經(jīng)高壓滅菌）中，于25+1 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d;經(jīng)真空抽濾得到的濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（溫度60℃）濃縮至15 mL，倒入離心管后加入同體積甲醇溶液，以10 000 r/min在4 ℃下高速離心10 min，取上清液，旋蒸至冷凝管中無(wú)溶液滴下，即得次生代謝物。

1.3 供試植物與處理

供試材料為長(zhǎng)勢(shì)一致的黑麥草（Lolium perenne）幼苗，由禾優(yōu)種業(yè)公司生產(chǎn)。

除去籽粒不飽滿的種子和雜物后，用清水沖洗種子，移入鋪好滅菌紗布的培養(yǎng)皿底中，每皿60粒。用1 200 mg/L的枝頂孢次生代謝物進(jìn)行處理，時(shí)長(zhǎng)分別為1/3，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 d。每個(gè)處理3皿，以清水作對(duì)照，首次處理時(shí)每皿15mL，后期處理時(shí)每皿10 mL，每天3次， 12 d后將黑麥草整棵取下，用錫箔紙包裹放冰箱冷凍。

1.4 酶活測(cè)定

1.4.1 酶粗提液制備 準(zhǔn)確稱取1 g黑麥草葉片鮮樣，放入預(yù)冷研缽，加入5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.8），冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，攪動(dòng)5 min后置于4 ℃下放置2 h，取出后以10 000 r/min在4 ℃下離心20 min，上清液即為酶粗提取液，于4 ℃保存。

1.4.2 蛋白含量及保護(hù)酶活性測(cè)定 蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮蘭G-250染色法;酯酶（EST）活性測(cè)定按高增貴等方法;超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用NBT光化還原法;多酚氧化酶（PPO）的活性測(cè)定按李靖等方法進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理，經(jīng)DPSV18.10統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物對(duì)可溶性蛋白含量的影響

菌核生枝頂孢次生代謝物對(duì)黑麥草幼苗可溶性蛋白含量的影響如表1所示。

由表1可以看出：枝頂孢代謝物處理寄主植株黑麥草的時(shí)間不同，對(duì)其可溶性蛋白含量的影響不同，所有處理的黑麥草可溶性蛋白含量均低于CK（5.94 mg），處理后黑麥草的蛋白含量為2.54～5.40 mg，抑制率為9.05%～57.22%。說(shuō)明經(jīng)枝頂孢代謝物處理后，黑麥草蛋白含量下降，即代謝物對(duì)黑麥草可溶性蛋白含量呈抑制作用。其中，處理時(shí)間為12 d的代謝物抑制作用最強(qiáng)，抑制率為57.22%，其次是3 d（抑制率33.62%）。

2.2 代謝物對(duì)苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

菌核生枝頂孢次生代謝物對(duì)寄主植株黑麥草PAL活性的影響如表2所示。

由表2可以看出：枝頂孢次生代謝物的處理使黑麥草PAL酶活力大小不同（2 330.15～2 337.63 U/g），但均低于CK（2 338.3 U/g），抑制率為0.03%～0.35%。說(shuō)明經(jīng)代謝物處理后，黑麥草PAL酶活力下降，即代謝物對(duì)黑麥草PAL酶活力表現(xiàn)為抑制作用，且從1 d起，隨著處理天數(shù)的增加，PAL酶活力呈“V”型曲線變化。其中，PAL酶活力最低的拐點(diǎn)在處理8 d時(shí)，為2 330.15 U/g，為CK的99.65%，抑制率為0.35%，表明代謝物在8 d時(shí)對(duì)PAL酶發(fā)揮的抑制作用最大。處理時(shí)間為1 d時(shí)的黑麥草PAL酶活力最高，為

2 337.63 U/g，是CK的99.97%，抑制率為0.03%。整體來(lái)看，處理組PAL酶活力與對(duì)照組相比，降低數(shù)值較小，但降低趨勢(shì)明顯。

