賴寶春，姚錦愛，戴瑞卿，吳振強，王家瑞

（1. 福建省漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，漳州 363005；2. 福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，福州 350013）

由茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum引起的番茄青枯病是一種世界范圍的細菌性維管束病害，能侵染 200多種植物，包括茄科農(nóng)作物和觀賞類植物[1]。生產(chǎn)上防控該病的方法主要有施用化學(xué)農(nóng)藥[2]、選育抗病品種[3]、嫁接或輪作[4]、土壤改良[5]等，但都存在明顯的弊端。近年來，拮抗微生物菌劑因其高效、生態(tài)安全、成本低、專一性強且能促進植株生長等優(yōu)點已成為植物青枯病生物防治的首選。已篩選出的微生物菌劑包括單一菌劑和復(fù)合菌劑。單一菌劑主要有芽胞桿菌[6,7]、無致病力青枯雷爾氏菌[8]、假單孢菌[9]、鏈霉菌[10,11]等。但考慮到青枯病菌是一種破壞性極強的土傳細菌，在土壤、水和植物中存活時間長，單一菌劑防效不理想，存在諸如持效性差，環(huán)境依賴性強等，難以達到理想的防治效果[12]。而復(fù)合菌劑具有提高生物防治效果及延長生防菌作用期限等優(yōu)點，已成為新的研究熱點，目前有關(guān)利用復(fù)合菌劑防治青枯病的報道多集中于生防細菌的復(fù)配，王麗麗等[13]將健康番茄根際分離到的2株芽胞桿菌混合后，對番茄青枯病的防治效果明顯優(yōu)于單一菌株。李程等[14]將2株解淀粉芽胞桿菌ZM9和YH-22復(fù)合后對煙草青枯病菌的抑菌圈直徑顯著大于單一菌株處理。呂建林等[15]將短短芽胞桿菌B011和側(cè)孢芽胞桿菌2-Q-9混合后對煙草青枯病的防效優(yōu)于單一菌株，達 83.39%。黃小琴等[16]用解淀粉芽胞桿菌和硫酸鏈霉素混配后，對煙草青枯病的防效達65.85%，且能減少一半化學(xué)農(nóng)藥的施用量。因此，通過復(fù)合菌劑來提高番茄青枯病的防治效果顯得尤為重要。

有關(guān)生防放線菌復(fù)合防治番茄青枯病的研究較少。而放線菌中應(yīng)用最多的是鏈霉菌，鏈霉菌已被報道應(yīng)用于防治多種植物的青枯病，還能促進植株生長[17,18]。鏈霉菌的代謝產(chǎn)物能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，如豐加霉素、環(huán)二肽、四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等[19,20]。且生產(chǎn)上應(yīng)用的諾爾霉素、水合霉素、中生菌素等農(nóng)用抗生素對番茄青枯病均具有良好的防治效果[21]。Amano等[22]、Smaoui等[23]報道的灰銹赤鏈霉菌能產(chǎn)多種抗生素及抗真菌純化合物。Wadetwar等[24]、包慧芳等[25]報道的深紅紫鏈霉菌除了能產(chǎn)生胞外抗生素，還具有α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶的活性。因此，探索鏈霉菌復(fù)合防控番茄青枯病具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究的生防菌株灰銹赤鏈霉菌（FX81）和深紅紫鏈霉菌（FX28）前期已證實對土傳病原真菌鐮刀菌具有良好的抑制作用，抑菌譜廣，且能致真菌菌絲畸變，具強烈抑制病菌孢子萌發(fā)的能力[26-28]。為進一步評價這2株放線菌對土傳病原細菌的抑制作用，我們進行了單菌株對番茄青枯病菌的皿內(nèi)初篩后，發(fā)現(xiàn)這2株放線菌均對番茄青枯病菌有較強的抑制作用。因此，本研究從生防放線菌多菌復(fù)合協(xié)同增效的角度出發(fā)，研究2株拮抗放線菌復(fù)合對番茄青枯病的防治效果及其對番茄植株的促生作用，以期為番茄青枯病微生物菌肥的開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試拮抗放線菌：灰銹赤鏈霉菌Streptomyces griseorubiginosus（FX81）和深紅紫鏈霉菌Streptomyces violaceorubidus（FX28）菌株，均由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植物保護研究室篩選保藏。

