孫志廣 王寶祥 周振玲 方 磊 遲 銘 李景芳 劉金波 Bello Babatunde Kazeem 徐大勇

連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 / 江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇連云港 222006

水稻是世界上最重要的糧食作物之一, 水稻的穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)事關(guān)全球的糧食安全[1-3]。在我國(guó), 傳統(tǒng)的移栽種植模式在長(zhǎng)時(shí)間里為我國(guó)糧食增產(chǎn)、農(nóng)民增收發(fā)揮了十分重要的作用[4], 但是隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化的有序推進(jìn), 農(nóng)村勞動(dòng)力大量減少, 插秧期間對(duì)勞動(dòng)力的高需求阻礙著傳統(tǒng)移栽模式的進(jìn)行。與傳統(tǒng)移栽模式相比, 直播稻整地用水量少, 連續(xù)淹水天數(shù)少、對(duì)灌溉水利用效率高, 而且便于機(jī)械化操作[5-7]。在此背景下, 隨著適宜新品種的育成和栽培技術(shù)的進(jìn)步, 資源和勞動(dòng)力節(jié)約型的輕簡(jiǎn)栽培方式—直播稻得到了較大的發(fā)展[8-9]。

出苗率低是水稻直播中面臨的一個(gè)主要問題,當(dāng)種子被水淹沒時(shí), 由于氧氣濃度急劇降低, 種子有氧呼吸受到嚴(yán)重抑制, 導(dǎo)致出苗率顯著下降[10]。因此, 在淹水條件下, 選擇出苗能力好的耐淹性水稻品種將在直播稻安全生產(chǎn)中起到十分重要的作用。已有研究表明, 在低氧條件下萌發(fā)的水稻種子胚芽鞘長(zhǎng)度與耐淹成苗率呈極顯著的正相關(guān)[11-14]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展, 前人以胚芽鞘長(zhǎng)度為指標(biāo), 利用多種遺傳群體定位到多個(gè)萌發(fā)耐淹性QTL, 侯名語等[11]以水淹脅迫下暗發(fā)芽5 d 后的胚芽鞘長(zhǎng)為指標(biāo), 評(píng)價(jià)了359 份水稻品種的耐低氧發(fā)芽能力, 其中11%粳稻品種芽鞘長(zhǎng)度超過3.0 cm,而芽鞘長(zhǎng)度超過3.0 cm 秈稻品種僅占2%, 其認(rèn)為秈粳稻在耐低氧發(fā)芽能力方面存在差異。隨后其利用Kinmaze/DV85 RIL 群體, 在水稻1 號(hào)、2 號(hào)、5號(hào)和7 號(hào)染色體上共檢測(cè)到5 個(gè)低氧發(fā)芽相關(guān)QTL位點(diǎn), 可解釋表型變異為 10.5%～19.6%。陳孫祿等[15]通過對(duì)256 份水稻核心種質(zhì)進(jìn)行萌發(fā)耐淹性評(píng)估, 認(rèn)為秈粳稻的萌發(fā)耐淹性差異并不顯著, 與侯名語的結(jié)果不一致, 這可能是兩者所用試驗(yàn)材料和方法不同造成的。隨后其利用R0380/RP2334 回交自交系群體在水稻2 號(hào)、3 號(hào)、8 號(hào)染色體上檢測(cè)到4 個(gè)QTL, 貢獻(xiàn)率為9.37%～17.34%。Jiang 等[16]利用USSR5/N22 F2分離群體在水稻5 號(hào)和11 號(hào)染色體上檢測(cè)到 2 個(gè)萌發(fā)耐淹性 QTL, 貢獻(xiàn)率為10.99%～15.51%。然而以上試驗(yàn)多是在直接淹水脅迫下進(jìn)行的, 為了更準(zhǔn)確的模擬大田淹水環(huán)境下種子的低氧萌發(fā)狀態(tài), 本研究采用土壤介質(zhì)下的種子萌發(fā)耐淹性鑒定方法, 以胚芽鞘長(zhǎng)度為指標(biāo)進(jìn)行萌發(fā)耐淹性種質(zhì)資源篩選, 并進(jìn)一步構(gòu)建分離群體挖掘萌發(fā)耐低氧 QTL, 為培育耐淹萌發(fā)能力強(qiáng)的水稻新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 種質(zhì)資源