2.3 代謝物對(duì)酯酶（EST）活性的影響

菌核生枝頂孢次生代謝物對(duì)黑麥草EST活性的影響如表3所示。

由表3可以看出：次生代謝物處理后的黑麥草EST酶活力大小不同，且均高于CK（2 544 U/g），酶活力為2 548～2 584 U/g，促進(jìn)率為0.14%～1.56%。說(shuō)明經(jīng)代謝物處理后，所有天數(shù)處理的黑麥草EST酶活力均升高，即代謝物對(duì)黑麥草EST的酶活力呈促進(jìn)作用，并且隨著處理天數(shù)的增加，EST酶活力呈倒“V”型曲線變化。其中，酶活力最大的拐點(diǎn)在6 d時(shí)，為2 584 U/g，是對(duì)照的1.02倍，代謝物對(duì)黑麥草的促進(jìn)率為1.56%，表明代謝物在6 d時(shí)代謝物發(fā)揮的促進(jìn)作用最大;處理時(shí)間為12 d的黑麥草EST酶活力最低，為2 548 U/g，與對(duì)照相當(dāng)，促進(jìn)率僅為0.14%;其他時(shí)間處理中，寄主植株黑麥草的EST酶活力在2 548～2 564 U/g之間，代謝物對(duì)黑麥草的促進(jìn)率為0.15%～0.79%。整體來(lái)看，處理組EST酶活力與對(duì)照組相比，升高趨勢(shì)較明顯。

2.4 代謝物對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

菌核生枝頂孢次生代謝物對(duì)寄主植株黑麥草SOD活性的影響如表4所示。

由表4可以看出：代謝物處理黑麥草的時(shí)間不同，對(duì)其SOD酶活力的影響不同，1/3 d時(shí)黑麥草SOD酶活力（76.85 U/mg）高于CK（70.64 U/mg），是對(duì)照的1.09倍，表現(xiàn)為除促進(jìn)作用（促進(jìn)率為11.59%）外，其他所有處理的黑麥草SOD酶活力均低于CK，為28.97～63.55 U/mg，抑制率為7.72%～57.94%，說(shuō)明經(jīng)代謝物處理1～12 d，黑麥草體內(nèi)SOD酶活力均下降，即代謝物對(duì)黑麥草SOD酶活力呈抑制作用，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的波動(dòng)趨勢(shì)，即抑制率呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢(shì)。在1～8 d和9～12 d中，SOD酶活力均不斷降低，12 d時(shí)酶活力最小，為28.97 U/mg，為對(duì)照的41.01%，抑制率達(dá)57.94%，表明代謝物處理黑麥草12 d時(shí)，對(duì)SOD酶活力的抑制作用最大;其次是8 d，酶活力為32.62 U/mg，是對(duì)照的46.18%，抑制率為52.63%。

2.5 代謝物對(duì)多酚氧化酶（PPO）活性的影響

菌核生枝頂孢次生代謝物對(duì)寄主植株黑麥草PPO活性的影響如表5所示。

由表5可以看出：次生代謝物在不同天數(shù)處理下對(duì)黑麥草多酚氧化酶的酶活力大小影響不同，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢(shì)，即抑制率呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的波動(dòng)趨勢(shì)。在1/3～4 d時(shí)，次生代謝物對(duì)黑麥草的PPO酶活力起促進(jìn)作用，促進(jìn)的趨勢(shì)為先升后降。其中，處理時(shí)間為1 d時(shí)的PPO酶活力最高，為11 U/g，是對(duì)照（10.77 U/g）的1.02倍，代謝物對(duì)黑麥草的促進(jìn)作用最大，促進(jìn)率為2.16%;其他時(shí)間處理中，PPO的酶活力分別為10.94 U/g、10.92 U/g和10.91 U/g，酶活促進(jìn)1.54%、1.42%和1.29%;在5～12 d時(shí)，次生代謝物對(duì)黑麥草的PPO 酶活力起抑制作用，抑制趨勢(shì)為先降后升，處理時(shí)間為9 d時(shí)的酶活力最低，為10.70 U/g，是對(duì)照的99.35%，代謝物對(duì)黑麥草的抑制作用最大，抑制率為0.63%;其他時(shí)間處理下，PPO的酶活力為10.72～10.76 U/g。整體來(lái)看，隨著處理天數(shù)的增長(zhǎng)，次生代謝物對(duì)黑麥草PPO酶活力的影響表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制的變化規(guī)律。