供試病原菌：番茄青枯病菌R. solanacearum（QK1）由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植物保護研究室分離、鑒定、保藏。

試驗番茄品種：“西研958”（西安秦蔬農(nóng)業(yè)有限公司），由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所蔬菜研究室提供。

1.2 拮抗菌株間親和性的測定

將100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基加入250 mL的三角瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻后分別單獨接入菌株FX81和FX28的5 mm菌餅各5塊，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，制成1.0×108cfu/mL菌株發(fā)酵液備用；采用對峙培養(yǎng)法將2株菌株的發(fā)酵液交叉滴于同一個高氏一號培養(yǎng)基平板上，重復(fù)3次。28 ℃對峙培養(yǎng)5～7 d，觀察2株菌株的生長情況及相互之間有無拮抗作用。

1.3 單一及復(fù)合拮抗菌離體抑菌作用測定

按1.2的方法同時接入菌株FX81和FX28的5 mm菌餅各3塊，制成1.0×108cfu/mL的復(fù)合發(fā)酵液備用。采用杯碟法。將培養(yǎng)好的番茄青枯菌液100 μL（濃度為3.0×106cfu/mL）與培養(yǎng)基混勻后倒入放置牛津杯的平板，待凝固后取出牛津杯，在孔中加入200 μL的待測單一或復(fù)合拮抗菌的發(fā)酵液，培養(yǎng)48 h后測定透明抑菌圈的大小[29]。

1.4 單一及復(fù)合菌劑對番茄青枯病的防治效果

1.4.1 單一及復(fù)合菌劑的制備 單一及復(fù)合固體發(fā)酵基質(zhì)配方及固體菌劑發(fā)酵參考賴寶春等[26]的方法制備。即將優(yōu)化好的豬糞與麥麩質(zhì)量比為4:6裝入250 mL三角瓶中，每瓶加發(fā)酵原料總量20 g，控制料水比為1:0.8，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.5，121 ℃滅菌20 min，即為固體發(fā)酵基質(zhì)（命名為GC）。按15%接種量接入單一及復(fù)合發(fā)酵液，28 ℃恒溫培養(yǎng)，待瓶壁及固體培養(yǎng)基中長滿菌絲，并散發(fā)出典型的“土腥味”，即完成單一及復(fù)合固體菌劑發(fā)酵，分別命名為BOF28、BOF81、BOF8128，菌劑中拮抗菌的含量達到108cfu/g。1.4.2 盆栽防治效果測定 番茄種子催芽后播種于穴盤，待番茄幼苗長至12 cm時，挑選長勢一致的番茄幼苗移栽到花盆（直徑25 cm）中，每盆1株苗，試驗設(shè)6個處理，分別為CK1（空白對照）、CK2（與固體發(fā)酵基質(zhì)相當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)化肥對照）、GC（固體發(fā)酵基質(zhì)）、BOF81（含F(xiàn)X81菌株的菌劑）、BOF28（含F(xiàn)X28菌株的菌劑）、BOF8128（含2株菌比例為1:1的復(fù)合菌劑），固體發(fā)酵基質(zhì)和固體菌劑用量為2%（質(zhì)量分數(shù)），與土壤混勻。每個處理10盆，3次重復(fù)。處理7 d后，每盆根部接種青枯菌液5 mL（濃度為3.0×106cfu/mL），接種45 d后采集各處理的根際土樣，利用SMSA培養(yǎng)基平板稀釋涂布法計數(shù)青枯病菌的數(shù)量[30]；并調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)，計算防治效果，病害分級標(biāo)準(zhǔn)參照王麗麗等[13]的方法。發(fā)病率（%）＝發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100，病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.4.3 生物量的測定 按1.4.2的方法播種、移栽和管理，45 d后將各處理的健康番茄植株連根拔起帶回實驗室，將植株地上部洗凈后裝入大牛皮紙袋中，105 ℃殺青0.5 h后，80 ℃烘至恒質(zhì)量，測定植株干質(zhì)量，分析生防放線菌復(fù)合菌劑對番茄植株的促生作用。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

試驗數(shù)據(jù)處理采用DPS 7.5軟件進行分析，Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 2株拮抗放線菌親和性的測定

