李 澤，楊洪佳，張 良，張春雨，胡育碩，樊 東

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

在昆蟲的生長發(fā)育中，昆蟲的蛻皮與變態(tài)受到多種激素的影響，其中最主要的是保幼激素（Juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（molting hormone，MH）[1]。蛻皮激素誘導(dǎo)昆蟲的蛻皮和變態(tài)，而保幼激素則阻止由蛻皮激素引起的變態(tài)，使幼蟲蛻皮后仍然維持幼蟲形態(tài)[2,3]。在昆蟲的齡期末期通常觀察到JH滴度的急劇下降和蛻皮激素滴度的急劇上升，由于JH與MH在功能上的拮抗作用和在昆蟲生長發(fā)育過程中其滴度變化呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，暗示了MH對(duì)JH的降解可能具有促進(jìn)作用[4]。昆蟲蛻皮過程發(fā)生在很短的時(shí)間內(nèi)，因此JH的快速降解對(duì)昆蟲的發(fā)展具有重要意義。

保幼激素降解過程中主要有三種酶參與：保幼激素酯酶（Juvenile hormone esterase，JHE）、保幼激素環(huán)氧水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase，JHEH）和保幼激素二醇激酶（Juvenile hormone diol kinase，JHDK）[5-7]。其中，JHEH負(fù)責(zé)不可逆地打開環(huán)氧環(huán)，將保幼激素水解為保幼激素二醇，將保幼激素酸水解為保幼激素酸二醇[8-10]。由于JH在昆蟲發(fā)育和生殖過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[11]，長期以來，干擾其生物合成和代謝一直被認(rèn)為是一種很有前途的替代化學(xué)殺蟲劑的方法，并且對(duì)非目標(biāo)生物具有低毒性[12]。大多數(shù)關(guān)于JH降解的研究都集中在JHE的作用機(jī)制上，但越來越多的研究表明，JHEH在昆蟲發(fā)育中和JHE一樣重要[13]，因?yàn)楸Ｓ准に囟己捅Ｓ准に厮岫际抢ハx的主要代謝物[14]。因此，由于其在JH調(diào)控和不可逆降解中的作用，對(duì)于JHEH的研究也是至關(guān)重要的[15]。

以往對(duì)于昆蟲保幼激素環(huán)氧水解酶的研究多集中在鱗翅目，自從從煙草天蛾Manduca sexta[16]卵中克隆出第一個(gè)JHEH基因后，在粉紋夜蛾Trichoplusia ni[17]、家蠶Bombyx mori[18]、棉鈴蟲Helicoverpa armigera[19]、小菜蛾P(guān)lutella xylostella[20]、斜紋夜蛾Spodoptera litura[21]、赤擬谷盜Tribolium castaneum[14]等昆蟲中對(duì)JHEH進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)JHEH均具有水解JH的功能，且在一些昆蟲如赤擬谷盜中，不止一種JHEH[14]，而是多種JHEH共同參與調(diào)控昆蟲的蛻皮、繁殖、滯育和變態(tài)等一系列重要生物學(xué)功能，對(duì)昆蟲正常的生長發(fā)育具有重要意義。

黏蟲Mythimna separata屬于鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是我國重要的農(nóng)業(yè)害蟲，一旦大暴發(fā)會(huì)對(duì)我國糧食作物造成十分嚴(yán)重的危害[22]。目前對(duì)于黏蟲的防治多采用化學(xué)防治，但逐年凸顯的抗藥性問題讓我們不得不尋找其他更為有效的防治方法[23]。本研究以黏蟲為研究對(duì)象，探究MsJHEH2基因在黏蟲體內(nèi)的表達(dá)情況，并利用RNAi技術(shù)將MsJHEH2基因沉默，探究基因沉默后黏蟲體內(nèi)JH含量的變化，以及對(duì)黏蟲生長發(fā)育的影響，為今后提出通過保幼激素降解途徑防治黏蟲的生物技術(shù)防治方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗(yàn)所用黏蟲采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽試驗(yàn)示范基地，在室內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)數(shù)代。將黏蟲幼蟲放入人工氣候箱中飼養(yǎng)，溫度為（25±1）℃、相對(duì)濕度為（65±5）%、光周期為14L:10D，期間喂食新鮮玉米葉片。將預(yù)蛹期幼蟲放入裝有濕潤土壤的培養(yǎng)盒中，待其羽化后，放入養(yǎng)蟲籠中，喂食蜂蜜水，在籠中放入用于產(chǎn)卵的塑料條，每2 d更換一次。待其產(chǎn)卵后，每天更換塑料條并將帶有卵塊的塑料條放到通風(fēng)濕潤的培養(yǎng)盒內(nèi)，待其孵化后繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2 黏蟲JHEH基因的克隆及序列分析

