帥 蝶，趙美娟，陳丙年，王 力

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院,廈門361021；2.廈門大學(xué)醫(yī)院,廈門361005）

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）是一種同時(shí)具有單加氧酶和氧化酶活性的酶，這兩種活性都是由氧與活性位點(diǎn)上的2個(gè)銅原子（通常稱為CuA和CuB）結(jié)合而產(chǎn)生的.迄今，已經(jīng)研究了大量的酪氨酸酶，其廣泛存在于生物圈中，主要來源于植物［1，2］.酪氨酸酶在黑色素生成中發(fā)揮重要作用，酪氨酸酶的下調(diào)是開發(fā)黑色素抑制劑的最主要途徑［3~6］.黑色素的過度積累不僅是導(dǎo)致水果和蔬菜褐變的原因，也是導(dǎo)致色素沉著紊亂的原因.酪氨酸酶抑制劑可以通過抑制酶活性來調(diào)節(jié)黑色素的過度生成，被認(rèn)為是治療色素沉著障礙的有效方法.因此，酪氨酸酶抑制劑的研究與開發(fā)在食品保鮮、化妝品和藥物化學(xué)領(lǐng)域具有重要意義［6，7］.目前，酪氨酸酶抑制劑的相關(guān)研究集中在天然物質(zhì)的提取與有機(jī)物的合成，但是對(duì)于無機(jī)類抑制劑鮮有報(bào)道，而且缺乏系統(tǒng)的研究.

多金屬氧酸鹽（POMs）是由氧和早期過渡金屬縮合形成的金屬氧簇化合物［8］，其過渡金屬配體的數(shù)量和取代位置決定了其不斷變化的結(jié)構(gòu)和廣泛的性能［9~12］.這些分子由氧橋聯(lián)的具有最高氧化態(tài)（如Mo，W，V）的早期過渡金屬組成，它們是基于公共角度和公共邊緣的單面多面體的組合.從廣義上講，多金屬氧酸鹽包括同多酸和雜多酸，與同多酸相比，雜多酸具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和更好的多樣性［13，14］，因此也是研究的重點(diǎn).雜多酸豐富的結(jié)構(gòu)在化學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注，同時(shí)這種結(jié)構(gòu)的多樣性使其具有多種生物活性且毒副作用較低［15，16］.研究表明，多金屬氧酸鹽在抑菌［17，18］、抑酶［19，20］、抗癌［21］及抗病毒［22~24］等藥物化學(xué)領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用價(jià)值.邢蕊等［25］研究了2種不同的釩取代Keggin型多金屬氧酸鹽［Na4PMo11VO40和（HGly）4PMo11VO40］對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)二者均可抑制酪氨酸酶活性.

本文報(bào)道了4種過渡金屬釩取代的Keggin型磷鉬酸鹽Na5PMo10V2O40（PMo10V2），Na6PMo9V3O40·（PMo9V3），Na7PMo8V4O40（PMo8V4）和Na8PMo7V5O40（PMo7V5）的合成與表征.以4種多酸作為抑制劑，研究了其對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的影響，并通過分子模擬分析無機(jī)化合物和酶蛋白之間的結(jié)合模式；考察了4種多酸對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性和黑色素形成的抑制作用；以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基的清除率作為指標(biāo)評(píng)價(jià)了4種多酸的抗氧化效果，旨在為開發(fā)新型酪氨酸酶抑制劑提供依據(jù)，擴(kuò)大多金屬氧酸鹽在食品保鮮和藥物化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

RPMI 1640基本培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；一水合鉬酸鈉（Na2MoO4·H2O）、偏礬酸銨（NH4VO3）、磷酸（H3PO4）和十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）購(gòu)自廣東西隴化工股份有限公司；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)GEMINI公司；B16細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫上海碧賽生物科技有限公司；所用試劑均為分析純.

