楊新杰，賴艷瓊，李秋旸，張艷麗，王紅斌，龐鵬飛，楊文榮

（1.云南民族大學(xué)生物基材料綠色制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,昆明650500；2.迪肯大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,吉朗3217,澳大利亞）

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是富營養(yǎng)化淡水水體中最常見的藻類毒素，是湖泊藍藻產(chǎn)生的一類肽類毒素，由于其毒性大、分布廣且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，成為水環(huán)境中的潛在危害物質(zhì)，對公眾健康和水體環(huán)境構(gòu)成巨大威脅［1］.微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR，MC-LR）是一種環(huán)狀七肽肝毒素，是目前已知毒性最強、危害最大且最為常見的一種藍藻毒素［2］.微囊藻毒素-LR含有5種非蛋白原和2個可變位置的亮氨酸（L）和精氨酸（R）（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見本文支持信息圖S1），是最早被化學(xué)鑒定和廣泛研究的微囊藻毒素［3，4］.長期接觸微囊藻毒素-LR污染的飲用水或農(nóng)產(chǎn)品可導(dǎo)致哺乳動物肝臟的損傷，并通過抑制蛋白磷酸酶1和2A（PP1和PP2A）的活性而促進腫瘤的發(fā)生［5，6］.由于其毒性強且存在廣泛，1998年世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定飲用水中微囊藻毒素-LR的可接受上限水平為1μg/L［7］.因此，開發(fā)一種簡單、靈敏、快速且可靠的檢測低濃度微囊藻毒素-LR的分析方法，對保證水質(zhì)和保護人類健康具有重要意義.

迄今，人們已經(jīng)開發(fā)出多種檢測微囊藻毒素-LR的分析技術(shù)，常見的有高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）［8，9］、蛋白磷酸酶抑制法（PPIA）［10，11］、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［12~14］及化學(xué)與生物傳感器法［15~25］.雖然這些檢測技術(shù)和方法的準確度和靈敏度較高，但需要昂貴的儀器、訓(xùn)練有素的人員和耗時的操作過程，意味著其應(yīng)用通常局限于資源充足和集中的實驗室.因此，有必要建立一種簡單、靈敏且特異的微囊藻毒素-LR的檢測方法.近年來，基于抗原和抗體之間高特異性和有效識別的熒光分析技術(shù)引起了研究者的關(guān)注，構(gòu)建出了不同類型的熒光傳感分析技術(shù)并用于微囊藻毒素-LR的檢測［26~29］.熒光金屬納米團簇（Metal nanoclusters）是一類新型的發(fā)光納米材料，由幾個到幾百個金屬原子組成，是介于金屬原子和金屬納米顆粒之間的過渡形態(tài)［30］.由于其尺寸接近電子的費米波長，金屬納米團簇具有獨特的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，如優(yōu)異的光致發(fā)光和良好的水溶性等.與傳統(tǒng)的熒光有機染料和半導(dǎo)體量子點相比，熒光金屬納米團簇具有毒性小、發(fā)光強度高、抗光漂白性能強及光學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)點，在生物傳感、催化、標記、成像和治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［31~33］.銀納米簇（Silver nanoclusters）是一種具有熒光的納米團簇［34］，由于其相對簡便的制備方法、超小的尺寸、較強的熒光及熒光量子產(chǎn)率和高穩(wěn)定性，成為目前備受關(guān)注和研究最廣泛的金屬納米簇，已被用于細胞成像、離子檢測和化學(xué)傳感等領(lǐng)域［35~38］.與傳統(tǒng)的有機熒光染料和有毒的熒光量子點相比，銀納米簇具有毒性低、熒光性能穩(wěn)定、生物相容性好、發(fā)射波長可調(diào)和易于制備等優(yōu)點，廣泛用于熒光傳感分析中［34］.