1.2.1 黏蟲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 收集黏蟲卵、1～6齡各齡期的幼蟲、預(yù)蛹、蛹和成蟲，用液氮速凍后將樣本送到安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2.2 cDNA 序列的克隆與鑒定 在獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行保幼激素環(huán)氧水解酶基因序列的篩選，并將篩選出的基因序列在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）網(wǎng)站上使用BLAST進(jìn)行進(jìn)一步的同源性比對(duì)。使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物MsJHEH2-F和MsJHEH2-R（表1），通過PCR擴(kuò)增、膠回收和測(cè)序，對(duì)在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出的保幼激素環(huán)氧水解酶基因序列進(jìn)行準(zhǔn)確性校正。將獲得的完整的保幼激素環(huán)氧水解酶基因cDNA序列在GenBank上登錄。

表1 引物名稱、序列及用途Table 1 Primer name, sequence and purpose

1.2.3 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 利用在線網(wǎng)站ExPASy（http://ca.expasy.org/tools/）預(yù)測(cè)氨基酸的等電點(diǎn)和分子量，利用在線網(wǎng)站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）、HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）和 InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro）預(yù)測(cè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域，利用在線網(wǎng)站ProtParam（https://www.expasy.org/resources/protparam）對(duì)氨基酸的組成及理化性質(zhì)進(jìn)行分析，亞細(xì)胞定位使用網(wǎng)站CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）網(wǎng)站進(jìn)行。在NCBI網(wǎng)站使用BLAST搜索昆蟲JHEH序列，利用MEGA7.0軟件中鄰位相連（Neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 MsJHEH2基因表達(dá)模式研究

1.3.1 不同齡期表達(dá)模式分析 分別選取生長情況良好的黏蟲卵、1～6齡幼蟲、預(yù)蛹、蛹和成蟲的第1 d蟲體，放入液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱中備用。利用TRIzol法提取黏蟲總RNA，每100 mg組織中加入1 mL Invitrogen公司生產(chǎn)的TRIzol?Reagent，提取得到的總RNA用紫外分光光度計(jì)鑒定其純度和濃度，檢測(cè)合格的RNA放入-80 ℃冰箱備用。取2 μg總RNA，使用TOYOBO公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revertra Tra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover）對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成得到cDNA第1鏈，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用獲得的MsJHEH2cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量引物MsJHEH2-q-F和MsJHEH2-q-R，使用兩個(gè)內(nèi)參基因G-3-P和β-actin，熒光定量引物G-3-P-F、G-3-P-R、β-actin-F、β-actin-R見表1，黏蟲不同發(fā)育階段的cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR，使用熒光染料SYBR Primer Script RT?PCR Kit Mix（TOYOBO，日本）在Bio?Rad熒光定量PCR儀上通過三步法進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各 0.6 μL，底物 cDNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，生物學(xué)重復(fù)3次。