Lambda 265型紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis，美國(guó)Perkin Elmer公司）；Alpha型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，美國(guó)布魯克公司）；1374型生物安全柜（蘇州賽默飛世爾公司）；HERACELL Vois 160i型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；Synergy H1MF型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；TS100-F型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 樣品的制備參照文獻(xiàn)［26，27］方法合成4種Keggin型磷鉬酸鹽（PMo10V2，PMo9V3，PMo8V4和PMo7V5）.將Na2HPO4·12H2O，Na2MoO4·H2O和NH4VO3分別以摩爾比1∶10∶2，1∶9∶3，1∶8∶4和1∶7∶5溶解于400 mL超純水中，用濃硫酸調(diào)節(jié)溶液pH值為2.5，于80℃加熱回流6 h，緩慢冷卻至室溫，加入適量乙醚及硫酸萃??；收集下層的紅色油狀液體，揮發(fā)乙醚，并用超純水重結(jié)晶2次后得到純凈的晶體化合物PMo10V2，PMo9V3，PMo8V4和PMo7V5.

1.2.2 酶測(cè)活體系參照文獻(xiàn)［28，29］方法測(cè)定4種多酸的酪氨酸酶活性.將底物溶液［多巴（L-dopa）溶解于磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH=6.8）］，在30℃的恒溫水浴鍋中持續(xù)預(yù)熱30 min；將酪氨酸酶溶解于pH=6.8，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中.向96孔板中依次加入7 μL效應(yīng)物（分別溶解于DMSO中的PMo10V2，PMo9V3，PMo8V4和PMo7V5）、196 μL底物及7 μL酪氨酸酶溶液，快速混合均勻，于30℃恒溫反應(yīng)10 min［30］.使用酶標(biāo)儀測(cè)定混合物在475 nm處的吸光度值.每組實(shí)驗(yàn)設(shè)定5組平行.

1.2.3 多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制效果研究4種多酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制效果基于上述酶活性測(cè)定.以0.5 mmol/LL-dopa為底物，每種效應(yīng)物設(shè)定10~14個(gè)梯度濃度，酪氨酸酶溶液濃度為500 U/mL，測(cè)定相對(duì)剩余酶活性.以未添加效應(yīng)物的實(shí)驗(yàn)組為空白對(duì)照組.依據(jù)繪制的相對(duì)剩余酶活性與效應(yīng)物濃度間的函數(shù)關(guān)系曲線計(jì)算半抑制率（IC50，mmol/L）值，最終以IC50值表示效應(yīng)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制效果［31］.

1.2.4 多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理研究基于酶活性測(cè)定研究了4種多酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制機(jī)理.底物L(fēng)-dopa的濃度及添加量保持不變，酪氨酸酶濃度設(shè)置為100，200，300，400和500 U/mL，測(cè)定475 nm處的吸光度值.將酶促反應(yīng)速率作為酶活性的函數(shù)繪圖，根據(jù)得到的抑制曲線判斷效應(yīng)物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制機(jī)理.

眾所周知，地名分類是地名學(xué)理論任務(wù)之一，也是當(dāng)今地名規(guī)劃、地名管理、地名檔案管理和地名工具書編輯中的重要內(nèi)容?，F(xiàn)今地名分類有按地理實(shí)體性質(zhì)分類，有按地名形態(tài)分類，有按地名時(shí)間分類，有按地名音、行、義分類，而陳文按專名的性質(zhì)分類，是對(duì)地名分類的巨大貢獻(xiàn)，并為地名專名科學(xué)分類奠定了基礎(chǔ)。

1.2.5 多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制類型研究基于酶活性測(cè)定研究了4種多酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制類型.固定酪氨酸酶濃度為500 U/mL，改變L-dopa濃度，繪制Lineweaver-Burk類型圖，判斷4種多酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制類型.