本文以微囊藻毒素-LR適體單鏈及其互補鏈形成的環(huán)狀DNA為模板，制備了環(huán)狀DNA-銀納米簇（Circular DNA-AgNCs）熒光探針，構(gòu)建了一種無酶無標記檢測微囊藻毒素-LR的熒光傳感分析新方法，實現(xiàn)了對微囊藻毒素-LR的快速和超靈敏檢測.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR，編號：PN 300632）、微囊藻毒素-RR（Microcystin-RR，編號：PN 300636）和微囊藻毒素-LA（Microcystin-LA，編號：PN 300628）均購于上海普邁生物科技有限公司；硝酸銀（AgNO3）和硼氫化鈉（NaBH4）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗設(shè)計的寡核苷酸鏈由寶生物工程（大連）有限公司合成并純化，堿基序列見表1；所用試劑均為分析純，實驗用水為滅菌去離子水.

Table 1 Sequence of designed DNA

F-7000型熒光光譜儀（FL，日本株式會社日立制作所）；TU-1950型紫外-可見分光光度計（UV-Vis，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；JEM-2100型透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）；WFH-203B型暗箱式三用紫外分析儀（上海馳唐電子有限公司）；SC805型全自動凝膠成像系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）.

1.2 環(huán)狀DNA?AgNCs的制備

參照改進后的文獻［39，40］方法制備環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs熒光探針.將0.5μL 200μmol/L Apt和0.5μL 200μmol/L cDNA與25μL 50 mmol/L磷酸鹽（PBS）緩沖液（pH=7.4）混合，于金屬浴中95℃加熱5 min，迅速冰水浴淬火5 min，35℃下雜交反應(yīng)3 h；加入68μL去離子水稀釋后，加入3μL 400μmol/L AgNO3，室溫避光反應(yīng)30 min；再緩慢加入3μL 400μmol/L NaBH4，4℃避光反應(yīng)4 h，得到環(huán)狀DNA-AgNCs.cDNA-AgNCs的制備方法同上，不加入cDNA，不需要雜交反應(yīng).

1.3 凝膠電泳實驗

在垂直電泳板中注入7 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的非變性凝膠［含30%（質(zhì)量分數(shù)）丙烯酰胺、H2O、5×Tris-硼酸（TBE）緩沖液（pH=8）、10%（質(zhì)量分數(shù)）過硫酸銨和N，N，N'，N'-四甲基二乙胺（TEMED），體積比為50∶10∶15∶0.2∶0.02］，室溫下聚合至梳齒中出現(xiàn)2條折光線.取5μL 1μmol/L的不同DNA溶液，加入1 μL 6×DNA上樣緩沖液，混合均勻后，注入樣品孔，在1×TBE緩沖液中，于50 V下先預(yù)跑30 min，待DNA完全跑上膠后，調(diào)節(jié)電壓至100 V，再跑3 h.電泳結(jié)束后，將膠取下浸泡于3×Gene Ruler DNA Ladder溶液中30 min，最后在全自動凝膠成像系統(tǒng)中顯像.

1.4 微囊藻毒素?LR的檢測

將100μL環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs溶液加入到不同濃度的目標物MC-LR中，于35℃下孵育5 min，測定其熒光光譜.設(shè)置激發(fā)波長為555 nm，掃描570~700 nm范圍內(nèi)的光譜，掃描速率為250 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)置為5 nm.

實際水樣的測定：取3種不同水樣（自來水、河流水和湖水），用0.2μm的濾膜過濾，滅菌處理后，同上述方法測定MC-LR的濃度，并進行加標回收實驗.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光探針的檢測原理