1.3.2 3齡幼蟲不同發(fā)育時(shí)間表達(dá)模式分析 為了進(jìn)一步明確MsJHEH2在一個(gè)齡期的不同發(fā)育時(shí)間的表達(dá)模式，對(duì)即將蛻皮的2齡幼蟲進(jìn)行觀察，選取生長情況良好并一致的3齡3、6、12、24、48 h幼蟲各3頭，放入液氮中進(jìn)行速凍，保存于-80 ℃中。對(duì)各樣品分別進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第1鏈，通過qRT-PCR檢測(cè)MsJHEH2基因表達(dá)量，操作方法同1.3.1。

1.3.3 不同組織內(nèi)表達(dá)模式分析 選取生長狀況良好的4齡第1 d黏蟲幼蟲，將其在RNA組織保存液中進(jìn)行解剖，獲得前腸、中腸、后腸、脂肪體、馬氏管、唾腺和體壁7個(gè)組織。分別提取各組織RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第1鏈，并通過熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量，操作方法參照1.3.1。設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1997年，朗格推出先進(jìn)而精密的自動(dòng)上鏈機(jī)心——屢獲殊榮的Sax-0-Mat型機(jī)心，內(nèi)置歸零裝置，于表冠拉起時(shí)掣停擺輪，秒針即時(shí)返回零位，就如計(jì)時(shí)碼表一樣。Sax-0-Mat型機(jī)心仍為Langematik Perpetual和Saxonia ANNUAL CALENDAR等表款的基本機(jī)心。1815 Tourbillon和Richard Lange Jumping Seconds的手動(dòng)上鏈機(jī)心亦設(shè)有歸零功能，簡化了時(shí)間設(shè)定過程。往后的表款中，歸零裝置采用獨(dú)立模組設(shè)計(jì)，附設(shè)由多個(gè)圓盤組成的離合器，使秒針在突然的震蕩或反彈中仍平穩(wěn)運(yùn)作。

1.4 MsJHEH2基因?qū)Σ煌瑵舛缺Ｓ准に氐谋磉_(dá)響應(yīng)

選用生長狀況良好的4齡第一天黏蟲幼蟲，使用注射法對(duì)黏蟲進(jìn)行保幼激素類似物（Juvenile hormone analogue，JHA）處理，保幼激素類似物烯蟲酯（S-(+)-Methoprene）[24]購自aladdin公司，用1%的DMSO（購自coolaber公司）稀釋成五個(gè)濃度梯度，0.3125、0.625、1.25、2.5和5 μg/μL，1%的DMSO作為對(duì)照，在每頭幼蟲腹部2～3節(jié)注射2 μL不同濃度保幼激素類似物。將注射后的幼蟲進(jìn)行單頭飼養(yǎng)，并在處理后3、6、12、24和48 h分別收集存活的幼蟲各3頭，放入液氮中速凍致死后放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?duì)各樣品分別進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第1鏈，并通過熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量，操作方法同1.3.1。

1.5 MsJHEH2基因生物功能研究

1.5.1 RNA干擾處理與MsJHEH2基因表達(dá)量檢測(cè) 將MsJHEH2基因完整的cDNA序列發(fā)送至上海吉瑪公司分別設(shè)計(jì)并合成MsJHEH2基因的siRNA和與靶基因無同源性且在黏蟲體內(nèi)沒有生物學(xué)效應(yīng)的陰性對(duì)照（Negative Control，NC），引物序列siMsJHEH2-F、siMsJHEH2-R、Negative control-F、Negative control-R見表1，用對(duì)應(yīng)體積ddH2O分別稀釋成濃度為20 μmol/L備用。選取生長狀況良好的4齡第1 d黏蟲幼蟲，對(duì)其進(jìn)行siRNA注射，操作方法同1.4。將注射后的幼蟲進(jìn)行單頭飼養(yǎng)，并在處理后的3、6、12、24、48、72和96 h后分別收集存活的幼蟲各3頭，放入液氮中速凍致死后放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將處理后的黏蟲幼蟲進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第1鏈，并通過qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)量，操作方法如1.3.1，檢測(cè)干擾不同時(shí)間后基因沉默效率。