1.2.6 分子對(duì)接研究為了進(jìn)一步研究效應(yīng)物與蘑菇酪氨酸酶之間的結(jié)合作用，采用Molecular Operating Environment（MOE 2008.10）軟件進(jìn)行分子對(duì)接模擬，并使用三維分子模擬軟件PyMOL 2.2.0進(jìn)一步處理.酪氨酸酶是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的氧化還原酶，廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物及人體內(nèi).目前，來自雙孢蘑菇的酪氨酸酶是酪氨酸酶的主要和廉價(jià)來源，與人類酪氨酸酶相比具有很高的相似性和同源性，作為篩選酪氨酸酶抑制劑和黑色素生成研究、酶催化反應(yīng)和酶抑制劑的結(jié)構(gòu)研究的模型系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用.從UniProt蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)（http：//www.uniprot.org/）下載酪氨酸酶的三維晶體結(jié)構(gòu)，選用PDB編碼為2Y9X的雙孢蘑菇酪氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)作為建模模板［32］.使用MOE軟件模型構(gòu)建工具生成4種多酸的三維結(jié)構(gòu).

構(gòu)建效應(yīng)物的三維結(jié)構(gòu)與蘑菇酪氨酸酶在同一個(gè)MOE界面打開，選擇Simulations-Dock程序?qū)⑴潴w化合物和酶蛋白分子進(jìn)行分子對(duì)接，使用London dG評(píng)分函數(shù)計(jì)算的結(jié)合自由能，最終計(jì)算得到多種評(píng)分函數(shù)（kJ/mol）.評(píng)分函數(shù)分?jǐn)?shù)越低表示結(jié)合得越穩(wěn)定［33］，通常選擇所有評(píng)分函數(shù)中的第一個(gè)作為最佳對(duì)接結(jié)果［34］.使用PyMOL軟件進(jìn)行圖像分析，突出顯示配體化合物與酶蛋白分子間的結(jié)合方式、作用氨基酸殘基.

1.2.7 黑色素形成的抑制作用設(shè)置培養(yǎng)箱條件為溫度37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞.用顯微鏡觀察，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部，用PBS緩沖液清洗（沿培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁加入）；用胰酶消化（輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰酶覆蓋細(xì)胞表面約15 s）；在顯微鏡下觀察細(xì)胞脫落情況，完全培養(yǎng)基終止消化；用移液管抽吸培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體，吹散細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h［35］.

采用相同的方法增養(yǎng)B16細(xì)胞，用MTT法研究B16細(xì)胞的存活率.完成培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度至1×105cell/mL.以180 μL/孔加入到96孔板中，過夜.待貼壁后，加入20 μL濃度分別為12.5，25，50，100和200 μmol/L的多酸樣品到各個(gè)孔中，培養(yǎng)72 h；然后用PBS緩沖液洗滌2次，各孔加入10 μL 0.5 mg/mL的MTT和90 μL完全培養(yǎng)基；培養(yǎng)4 h后，加入200 μL二甲基亞砜，于37℃振蕩10 min（使結(jié)晶完全溶解），立即用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度值.每一個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔［35~38］.細(xì)胞存活率（Cell viability，%）按下式計(jì)算：

式中：A為吸光度.

采用與處理B16細(xì)胞相同的方法制備單細(xì)胞懸液細(xì)胞.將細(xì)胞懸液以3 mL/孔接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基.每孔加入0.3 mL不同濃度多酸和2.7 mL完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)72 h；棄去培養(yǎng)基，按傳代的方法處理B16細(xì)胞.用PBS緩沖液清洗2次，以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，用1.0 mL 1.0 mol/L NaOH（含體積比為10%的DMSO）溶解細(xì)胞沉淀，于80℃孵育2 h.待細(xì)胞沉淀溶解充分后，測(cè)定405 nm處的吸光度值［37］.

1.2.8 抗氧化能力測(cè)定參照文獻(xiàn)［39，40］方法測(cè)定多酸的DPPH自由基清除能力.在試管中加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液及等體積的多酸；將試管置于37℃水浴鍋中，避光反應(yīng)30 min；用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值.每組重復(fù)進(jìn)行3次.DPPH自由基清除能力（DPPH radical scavenging ability，%）按下式計(jì)算：

參照文獻(xiàn)［39，41］方法測(cè)定多酸的ABTS自由基清除能力.首先以等體積比配制2.45 mmol/L過硫酸鉀和7 mmol/L ABTS溶液，靜置12 h后加入無水乙醇，使734 nm處吸光度值為0.68~0.72，制成ABTS稀釋液.吸取1 mL ABTS稀釋液和0.1 mL不同濃度的多酸加入試管中，室溫下反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm處的吸光度值.每組重復(fù)進(jìn)行3次.ABTS自由基清除能力（ABTS radical scavenging ability，%）按下式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的表征