供試材料包括192 份水稻種質(zhì)資源, 其中191份為粳稻品種, 來自我國(guó)江蘇、安徽、河南、山東、上海等地區(qū), 1 份為秈型常規(guī)水稻黃莉占, 來自廣東省。定位群體來自以連粳15 號(hào)(Lianjing 15, LJ15)為父本, 黃莉占(Huanglizhan, HLZ)為母本構(gòu)建的F2:3分離群體, 該群體包含120 個(gè)家系。為減少種子休眠帶來的影響, 所有供試材料均在50℃高溫條件下處理7 d 以打破種子休眠。

1.2 試驗(yàn)方法

模擬大田萌發(fā)耐淹鑒定: 每品種或家系挑選健康、飽滿和均一的種子90 粒, 分3 次重復(fù), 在2%H2O2中滅菌15 min, 隨后用純水沖洗5 次, 浸種48 h 后, 每重復(fù)挑選20 粒吸足水分的種子, 播種于含有50 個(gè)方孔的秧盤中, 秧盤中盛滿細(xì)土, 播種深度1 cm, 方孔規(guī)格為5.5 cm × 5.5 cm × 5.0 cm, 每個(gè)方孔底部均有直徑為0.8 cm 的小圓孔, 以便排水,秧盤置于57 cm × 38 cm × 9 cm 規(guī)格的周轉(zhuǎn)箱中,隨后向周轉(zhuǎn)箱中注入純水至水面距離土壤表面5 cm,每天注水以保持此高度不變, 以萌發(fā)7 d 的胚芽鞘長(zhǎng)度(coleoptile length, CL)作為萌發(fā)耐淹性的調(diào)查指標(biāo), 每重復(fù)隨機(jī)取12 粒種子測(cè)量胚芽鞘長(zhǎng)度, 精確到1 mm。隨機(jī)區(qū)組排列, 剔除極大值和極小值后,取3 次胚芽鞘長(zhǎng)度平均值作為表型值進(jìn)行品種比較分析、遺傳分析和QTL 檢測(cè)。

梯度試驗(yàn): 分別設(shè)置9 個(gè)不同的淹水深度對(duì)連粳15 號(hào)和黃莉占進(jìn)行萌發(fā)耐淹性測(cè)試, 水深分別為10、30、50、70、90、110、130、150 和200 mm, 其余步驟同上。

以上試驗(yàn)均在溫室中進(jìn)行, 溫度: (26±2)℃,光∶暗 = 14∶10, 相對(duì)濕度80%左右。

1.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及QTL 分析

根據(jù)連粳15 號(hào)/黃莉占F2:3分離群體的分子數(shù)據(jù),利用 Mapmaker/EXP version 3.0 軟件(http://www.softpedia.com/get/Science-CAD/MapMaker.shtml) 構(gòu)建分子連鎖圖譜, 運(yùn)用Kosambi 函數(shù)將重組頻率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(cM), 隨后結(jié)合表型數(shù)據(jù), 利用Windows QTL Cartographer version 2.5 軟件(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm) 以復(fù)合區(qū)間作圖的方法進(jìn)行QTL 檢測(cè), 以LOD 值3.0 作為閾值判定QTL 是否存在, 同時(shí)利用該軟件進(jìn)行各QTL 的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)值的計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和頻數(shù)分布直方圖的繪制, SPSS 18.0 軟件進(jìn)行方差、多重比較分析和KS-檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)耐淹性種質(zhì)資源篩選

以萌發(fā)7 d 的胚芽鞘長(zhǎng)為指標(biāo), 本研究對(duì)來自不同年代和地區(qū)的191 份粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行萌發(fā)耐淹能力測(cè)試, 結(jié)果見附表1, 191 份種質(zhì)資源胚芽鞘長(zhǎng)頻數(shù)分布直方圖呈偏態(tài)分布的特點(diǎn)(圖1-A), 該群體的胚芽鞘長(zhǎng)的變化范圍為0～34.6 mm, 變異系數(shù)為21.8%, 表明這些種質(zhì)資源在萌發(fā)耐淹性上具有廣泛的遺傳多樣性。群體胚芽鞘長(zhǎng)平均值為24.1 mm,其中胚芽鞘長(zhǎng)度小于20 mm 種質(zhì)資源總共有19 份,總占比9.9%, 處于20～25 mm 之間的品種最多, 有90 份, 占比47.1%, 其次為25～30 mm, 有67 份, 占比35.1%, 其中 >30 mm 品種有12 個(gè)(表1), 占比6.3%, 這些種質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐低氧萌發(fā)能力, 可作為親本材料進(jìn)行萌發(fā)耐低氧新品種的培育。其中連云港地區(qū)的半野生稻種質(zhì)資源 穞稻表現(xiàn)最好, 胚芽鞘長(zhǎng) 34.6 mm, 其次為連粳 15 號(hào), 胚芽鞘長(zhǎng)34.2 mm。值得注意的是, 連粳15 號(hào)(連粳7032/連粳446)的親本之一連粳446也是由 穞稻與連粳3 號(hào)的雜交后代中選育而來, 推測(cè)連粳15 號(hào)的萌發(fā)耐淹性大多來自 穞稻, 因此, 應(yīng)加大力度深入挖掘野生稻種的有利基因以增強(qiáng)水稻品種對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗性。