環(huán)狀DNA-AgNCs熒光探針的制備及檢測MC-LR的原理如Scheme 1所示.實驗設(shè)計了2條寡核苷酸鏈，MC-LR適體鏈（Apt）和Apt的互補鏈（cDNA）.其中，cDNA的兩端［5'-端和3'-端，富含胞嘧啶（C），斜體部分］作為單鏈DNA模板用于合成AgNCs，中間部分分別與Apt兩端堿基互補（紅色標注，藍色標注）.cDNA與Apt雜交后，形成一種環(huán)狀雙鏈DNA結(jié)構(gòu)（見本文支持信息圖S2）.環(huán)狀雙鏈DNA外側(cè)未雜交的5'-端和3'-端富含胞嘧啶（C）作為單鏈DNA模板可用于合成AgNCs（DNA-AgNCs）.當存在目標物分子MC-LR時，由于MC-LR與環(huán)狀雙鏈DNA中的Apt高特異性和高親和力結(jié)合，導(dǎo)致環(huán)狀雙鏈DNA解體，釋放出的cDNA-AgNCs在610 nm處呈現(xiàn)強熒光.根據(jù)環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs熒光強度變化與目標分析物MC-LR濃度之間的關(guān)系，實現(xiàn)對目標物MC-LR的定量檢測.

Scheme 1 Schematic illustration of the detection principle for MC?LR based on circular DNA?AgNCs fluorescent probe

2.2 環(huán)狀雙鏈DNA?AgNCs的表征

由圖1（A）可見，DNA-AgNCs分散度較好，尺寸分布較為均勻，平均粒徑為2 nm左右，表明形成的環(huán)狀雙鏈DNA可用于合成DNA-AgNCs.圖1（B）為環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs的熒光光譜和UV-Vis光譜，其中譜線a為環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs的熒光激發(fā)光譜，激發(fā)波長為555 nm，譜線b為DNA-AgNCs的熒光發(fā)射光譜，發(fā)射波長為610 nm.在環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs的UV-Vis光譜中，555 nm處有一個強的特征吸收峰（譜線c），且與熒光激發(fā)峰對應(yīng).合成的環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs在365 nm紫外燈下呈現(xiàn)紅色熒光，在可見光下呈現(xiàn)無色（見本文支持信息圖S3），實驗結(jié)果表明已成功制備了環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs.

Fig.1 TEM image(A),fluorescent(a,b)and UV?Vis absorption(c)spectra(B)of circular DNA?AgNCs

2.3 熒光探針的可行性分析

為了驗證實驗的可行性，研究了環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs體系熒光強度在加入MC-LR前后的變化.由圖2可見，當不存在MC-LR時，環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs在610 nm處幾乎不產(chǎn)生熒光發(fā)射峰（譜線a）；當加入500μg/L MC-LR時，環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs的熒光強度顯著增強（譜線b）.結(jié)果表明，環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs可以作為熒光探針，根據(jù)探針熒光信號的增強實現(xiàn)對MC-LR的定量分析.

采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，進一步研究了環(huán)狀雙鏈DNA-AgNCs探針熒光強度改變的機理（見本文支持信息圖S4）.Apt不僅直接可以與cDNA雜交，還可以與cDNA-AgNCs中的cDNA雜交產(chǎn)生新的泳帶，當存在MC-LR時，由于MC-LR與環(huán)狀雙鏈DNA中的Apt結(jié)合，導(dǎo)致新泳帶的亮度降低（泳帶4和泳帶6），表明環(huán)狀雙鏈DNA解體，與上述探針的熒光強度增加相一致.

Fig.2 Fluorescent spectra of circular DNA?AgNCs in absence(a)and presence(b)of 500μg/L MC?LR at an excitation wavelength of 555 nm