1.5.2 RNA干擾后保幼激素含量檢測(cè) 首先參照考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定RNA干擾不同時(shí)間后黏蟲體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量[25]，利用昆蟲保幼激素（JH）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司）測(cè)定RNA干擾后不同時(shí)間黏蟲體內(nèi)保幼激素（JH）含量，具體操作見說明書。樣品折算保幼激素含量＝樣品實(shí)際保幼激素含量/樣品總蛋白質(zhì)含量，以樣品折算保幼激素含量作為結(jié)果中樣品的最終保幼激素含量。

1.5.3MsJHEH2基因?qū)︷はx生長發(fā)育的調(diào)控作用研究 選取體質(zhì)量基本一致，生長狀況良好的4齡第1 d黏蟲幼蟲，用萬分之一天平分別稱重后注射 siRNA，操作方法同 1.4，注射后將每頭黏蟲幼蟲單獨(dú)放于塑料平皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)飼養(yǎng)，每個(gè)處理注射30頭黏蟲幼蟲，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。注射后的黏蟲幼蟲每24 h觀察1次并記錄體重變化，并用萬分之一天平稱量單頭蛹（化蛹第二日）的重量。觀察并記錄幼蟲4、5、6齡的發(fā)育歷期，統(tǒng)計(jì)幼蟲化蛹率、蛹?xì)v期及羽化率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算MsJHEH2基因相對(duì)表達(dá)量[26]。利用IMB SPSS Statistics 23軟件單因素方差分析的方法進(jìn)行黏蟲體內(nèi)各組織、各齡期及JHA處理后不同時(shí)間點(diǎn)MsJHEH2基因相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性分析，利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的方法進(jìn)行RNA干擾后MsJHEH2基因表達(dá)量、保幼激素含量、化蛹率和羽化率各數(shù)據(jù)間差異顯著性分析，顯著性水平為P＜0.05。并在Excel 2010中計(jì)算數(shù)值及制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsJHEH2基因的克隆與分析

本試驗(yàn)通過對(duì)黏蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索、NCBI比對(duì)、保守結(jié)構(gòu)域查找以及序列驗(yàn)證，得到1條包含完整開放閱讀框（ORF）序列的保幼激素環(huán)氧水解酶基因cDNA序列。序列驗(yàn)證后，在NCBI上進(jìn)行登錄并命名為MsJHEH2（登錄號(hào)：MT802192）。利用在線軟件ProtParam對(duì)MsJHEH2基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，MsJHEH2基因cDNA長度為1533 bp，ORF 1389 bp，編碼462個(gè)氨基酸，第 51～160個(gè)氨基酸之間存在EHN環(huán)氧水解酶超家族結(jié)構(gòu)域（圖1）。該蛋白質(zhì)共有 7443個(gè)原子，分子式為 C2455H3726N598O653S11，分子量為 52.42 kD；該蛋白質(zhì)的負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）數(shù)為50個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）為50個(gè)，理論等電點(diǎn)為7.07；該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為30.85，據(jù)此可將其歸為穩(wěn)定蛋白；脂肪族指數(shù)為90.32，平均疏水性（GRAVY）為?0.023；蛋白中含量最多的氨基酸為Ala（6.5%）。利用InterProScan和Hmmer工具進(jìn)行的氨基酸分析得到3個(gè)環(huán)氧水解酶家族標(biāo)簽，即序列催化三聯(lián)體Asp226、Glu402、His429殘基。此外發(fā)現(xiàn)MsJHEH蛋白保守基序HGWP151花樣結(jié)構(gòu)，2個(gè)作為穩(wěn)定劑結(jié)合環(huán)氧環(huán)中氧離子洞結(jié)構(gòu)的Tyr297、Tyr372殘基，N-端的跨膜基序XWG37（其中X為芳香族殘基）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MsJHEH2基因編碼蛋白位于質(zhì)膜（PlasmaMembrane）和細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasmic）的可能性最大。TMHMM網(wǎng)站（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MsJHEH2編碼蛋白存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，位于第 5～23個(gè)氨基酸之間。