2.2 不同年代種質(zhì)資源萌發(fā)耐淹性比較分析

根據(jù)品種審定年份將83 份種質(zhì)資源按照5 年一個(gè)階段劃分為6 組, 分別為1990 年前、1991—1995 年、1996—2000 年、2001—2005 年、2006—2010 年和2010年后, 通過萌發(fā)耐淹性鑒定, 6 個(gè)時(shí)間段品種的平均胚芽鞘長(zhǎng)分別為24.8、24.7、25.3、26.7、25.4 和28.8 mm(圖1-B), 經(jīng)過多重比較分析發(fā)現(xiàn), 前5 個(gè)時(shí)間段, 品種之間的胚芽鞘長(zhǎng)沒有顯著性差異, 但均與2010 年以后品種的胚芽鞘長(zhǎng)達(dá)到顯著性差異, 這表明育種家們已開始加強(qiáng)對(duì)萌發(fā)耐淹性品種的選育。

表1 12 份萌發(fā)耐淹性強(qiáng)的種質(zhì)資源Table 1 Top 12 germplasm resources with high germinability under submerged condition

2.3 連粳15 號(hào)萌發(fā)耐淹性驗(yàn)證

通過對(duì)191 份種質(zhì)資源進(jìn)行篩選鑒定, 粳稻品種連粳15 號(hào)在淹水脅迫下的胚芽鞘長(zhǎng)為34.2 mm,表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐低氧發(fā)芽力, 為了驗(yàn)證該表型,我們重新對(duì)其進(jìn)行鑒定, 連粳 15 號(hào)胚芽鞘長(zhǎng)為33.1 mm, 秈稻品種黃莉占胚芽鞘長(zhǎng)為8.6 mm, 顯著低于連粳15 號(hào)(圖2-A, B); 同時(shí), 梯度試驗(yàn)表明, 在水深10 mm 時(shí), 連粳15 號(hào)與黃莉占的胚芽鞘長(zhǎng)無顯著性差異, 因?yàn)榇藭r(shí)淹水深度較淺, 2 個(gè)品種的胚芽鞘均能很快伸出水面接觸到氧氣, 完成正常生長(zhǎng), 而在其他淹水處理下, 連粳15 號(hào)的胚芽鞘長(zhǎng)均顯著高于黃莉占(圖2-C)。因此, 連粳15 號(hào)和黃莉占可作為理想的材料進(jìn)行萌發(fā)耐淹性QTL 檢測(cè)。

2.4 萌發(fā)耐淹性QTL 檢測(cè)

利用512 對(duì)分布于12 條水稻染色體上的SSR(simple sequence repeat, SSR)標(biāo)記進(jìn)行分離群體雙親間的多態(tài)性分析, 其中在連粳15 號(hào)與黃莉占之間呈現(xiàn)良好多態(tài)性的SSR 標(biāo)記共有146 對(duì), 占所有檢測(cè)標(biāo)記的28.5%, 隨后利用這些標(biāo)記構(gòu)建連粳15 號(hào)/黃莉占 F2:3群體的分子連鎖圖譜, 圖譜全長(zhǎng)為1262.4 cM, 標(biāo)記之間的平均遺傳距離為8.6 cM, 符合QTL 檢測(cè)要求。

為了檢測(cè)萌發(fā)耐淹性QTL, 本研究于2018年對(duì)連粳15號(hào)、黃莉占及其F2:3群體進(jìn)行萌發(fā)耐淹性鑒定, 連粳15 號(hào)和黃莉占的胚芽鞘長(zhǎng)分別為31.9 mm 和5.0 mm, 兩者之間存在極顯著差異(圖3-A), 連粳15 號(hào)/黃莉占 F2:3分離群體胚芽鞘長(zhǎng)的變化范圍為0～31.5 mm, 在20～25 mm 處出現(xiàn)1 個(gè)峰值, 呈典型的正態(tài)分布特征(KS-檢驗(yàn),P> 0.05), 表明該群體的萌發(fā)耐淹性由多個(gè)QTL 共同控制。以平均胚芽鞘長(zhǎng)為表型值, 利用Windows QTL Cartographer 2.5 軟件采用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行分析, 在水稻1 號(hào)、3 號(hào)、9 號(hào)和10 號(hào)染色體上各檢測(cè)到1 個(gè)QTL, 分別命名為qGS1、qGS3、qGS9和qGS10, 分別坐落于標(biāo)記RM11307～RM7341、RM15283～RM5626、RM24085～RM24271 和RM474～RM6404 之間, LOD 值分別為6.7、3.6、3.3 和6.1, 貢獻(xiàn)率分別為24.0%、14.7%、11.7%和20.5%, 共解釋表型變異的70.9% (表2 和圖4), 加性效應(yīng)分析表明, 這些增強(qiáng)萌發(fā)耐淹性的QTL 均來自粳稻品種連粳15 號(hào)。