2.4 實驗條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的熒光分析性能，對AgNCs合成條件、Apt與cDNA雜交條件和MC-LR檢測條件分別進行了優(yōu)化（見本文支持信息圖S5）.在AgNCs合成過程中，當n（DNA）∶n（AgNO3）∶n（NaBH4）=1∶12∶12、AgNO3反應(yīng)時間為30 min、NaBH4加入時間為4 h時，制備的AgNCs探針熒光強度均達到最大值［圖S5（A）~（C）］.隨著Apt與cDNA-AgNCs雜交時間的增加，體系熒光強度逐漸減小，3 h時基本達到穩(wěn)定［圖S5（D）］.雜交溫度為35℃時，Apt與cDNA-AgNCs雜交后，體系熒光強度變化最大［圖S5（E）］.熒光探針檢測目標物MC-LR時，隨著孵育時間的增加，熒光強度逐漸增大，50 min時基本趨于穩(wěn)定［圖S5（F）］.孵育溫度為35℃時，體系熒光強度變化最大［圖S5（G）］.因此，本實驗中Apt與cDNA-AgNCs雜交時間和雜交溫度分別選擇3 h和35℃，MC-LR與環(huán)狀DNA-AgNCs孵育時間和孵育溫度分別選擇50 min和35℃.

2.5 微囊藻毒素?LR的測定

Fig.3 Fluorescent response curves and calibration curve

在上述優(yōu)化實驗條件下，測定環(huán)狀DNA-AgNCs熒光探針對不同濃度MC-LR的熒光響應(yīng)（圖3）.由圖3（A）可見，隨著MC-LR濃度的增加（0，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，150，200，500μg/L），環(huán)狀DNA-AgNCs的熒光強度逐漸增大.環(huán)狀DNA-AgNCs探針的熒光強度與MC-LR濃度在0.005~500μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系［圖3（B）］，其線性方程為F=57.56lgc+198.12，檢出限（S/N=3）為1.7 ng/L，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9969.表S1（見本文支持信息）對比了本文工作與已報道工作檢測MC-LR的分析效能，由表S1可見，本文工作具有線性范圍寬和檢出限低的特點，且熒光探針具有制備簡單、無需熒光標記等優(yōu)點.

2.6 干擾實驗

為了評價環(huán)狀DNA-AgNCs熒光探針檢測MCLR的特異性和選擇性，考察了水體中MC-LR共存的2種異構(gòu)體（MC-RR和MC-LA）對熒光探針檢測的影響.由圖4可見，當MC-LR濃度為20μg/L時，5倍過量的MC-RR和MC-LA對熒光探針的測定干擾較小，表明制備的熒光探針具有良好的抗干擾能力和選擇性，可用于實際樣品的分析測定.

Fig.4 Anti?interferent experimental results of circular DNA?AgNCs fluorescent probe

2.7 實際樣品的測定

為了驗證該熒光探針對實際樣品中MC-LR檢測的可行性，選取3種水樣（自來水、河流水和湖水）作為實際樣品，采用加標回收法測定熒光響應(yīng)和回收率.水樣經(jīng)0.2μm的濾膜過濾，滅菌處理后，測定其對MC-LR的熒光響應(yīng)，測定結(jié)果如表S2（見本文支持信息）所示.該熒光探針測定實際水樣中MCLR的回收率為95.9%~108.5%，且相對標準偏差（RSD）為1.30%~4.15%，表明環(huán)狀DNA-AgNCs熒光探針對實際水樣中MC-LR的測定具有可行性.

綜上所述，本文以MC-LR適體單鏈及其互補鏈雜交形成的環(huán)狀DNA為模板，成功制備了環(huán)狀DNA-AgNCs無酶無標記熒光探針，用于MC-LR的傳感檢測.設(shè)計的互補鏈既可與MC-LR適體鏈雜交形成環(huán)狀DNA，又可作為模板用于AgNCs的合成.當存在目標物MC-LR時，MC-LR與環(huán)狀DNAAgNCs熒光探針中適體鏈高親和性和高特異性結(jié)合，導(dǎo)致環(huán)狀結(jié)構(gòu)解體，探針熒光強度增強.結(jié)果表明，制備的環(huán)狀DNA-AgNCs熒光探針可用于MC-LR的熒光傳感分析檢測.該法具有靈敏、無需任何標記和操作簡單等優(yōu)勢，為環(huán)境水樣中MC-LR的快速和準確測定提供了一種新的方法.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210471.