圖1 示出多酸PMo10V2，PMo9V3，PMo8V4和PMo7V5在1200~700 cm?1范圍內(nèi)的紅外光譜.可見，4個(gè)化合物均有4個(gè)特征峰，分別對(duì)應(yīng)Keggin型雜多酸的紅外特征振動(dòng)峰，即810~760 cm?1處Mo—Oc—Mo的特征峰、870 cm?1處Mo—Ob—Mo的特征峰、990~960 cm?1處Mo—Od的特征峰及1100~1060 cm?1處P—Oa鍵反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰［42］.以上結(jié)果表明，已成功制備了具有Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸.圖2為多酸PMo10V2，PMo9V3，PMo8V4和PMo7V5的紫外-可見光譜.每種化合物的紫外數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)Od—Mo和Ob/Oc—Mo的荷移躍遷［43］，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，證實(shí)所合成的多酸均為Keggin結(jié)構(gòu)，與紅外光譜分析結(jié)果一致.

Fig.1 IR spectra of PMo10V2(a),PMo9V3(b),PMo8V4(c)and PMo7V5(d)between 1200—700 cm-1

Fig.2 UV?Vis spectra of PMo10V2(a),PMo9V3(b),PMo8V4(c)and PMo7V5(d)

圖3 給出了4種多酸的粉末XRD譜圖，可見4種多酸的譜圖極其相似，在7°~10°，16°~22°和25°~30°范圍內(nèi)存在Keggin結(jié)構(gòu)雜多酸的特征衍射峰.

Fig.3 XRD patterns of PMo11V1(a),PMo10V2(b),PMo9V3(c)(A),PMo8V4(a)and PMo7V5(b)(B)

2.2 多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制效果

圖4 示出4種多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制效果.4種效應(yīng)物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制呈現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系，導(dǎo)致酪氨酸酶活力下降50%時(shí)，PMo10V2，PMo9V3，PMo8V4和PMo7V5的濃度（IC50）分 別 為（7.046±0.506），（12.128±0.574），（12.362±0.802）和（9.860±1.490）mmol/L（表1），可見PMo10V2對(duì)酪氨酸酶的抑制效果最好，但其抑制效果低于PMo11V［IC50=（0.522±0.003）mmol/L］［44］.

Fig.4 Inhibitory effects of PMo10V2(a),PMo9V3(b),PMo8V4(c)and PMo7V5(d)on the tyrosinase,respectively

Table 1 Enzyme kinetic results of Keggin-type vanadium-substituted phosphomolybdate on tyrosinase

金屬離子、電荷數(shù)及電荷分布等都會(huì)導(dǎo)致多酸的活性不同程度的改變，隨著過渡金屬釩取代個(gè)數(shù)的增加，陰離子的電荷數(shù)逐漸增加，其氧化性逐漸降低，與酪氨酸酶間的作用趨向減弱.當(dāng)釩取代個(gè)數(shù)偏大時(shí)，多酸的酸度發(fā)生明顯改變，進(jìn)而影響自身結(jié)構(gòu)［45］.由此可以判斷，酸度和氧化性與多酸的活性密切相關(guān).

2.3 多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理

圖5 示出4種多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理.可見，4種多酸的抑制作用曲線非常相似，均相交于原點(diǎn).4種多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制作用是可逆抑制，效應(yīng)物與酪氨酸酶之間以非共價(jià)鍵相接，復(fù)合物穩(wěn)定性差，容易受到外界環(huán)境的干擾.

Fig.5 Inhibitory mechanism of PMo10V2(A),PMo9V3(B),PMo8V4(C)and PMo7V5(D)on the tyrosinase

2.4 多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制類型

圖6 示出了4種多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制類型以及抑制常數(shù).PMo10V2［圖6（A）］和PMo8V4［圖6（C）］的抑制曲線交點(diǎn)位于第二象限，PMo9V3［圖6（B）］與PMo7V5［圖6（D）］的抑制曲線交點(diǎn)位于第三象限，4種多酸對(duì)酪氨酸酶均為混合型抑制，這表明效應(yīng)物通過與游離酶或酶-底物復(fù)合物結(jié)合.