圖1 MsJHEH2基因 cDNA 序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 cDNA and deduced amino acid sequences of MsJHEH2

2.2 MsJHEH2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析MsJHEH2與其他昆蟲JHEH基因的親緣關(guān)系（圖2）。分析發(fā)現(xiàn)，黏蟲M. separata（QOI60666）首先與夜蛾科昆蟲，如草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（XP_035454913）、斜紋夜蛾S. litura（QDP42285）、棉鈴蟲H. armigera（XP_021199401）和粉紋夜蛾T. ni（XP_026738426）聚類，顯示它們的親緣關(guān)系最近；再與蛾類其他昆蟲如亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis（XP_028170523）、煙草天蛾M. sexta（XP_037300979）、草地夜蛾Bombyx mandarina（XP_028039332）、家蠶B, mori（NP_001037201）聚類，顯示它們的親緣關(guān)系較近；最后與蝶類如金鳳蝶Papilio machaon（XP_014361683）、柑橘鳳蝶Papilio xuthus（KPI98602）、黑脈金斑蝶Danaus plexippus plexippus（XP_032521996）等昆蟲聚類，顯示它們的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。說明在昆蟲中，JHEH在鱗翅目中的同源性具有高度保守性，昆蟲保幼激素環(huán)氧水解酶之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與形態(tài)特征的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系具有一定的相關(guān)性。

圖2 基于氨基酸序列構(gòu)建的黏蟲與其他昆蟲JHEH蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of JHEH proteins from Mythimna separata and other insects

2.3 黏蟲MsJHEH2基因表達(dá)模式分析

2.3.1 在不同發(fā)育階段表達(dá)模式分析 qRT-PCR分析結(jié)果顯示MsJHEH2基因在黏蟲不同發(fā)育階段內(nèi)均有表達(dá)，其中在蛹期表達(dá)量最高，是成蟲體內(nèi)表達(dá)量的40.5倍，在5齡和預(yù)蛹期內(nèi)表達(dá)量相對(duì)較高，二者差異不顯著但均與其他發(fā)育階段差異顯著。1齡幼蟲中相對(duì)表達(dá)量也較高，其他發(fā)育階段表達(dá)量均較低，沒有顯著性差異（圖3）。

圖3 黏蟲不同發(fā)育階段MsJHEH2表達(dá)模式Fig. 3 MsJHEH2 expression pattern at different developmental stages of M. separata

圖4 黏蟲3齡期內(nèi)不同時(shí)間MsJHEH2表達(dá)模式Fig. 4 MsJHEH2 expression pattern at different time points in the 3rd instar larvae of M. separata

2.3.3在不同組織中表達(dá)模式分析 qRT-PCR分析結(jié)果顯示，MsJHEH2基因在黏蟲中腸和體壁中相對(duì)表達(dá)量最高，與其他組織中表達(dá)量相比差異顯著，分別為唾腺中表達(dá)量的181.04和168.09倍；在脂肪體中基因表達(dá)量較高；在前腸、后腸和馬氏管中表達(dá)量相對(duì)較低，無明顯差異，其中唾腺內(nèi)MsJHEH2基因表達(dá)量最少（圖5）。

圖5 黏蟲不同組織MsJHEH2表達(dá)模式Fig. 5 MsJHEH2 expression pattern in different tissues of M. separata

2.4 不同濃度JHA處理對(duì)黏蟲MsJHEH2基因表達(dá)的影響

JHA處理后不同時(shí)間點(diǎn)MsJHEH2基因表達(dá)均有顯著性差異，不同濃度JHA處理后基因MsJHEH2表達(dá)量隨時(shí)間變化成上升趨勢(shì)，并在12 h達(dá)到最高，后緩慢下降。低濃度JHA（0.3125、0.625、1.25 μg/μL）處理12 h后均促進(jìn)MsJHEH2基因表達(dá)，而高濃度JHA（2.5、5 μg/μL）處理后基因上調(diào)程度較低，并在48 h抑制其表達(dá)（圖6）。