將菌株FX81和FX28在高氏一號培養(yǎng)基上共培養(yǎng)的生長情況進行觀察，可見2株菌株之間能夠重疊生長，菌落之間未觀察到明顯的抑菌帶，即表明2株菌株之間無明顯抑制作用，可以進行復(fù)合發(fā)酵或?qū)⒕哼M行復(fù)配（圖1）。

圖1 菌株FX81和FX28的共培養(yǎng)Fig. 1 Co-culture of FX81 and FX28

2.2 單一及復(fù)合拮抗菌株對番茄青枯病菌的抑制作用

2株放線菌單一菌株或復(fù)合菌株發(fā)酵液對番茄青枯病菌均有較強的抑制作用，菌株FX81單一發(fā)酵液抑菌圈平均直徑為（27.0±0.43）mm（圖2B），菌株FX28單一發(fā)酵液抑菌圈平均直徑為（28.8±0.62）mm（圖2C），復(fù)合拮抗菌發(fā)酵液抑菌圈平均直徑達（36.0±0.46）mm（圖2D）。結(jié)果表明，拮抗放線菌復(fù)合發(fā)酵液處理組對番茄青枯病菌的抑菌效果優(yōu)于單一菌株處理組，說明2株放線菌對番茄青枯病菌具有的協(xié)同抑制作用。

圖2 單一菌株及復(fù)合菌株對番茄青枯病菌的拮抗效果Fig. 2 Inhibitory effect of strain single and compound against R. solanacearum

2.3 單一及復(fù)合菌劑對番茄青枯病的防治效果

2.3.1 單一及復(fù)合菌劑對番茄生物量的影響 從表1可以看出，單施固體發(fā)酵基質(zhì)（GC）與常規(guī)化肥對照（CK2）相比無明顯促生效果，各菌劑處理可顯著提高番茄地上部干質(zhì)量，施用單一菌劑BOF81和BOF28番茄地上部干質(zhì)量分別比空白對照（CK1）增加54.49%和46.51%；施用復(fù)合菌劑BOF8128對番茄生物量影響最顯著，與空白對照（CK1）相比增加76.58%，與單一菌劑BOF81和BOF28相比，分別增加14.31%和20.52%。說明復(fù)合菌劑BOF8128在促進番茄地上部分生長方面顯著優(yōu)于單一菌劑。

表1 單一及復(fù)合菌劑對番茄地上部干質(zhì)量的影響Table 1 Effects of single and compound microbial agents on dry weight of tomato shoot

2.3.2 單一及復(fù)合菌劑對番茄根際病原菌數(shù)量的影響 從圖3結(jié)果可以看出，菌劑可顯著影響番茄根際青枯菌的數(shù)量，接種青枯菌45 d后，空白對照（CK1）青枯菌的數(shù)量達1.7×108cfu/g，顯著高于菌劑處理。施用單一菌劑BOF81和BOF28青枯菌數(shù)量分別為1.4×107cfu/g和1.9×107cfu/g，與空白對照（CK1）相比，青枯病菌數(shù)量增長較緩慢。而施用復(fù)合菌劑BOF8128青枯菌數(shù)量為2.8×106cfu/g，對番茄根際青枯菌數(shù)量的影響最顯著，比接種時青枯菌數(shù)量3.0×106cfu/g略低，表明復(fù)合菌劑比單一菌劑在抑制青枯菌數(shù)量增長方面效果更好。

圖3 不同處理組對青枯病菌數(shù)量的影響Fig. 3 Effects of different treatments on the number of R. solanacearum

2.3.3 單一及復(fù)合菌劑對番茄青枯病的防治效果 接種病原菌45 d后，空白對照（CK1）發(fā)病嚴重，發(fā)病率達76.67%，單一及復(fù)合菌劑的處理BOF8128、BOF81和BOF28均能顯著抑制青枯病的發(fā)生，病情指數(shù)分別為11.67、15.83和20.0。復(fù)合菌劑BOF8128對番茄青枯病的防治效果82.03%，顯著高于單一菌劑處理BOF28防效69.15%（表2）。

表2 不同處理組對番茄青枯病的防控效果Table 2 The control effect of different treatments on tomato bacterial wilt in greenhouse