以Lineweaver-Burk圖中4條抑制曲線的斜率/截距為Y值，效應(yīng)物濃度為X值，二次作圖得到了抑制常數(shù).4種多酸抑制效果、抑制機(jī)理、抑制類型以及抑制常數(shù)列于表1.由表1可以看到，PMo10V2和PMo8V4的抑制常數(shù)關(guān)系為KIS＞KI；PMo9V3和PMo7V5的抑制常數(shù)關(guān)系為KIS

Fig.6 Inhibitory type and constants of PMo10V2(A),PMo9V3(B),PMo8V4(C)and PMo7V5(D)on the tyrosinase

2.5 多酸與酪氨酸酶的分子對(duì)接研究

Fig.7 Binding mode of the Keggin series compounds and active site of tyrosinase

Table 2 Molecular docking of compounds

圖7 和表2給出4種多酸與酪氨酸酶的分子對(duì)接結(jié)果.由圖7可知，4種效應(yīng)物與酪氨酸酶之間的結(jié)合作用主要與氫鍵和范德華力相關(guān)，差異在于參與作用的氨基酸種類、數(shù)量不同.對(duì)接過程中，配體小分子和蛋白大分子進(jìn)行Energy Minimize處理，降低兩者結(jié)合的空間位阻.對(duì)接時(shí)，配體分子通過不斷變換空間結(jié)構(gòu)，逐漸嵌入活性位點(diǎn)，與蛋白分子形成多種構(gòu)象，根據(jù)不同構(gòu)象的評(píng)分函數(shù)確定最佳構(gòu)象.評(píng)分函數(shù)結(jié)果越低，配體小分子與蛋白分子間的結(jié)合作用穩(wěn)定性越高，對(duì)接更加成功.以對(duì)接效果最好的PMo10V2為例，其與酪氨酸酶的對(duì)接函數(shù)為?18.627 kJ/mol，圖7（A）分別以二維結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)顯示了PMo10V2與酪氨酸酶活性中心的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合作用力.PMo10V2與酪氨酸酶活性中心的His85，His244，Glu256，His259及Asn260氨基酸以氫鍵相互結(jié)合，與活性中心周圍的His61，Cys83，Thr84，Gly86，Phe90，His94，Val248，His263，Phe264，Met280，Gly281，Val283，Ala286，Phe292和His296氨基酸形成范德華力.極性氨基酸Thr，Cys，Asn和Gly可通過改變蛋白分子的極性影響氫鍵作用，帶正電的His和帶負(fù)電的Glu通過與配體分子內(nèi)的雜多陰離子/過渡金屬釩離子的靜電效應(yīng)影響效應(yīng)物與酶之間的范德華力，疏水氨基酸Ala，Val，Phe和Met的疏水作用對(duì)PMo10V2與酪氨酸酶的結(jié)合作用也具有一定影響.表2列出了另外3種多酸的分子對(duì)接結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)效應(yīng)物與酪氨酸酶之間的結(jié)合作用主要與氫鍵和范德華力相關(guān)，差異在于參與作用的氨基酸種類、數(shù)量的不同.

2.6 多酸對(duì)黑色素形成的抑制作用

4種多酸對(duì)黑色素形成的抑制作用研究選用B16細(xì)胞，模擬皮膚黑色素生成模型.對(duì)細(xì)胞模型進(jìn)行了噻唑藍(lán)（MTT）毒性檢測(cè)（圖8）.在200 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，處理72 h后，4種多酸對(duì)細(xì)胞均無毒害作用，并且在高濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的增長(zhǎng).檢測(cè)了4種多酸在B16細(xì)胞中對(duì)黑色素生成量的影響.由圖8可見，隨著多酸濃度的升高，黑色素生成量發(fā)生變化.在PMo10V2濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)，與未加藥的對(duì)照組相比，黑色素的生成受到明顯抑制，出現(xiàn)了極顯著的差異（P＜0.01），當(dāng)PMo10V2濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，對(duì)黑色素的抑制達(dá)到75%.在PMo9V3濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)，與未加藥的對(duì)照組相比，黑色素的生成受到了明顯抑制，出現(xiàn)了顯著的差異（P＜0.05）.在PMo8V4濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，與未加藥的對(duì)照組相比，黑色素的生成受到了明顯抑制，出現(xiàn)了極顯著的差異（P＜0.01）.同樣PMo7V5對(duì)黑色素生成的影響也隨著藥物濃度的升高受到了極顯著的抑制.因此，4種多酸均能抑制黑色素的生成.