圖6 JHA對(duì)黏蟲MsJHEH2表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of JHA on the expression of MsJHEH2 in M. separata

2.5 黏蟲MsJHEH2基因生物學(xué)功能研究

2.5.1 RNA干擾對(duì)MsJHEH2基因表達(dá)量的影響 RNA干擾后，MsJHEH2基因被成功沉默。MsJHEH2基因表達(dá)量在處理后的3～24 h均有不同程度的下降，沉默效率分別為32.60%、64.86%、43.88%和15.36%，在6 h時(shí)干擾效果最好。在處理48 h后無干擾效果，72 h后，MsJHEH2基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，但與對(duì)照差異不顯著（圖7）。

圖7 RNAi對(duì)黏蟲MsJHEH2基因表達(dá)的影響Fig. 7 MsJHEH2 expression after treated with RNAi

2.5.2 RNA干擾對(duì)保幼激素含量的影響 RNA干擾后，隨著MsJHEH2基因表達(dá)量的降低，不同時(shí)間內(nèi)黏蟲體內(nèi)保幼激素含量與對(duì)照相比均有明顯上調(diào)，分別為對(duì)照的1.51、1.58、1.52、1.39、1.36、1.41和1.38倍，且差異均顯著（圖8）。

圖8 RNAi對(duì)黏蟲體內(nèi)保幼激素含量的影響Fig. 8 Effects of juvenile hormone content in M. separata treated with RNAi

2.5.3MsJHEH2基因生物功能研究 為探究MsJHEH2基因的生物學(xué)功能，對(duì)RNA干擾后黏蟲生長發(fā)育情況進(jìn)行了觀察。黏蟲的體重在基因沉默后隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)出增長的趨勢(shì)，其中第5、6 d，體質(zhì)量增長最為明顯，均有顯著性差異（圖9）。

圖9 RNAi對(duì)黏蟲體質(zhì)量的影響Fig. 9 Effects of the M. separata weight treated with RNAi

RNA干擾后，隨著黏蟲體質(zhì)量增長的同時(shí)，黏蟲幼蟲的發(fā)育進(jìn)程雖然沒有顯著性變化，但化蛹率、羽化率均降低，羽化所需時(shí)間延長，前兩天羽化率差異顯著，4 d后羽化率未發(fā)生變化（表2，3）。

表2 不同處理下黏蟲的幼蟲發(fā)育歷期Table 2 Developmental duration of M. separata under different treatments

表3 不同處理下黏蟲生長發(fā)育參數(shù)Table 3 Growth and development parameters of M. separata under different treatments

3 討論

保幼激素降解酶對(duì)保幼激素滴度的調(diào)節(jié)被認(rèn)為是昆蟲正常發(fā)育的關(guān)鍵。目前對(duì)于保幼激素降解酶的研究主要集中在JHE上，而對(duì)JHEH的研究較少。JHEH是保幼激素代謝途徑中必不可少的，在保幼激素代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[27]，JHEH在黏蟲中的表達(dá)情況和功能意義也有待進(jìn)一步闡明。通過對(duì)黏蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索比對(duì)以及序列驗(yàn)證，得到1條包含完整開放閱讀框序列的保幼激素環(huán)氧水解酶基因cDNA序列MsJHEH2，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。MsJHEH2保守區(qū)域與其他昆蟲一樣具有真核生物環(huán)氧水解酶的典型結(jié)構(gòu)特征，對(duì)近源物種進(jìn)行同源比較，通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，黏蟲保幼激素環(huán)氧水解酶MsJHEH2與同屬鱗翅目夜蛾科草地貪夜蛾和斜紋夜蛾中保幼激素環(huán)氧水解酶聚類到同一分支，說明其進(jìn)化關(guān)系相近。MsJHEH2在黏蟲各齡期與各組織中均有表達(dá)，在蛹期和中腸中表達(dá)量最高，預(yù)蛹、體壁和脂肪體中較高，這一結(jié)果與蟋蟀中的研究結(jié)果相似[28]，表明了其在黏蟲不同時(shí)期和不同器官內(nèi)對(duì)JH的不同代謝作用，另一方面，各組織中MsJHEH2表達(dá)量的不同也可能是MsJHEH2組織特異性調(diào)節(jié)JH水平的重要因素。