3 討論

鏈霉菌對植物病原菌的抑制作用機制之一是產(chǎn)生抗生素，其與病原細菌之間常見有透明的抑菌圈，與病原真菌之間常見有透明的抑菌帶，說明它們分泌出抗菌素類物質(zhì)[10]，雖然鏈霉菌對多種植物的青枯病表現(xiàn)出較好的防效，但大多單一菌株的生防持效性差，防效不理想。將不同作用機制、不同生長條件和不同生態(tài)適應(yīng)性等特點的拮抗菌株共同作用，能提高防病效果和穩(wěn)定性[31]。因此，將無明顯拮抗作用的生防菌株復(fù)合培養(yǎng)，菌株間通過協(xié)同作用實現(xiàn)優(yōu)勢互補，發(fā)揮出理想的生防效果。前期試驗發(fā)現(xiàn)菌株FX81生態(tài)適應(yīng)性強，能降低香蕉根際土壤中病原菌的數(shù)量，對香蕉枯萎病的防治效果達81.05%，且能促進香蕉植株生長[26]。菌株FX28有較強的抑制病菌孢子萌發(fā)的能力，對蜜柚炭疽病菌孢子的萌發(fā)抑制率達97.0%，對蜜柚炭疽病的預(yù)防效果和治療效果分別為83.8%和71.1%[27]。本試驗將這2株放線菌交叉培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)它們之間無明顯拮抗作用，進一步試驗結(jié)果表明2株菌株復(fù)合培養(yǎng)后對番茄青枯病菌的抑菌圈平均直徑顯著大于單一菌株的抑菌圈平均直徑，與前人研究結(jié)論一致。

葛紅蓮等[32]將5株生防細菌復(fù)配后澆灌對盆栽辣椒青枯病的防治效果達到91.1%，優(yōu)于任何單一菌株，田間采用拌菌堆肥法（添加營養(yǎng)載體）和澆灌法的防治效果分別為94.0%和77.0%，增產(chǎn)效果分別為367.0%和57.8%。李勤奮等[33]研究了復(fù)合菌液C1、C2蘸根（未添加營養(yǎng)載體）處理對盆栽番茄的抗病促生作用，結(jié)果表明復(fù)合菌液C1、C2均能明顯促進番茄植株生長，以復(fù)合菌劑C2對番茄青枯病的防治效果最好，達66.9%。說明生防菌株添加適合的營養(yǎng)載體能夠顯著提高防效和促進增產(chǎn)，這可能是因為適合的營養(yǎng)載體使復(fù)合菌菌量大量增加，更能適應(yīng)復(fù)雜的土壤微生物環(huán)境，提高復(fù)合菌在植株根際的定殖能力，占據(jù)植株根部生態(tài)位點，促進其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力，從而達到有效抑制病害的發(fā)生。且營養(yǎng)載體在發(fā)酵過程中將一些不易利用的營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化為易于植物吸收的小分子物質(zhì)，能為植物提供更豐富的營養(yǎng)。譚兆贊等[34]研究結(jié)果表明，復(fù)合微生物菌劑可提高土壤微生物的多樣性，降低土壤病原菌的基數(shù)，從而抑制番茄青枯病的發(fā)生。Lee等[35]比較健康番茄和患青枯病番茄根際土壤微生物多樣性，結(jié)果表明番茄植株根際放線菌豐度高有利于抑制青枯病的發(fā)生，這均與本研究結(jié)果基本一致。Marian等[36]將β-變形菌 TWR114 和非致病性青枯菌TCR112按不同比例復(fù)合后，對盆栽番茄青枯病的防治效果均優(yōu)于單一菌劑，可顯著降低番茄根際青枯病菌的數(shù)量，其作用機理研究表明復(fù)合菌具有更強的防御和協(xié)調(diào)抑制作用，有助于提高生防效果。

本文初步研究了2株生防放線菌復(fù)合防治番茄青枯病的效果，充分利用有益菌與病原菌之間的拮抗、競爭等關(guān)系，發(fā)揮了生防菌之間的協(xié)同增效特點，降低植株根際病原菌的基數(shù)，從而降低發(fā)病率和病情指數(shù)，促進植株生長。由于本文僅測定了復(fù)合菌劑的盆栽防效，還未進行田間試驗，相對較為復(fù)雜的大田土壤環(huán)境下的應(yīng)用效果還有待進一步研究。