2.5 萌發(fā)耐淹性QTL 的驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證以上QTL 的真實(shí)性, 本研究于2019 年再次對(duì)120 個(gè)連粳15 號(hào)/黃莉占F2:3家系及其雙親進(jìn)行表型鑒定(圖3-B), 結(jié)合分子連鎖圖譜,利用Windows QTL Cartographer 2.5 軟件對(duì)以上位點(diǎn)進(jìn)行了重新檢測(cè), 結(jié)果表明,qGS1、qGS3和qGS10均能夠被重新檢測(cè)到, LOD 值分別為5.1、3.0 和5.6, 貢獻(xiàn)率分別為19.2%、12.6%和19.1%(表2 和圖4), 以上結(jié)果證明這些QTL 是穩(wěn)定表達(dá)真實(shí)存在的。

表2 連粳15 號(hào)/黃莉占F2:3 群體中檢測(cè)到的萌發(fā)耐淹性QTLTable 2 QTLs for germinability under submerged condition (GS) detected in the LJ15/HLZ F2:3 population

3 討論

水稻直播作為一種輕簡(jiǎn)、高效、節(jié)水、省工的栽培方式, 越來越受到種植者的歡迎[17]。然而, 在淹水脅迫下, 特別是當(dāng)種子播在較深土層時(shí), 由于氧氣濃度過低導(dǎo)致出苗率急劇下降, 嚴(yán)重制約著直播稻的發(fā)展[18]。多項(xiàng)研究表明, 種子萌發(fā)耐淹性存在著品種間差異[19-21], 選擇低氧萌發(fā)能力強(qiáng)的稻種是直播稻生產(chǎn)中提高出苗率的一個(gè)關(guān)鍵問題。因此,篩選萌發(fā)耐淹性強(qiáng)的種質(zhì)資源, 挖掘低氧耐受基因,并解析其低氧適應(yīng)機(jī)制已迫在眉睫。本研究通過對(duì)191 份粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行萌發(fā)耐淹性鑒定, 發(fā)現(xiàn)該性狀的頻率分布直方圖呈現(xiàn)偏態(tài)分布特點(diǎn), 說明該性狀受到育種家的人工選擇, 其中胚芽鞘長(zhǎng)為20～25 mm 的種質(zhì)資源占比最多, 達(dá)到47.1%, 該群體變異系數(shù)為21.8%, 表明粳稻品種的萌發(fā)耐淹性存在廣泛的遺傳變異, 與前人研究結(jié)果一致[12,16,22]。經(jīng)過篩選, 最終獲得12 份萌發(fā)耐淹性強(qiáng)的水稻種質(zhì)(胚芽鞘長(zhǎng)>30 mm) (表1), 這些資源可作為親本材料用來選育萌發(fā)耐低氧的水稻品種。

通過不同年代品種間的比較分析, 我們發(fā)現(xiàn)2010年后審定的品種平均胚芽鞘長(zhǎng)度為28.8 mm,相對(duì)于前期品種, 在低氧脅迫下的萌發(fā)能力顯著性提高, 這表明隨著耕作栽培制度的改變, 育種家們?yōu)榱诉m應(yīng)以直播稻為主的輕簡(jiǎn)栽培的需要, 已開始加強(qiáng)對(duì)品種的萌發(fā)耐淹性狀的選擇。同時(shí)我們也比較了不同種植區(qū)域種質(zhì)資源的耐淹萌發(fā)能力, 發(fā)現(xiàn)并沒有達(dá)到顯著的地域性差異, 這說明在不同區(qū)域環(huán)境條件下, 萌發(fā)耐淹性是水稻在馴化擴(kuò)散過程中的一個(gè)基本特性。