保幼激素類似物烯蟲酯作為一種新型生物殺蟲劑有較高的生物安全性和環(huán)境安全性[29,30]，本研究使用不同濃度梯度烯蟲酯對(duì)黏蟲處理后發(fā)現(xiàn)，JHA對(duì)MsJHEH2基因表達(dá)量有促進(jìn)作用，由此可以推測(cè)在一定濃度范圍內(nèi)的保幼激素類似物處理后，昆蟲體內(nèi)保幼激素升高，為了維持體內(nèi)的激素平衡，黏蟲體內(nèi)的保幼激素代謝酶活性增強(qiáng)來降解多余的保幼激素類似物有關(guān)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了MsJHEH2參與了黏蟲體內(nèi)保幼激素的代謝過程，表明保幼激素對(duì)黏蟲生長發(fā)育的調(diào)控作用，為使用保幼激素防治黏蟲提供理論基礎(chǔ)。

目前，RNA干擾是昆蟲基因功能研究領(lǐng)域的一項(xiàng)廣泛應(yīng)用的技術(shù)方法，特別是在昆蟲靶基因功能研究中非常高效可靠[31]。通過RNA干擾技術(shù)沉默保幼激素環(huán)氧水解酶基因后，綠盲蝽若蟲的存活率顯著降低，并出現(xiàn)蛻皮阻滯，從而達(dá)到防治半翅目綠盲蝽的目的[27]；RNA干擾褐飛虱保幼激素環(huán)氧水解酶會(huì)影響其短翅的形成[32]，這些試驗(yàn)均通過RNA干擾技術(shù)證實(shí)了JHEH基因?qū)ハx生長發(fā)育有著重要的調(diào)控作用。本研究為進(jìn)一步明確基因MsJHEH2在黏蟲生長發(fā)育中的作用，利用RNA干擾技術(shù)使MsJHEH2基因沉默，對(duì)其進(jìn)行生物功能研究。結(jié)果顯示，RNAi介導(dǎo)的MsJHEH2基因沉默顯著降低了基因的表達(dá)量，導(dǎo)致黏蟲體內(nèi)保幼激素含量顯著增加，意味著MsJHEH2介導(dǎo)的 JH降解可能參與下調(diào)黏蟲體內(nèi)的 JH含量。干擾MsJHEH2基因后，對(duì)黏蟲無明顯的致死作用，且其發(fā)育歷期也沒有顯著變化，推測(cè)由于JH降解是一個(gè)及其復(fù)雜過程，其代謝受多種酶共同調(diào)控，且黏蟲體內(nèi)含有多條保幼激素環(huán)氧水解酶基因，本試驗(yàn)對(duì)一條基因進(jìn)行干擾后雖然使JH滴度一定程度上升，但并未逆轉(zhuǎn)其幼蟲發(fā)育歷期。另一方面，RNAi后，導(dǎo)致其蛹?xì)v期延長，羽化率降低，因此推測(cè)MsJHEH2也可能在成蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這需要進(jìn)一步研究以驗(yàn)證這一假設(shè)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾黏蟲MsJHEH2基因的表達(dá)后，黏蟲體內(nèi)JH滴度顯著上升并抑制其化蛹及羽化，說明MsJHEH2能夠通過調(diào)節(jié)保幼激素含量來調(diào)控其正常的生長發(fā)育，研究結(jié)果為保幼激素環(huán)氧水解酶的表達(dá)情況和功能研究提供了重要理論依據(jù)，為達(dá)到通過分子生物學(xué)手段防治害蟲、針對(duì)黏蟲保幼激素代謝途徑的新型殺蟲劑的開發(fā)及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。