Fig.8 Effects of PMo10V2,PMo9V3,PMo8V4,PMo7V5 on the cell viability(A)and melanin production(B)in B16 cell

2.7 多酸的抗氧化活性

2.7.1 ABTS自由基的清除能力ABTS被氧化后會(huì)得到藍(lán)綠色ABTS+，其穩(wěn)定存在于溶液中.抗氧化活性成分能將ABTS+清除，使溶液的顏色變淺.研究發(fā)現(xiàn)，吸光度值越低，會(huì)導(dǎo)致溶液顏色越淺，證明多金屬氧酸鹽化合物的抗氧化能力越強(qiáng)［46］.4種多酸均對(duì)ABTS自由基顯示出良好的清除效果，結(jié)果如圖9所示.隨著釩取代個(gè)數(shù)不同的多酸濃度的上升，ABTS自由基的清除率顯現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì).PMo8V4具有最優(yōu)的ABTS自由基清除效果，能清除74.13%的自由基.

2.7.2 DPPH自由基的清除能力4種多酸能捕捉到DPPH自由基單電子，可明顯觀察到溶液顏色變淺，同時(shí)引起吸收值變化，故可根據(jù)吸收值的變化判斷抗氧化效果好壞［47］.隨著釩取代個(gè)數(shù)不同的多酸濃度的上升，DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì).其中，PMo8V4具有最優(yōu)的清除效果，能清除96.85%的自由基.

Fig.9 Effects of PMo10V2(a),PMo9V3(b),PMo8V4(c)and PMo7V5(d)on the clearance of ABTS(A)and DPPH(B)

ABTS和DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)均表明PMo8V4具有最優(yōu)的清除效果.但當(dāng)溶液質(zhì)量濃度過大時(shí)，PMo10V2，PMo9V3，PMo8V4和PMo7V5的自由基清除能力均有所下降，這主要是因?yàn)殡S著溶液質(zhì)量濃度過大，底物濃度太大造成反應(yīng)體系的黏度過高，導(dǎo)致了多金屬氧酸鹽與底物的結(jié)合受到嚴(yán)重影響，對(duì)反應(yīng)體系中各種分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)十分不利，故降低了整體反應(yīng)的效率，進(jìn)而使多酸的自由基清除能力下降.

3 結(jié) 論

利用水熱法合成了具有Keggin型過渡金屬釩取代的磷鉬酸鹽PMo10V2，PMo9V3，PMo8V4和PMo7V5.4種多酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶均有抑制效果，是酪氨酸酶的可逆混合型抑制劑，PMo10V2，PMo7V5，PMo9V3和PMo8V4的抑制效果（IC50）依次為（7.046±0.506），（9.860±1.490），（12.128±0.574），（12.362±0.802）mmol/L.分子對(duì)接結(jié)果顯示，氫鍵和范德華力是多酸與酪氨酸酶結(jié)合的主要作用力，并且證明兩者之間不是以共價(jià)鍵結(jié)合，進(jìn)一步說明這4種多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制作用是可逆的.自由基清除實(shí)驗(yàn)表明，合成的多酸對(duì)DPPH具有明顯的抗氧化活性.此外，4種多酸未對(duì)小鼠B16細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性，并且顯著抑制了黑色素的生成.本文結(jié)果揭示了多金屬氧酸鹽在分子水平上抑制酪氨酸酶的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，并證明其在醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)中可能作為高效低毒的抗褐變劑.