前人研究已經(jīng)表明, 萌發(fā)耐淹性是由多基因控制的數(shù)量性狀[14,16,23-24], 本研究通過資源鑒定, 發(fā)現(xiàn)粳稻品種連粳15號(hào)表現(xiàn)出較強(qiáng)的低氧萌發(fā)能力,利用其與秈稻品種黃莉占的F2:3群體共檢測(cè)到4個(gè)QTL, 再次驗(yàn)證了該觀點(diǎn)。孫凱等[14]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析, 在水稻3 號(hào)、4 號(hào)、5 號(hào)、6 號(hào)、8 號(hào)、10 號(hào)和11 號(hào)染色體上共檢測(cè)到15 個(gè)與胚芽鞘長(zhǎng)度顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn), 其中位于3 號(hào)染色體上的位點(diǎn)在本研究檢測(cè)位點(diǎn)qGS3兩端標(biāo)記區(qū)間內(nèi), 這2 個(gè)QTL很可能是同一個(gè)位點(diǎn), 隨后其通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)區(qū)間內(nèi)基因Os03g0592500對(duì)氧氣處理敏感,該基因編碼一個(gè)葉綠素a-b結(jié)合蛋白, 并推測(cè)該基因?qū)λ痉N子耐淹生長(zhǎng)具有正調(diào)控作用。王洋等[24]利用粳稻Nipponbare 與秈稻Kasalath BIL 群體也在水稻3 號(hào)染色體上檢測(cè)到1 個(gè)耐低氧發(fā)芽能力QTL,qSAT-3-B, 與qGS3的物理位置十分接近, 是否為同一個(gè)QTL 尚需進(jìn)一步確認(rèn)。目前前人已克隆2 個(gè)耐淹基因,CIPK15和Sub1, 其中,CIPK15在種子萌發(fā)階段通過糖信號(hào)途徑產(chǎn)生更多能量促使胚芽鞘快速生長(zhǎng)以應(yīng)對(duì)淹水脅迫[25], 而Sub1則通過調(diào)節(jié)乙烯和赤霉素介導(dǎo)的反應(yīng), 抑制水稻淹水期的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),以節(jié)約能量促進(jìn)去淹沒后的恢復(fù)生長(zhǎng)來達(dá)到提高水稻耐淹性的目的[26]。通過比對(duì)分析, 這2 個(gè)基因均在水稻9 號(hào)染色體上著絲粒附近, 與本研究檢測(cè)到的qGS9在染色體上的距離超過1700 kb, 三者為不同的基因。王洋等[24]也在水稻9 號(hào)染色體上檢測(cè)到1 個(gè)QTL,qSAT-9-B, 貢獻(xiàn)率為9.5%, 與本研究檢測(cè)到的qGS9有部分重疊區(qū)域, 可能為同一個(gè)QTL, 值得注意的是,qGS9未在連續(xù)的2 年試驗(yàn)中重復(fù)檢測(cè)到, 這可能是由于qGS9本身效應(yīng)較小, 且受到環(huán)境影響, 表達(dá)不穩(wěn)定造成。通過比對(duì)分析, 本研究檢測(cè)到的位于水稻第1 和10 染色體上的QTL, qGS1 和qGS10, 與前人報(bào)道萌發(fā)耐淹性QTL 沒有重疊區(qū)域,是2 個(gè)新的萌發(fā)耐淹性QTL 位點(diǎn), 而且這2 個(gè)QTL都能被重復(fù)檢測(cè)到, 2 次檢測(cè)中LOD 值均大于5, 分別解釋表型變異的19.2～24.0%, 19.1～20.5%, 是穩(wěn)定表達(dá)的QTL。因此, 利用與之緊密連鎖的分子標(biāo)記,通過分子標(biāo)記輔助選擇的手段聚合這些萌發(fā)耐淹性QTL, 將有助于加快培育耐低氧萌發(fā)水稻新品種。

4 結(jié)論

從191 份粳稻中篩選獲得12 份萌發(fā)耐淹性強(qiáng)的種質(zhì)資源, 并利用連粳15 號(hào)/黃莉占F2:3群體, 共檢測(cè)到4 個(gè)萌發(fā)耐淹性QTL,qGS1、qGS3、qGS9和qGS10, 分別位于水稻1 號(hào)、3 號(hào)、9 號(hào)和10 號(hào)染色體上, 貢獻(xiàn)率分別為24.0%、14.7%、11.7%和20.5%,其中qGS1和qGS10真實(shí)可靠, 且貢獻(xiàn)率較高, 這些QTL 的定位為進(jìn)一步開展相關(guān)基因的圖位克隆和分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

附表1 191 份種質(zhì)資源的萌發(fā)耐淹性表現(xiàn)Table S1 Germinability of 191 germplasm resources under submerged condition

(續(xù)附表1)

(續(xù)附表1)