3 結(jié)論

采用比色（酶活測(cè)定）法分析經(jīng)枝頂孢次生代謝物處理后的黑麥草可溶性蛋白含量、保護(hù)酶活性變化，結(jié)果表明，代謝物對(duì)可溶性蛋白含量和PAL酶、SOD酶活力表現(xiàn)為抑制作用，對(duì)EST酶活力表現(xiàn)為促進(jìn)作用，而對(duì)PPO酶活力表現(xiàn)為前期促進(jìn)后期（5～12 d）抑制。在供試時(shí)間內(nèi)1 200 mg/L菌核生枝頂孢次生代謝物對(duì)黑麥草的誘導(dǎo)作用，主要通過(guò)PPO和EST兩種酶發(fā)揮作用，誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性以適應(yīng)外界環(huán)境，而SOD和PAL酶對(duì)次生代謝物不敏感，發(fā)揮作用較小。

黑麥草經(jīng)枝頂孢次生代謝物處理后，體內(nèi)保護(hù)酶產(chǎn)生相應(yīng)的變化以適應(yīng)外界環(huán)境，說(shuō)明其能夠通過(guò)與植物之間的相互作用，誘導(dǎo)或提高黑麥草寄主抗病和抗逆能力。菌核生枝頂孢是極具希望的生防因子，若能成功研發(fā)為植物抗病性誘導(dǎo)劑，將對(duì)提高作物的品質(zhì)與產(chǎn)量有重大意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 姚磊，徐良雄，薛璟花，等.枝頂孢屬真菌的抑菌活性及其代謝產(chǎn)物研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2012，20（2）：192-196.

[2] 王桂清，趙培寶，杜學(xué)林，等.灰斑病菌入侵對(duì)不同抗性玉米品種保護(hù)酶活性的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（3）：149-153.

[3] 李凡海.康寧霉素對(duì)臭椿苗期病害致病菌抑菌機(jī)理的研究[D].聊城：聊城大學(xué)，2015.

[4] 姚秀英，劉南南，王桂清.菌核生枝頂孢次生代謝物對(duì)桃褐斑致病菌的抑制效果[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備，2019（3）：19-22.

[5] 張向月，趙麗紅，馮鴻杰，等.枝頂孢霉屬內(nèi)生真菌CEF-193對(duì)棉花黃萎病的控制作用[J].中國(guó)棉花，2020，47（9）：20-22+26.

[6] 曹宇恒，張子豪，林鋒科，等.內(nèi)生真菌交織枝頂孢次生代謝產(chǎn)物及其生物活性[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2016（28）：182-187.

[7] 王志偉，紀(jì)燕玲，陳永敢.植物內(nèi)生菌研究及其科學(xué)意義[J].微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（2）：349-363.

Effect of Secondary Metabolites of Acremonium Sclerotigenum

on Protective Enzymes Activity in Ryegrass

LIU Xin， SONG Chunyan， MOU Jiaxin， LIU Kaidi， WANG Guiqing*

（College of Agronomy， Liaocheng University， Liaocheng Shandong 252059， China）

Abstract： In order to develop biocontrol agents for Acremonium， with ryegrass as the target plant， the effects of secondary metabolites of Acremonium sclerotigenum on protective enzyme activities of ryegrass were analyzed by colorimetry method. The results showed that the metabolites mainly inhibited the content of soluble protein and the activities of PAL and SOD in ryegrass， but promoted the activities of EST. PPO activity was promoted in the early stage and inhibited in the late stage （5～12 d）.

Key words： Acremonium sclerotigenum; desease induced resistance; secondary metabolite;? protective enzyme

收稿日期：2021-08-08

作者簡(jiǎn)介：劉 新（1999—）女，碩士，從事植物栽培與保護(hù)方面的研究。

通信作者：王桂清（1968—），女，博士，教授，從事植物保護(hù)的教學(xué)與科研工作。