王 勤，王文文，王 園, ，段元霄，安曉萍，齊景偉

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在受到刺激時(shí)，活性氧和活性氮產(chǎn)生量大于清除量，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致其在體內(nèi)大量積累引發(fā)氧化損傷的過(guò)程[1]。如果這種氧化損傷不能及時(shí)修復(fù)就會(huì)誘導(dǎo)其他疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激易引發(fā)自身免疫疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和Ⅰ型糖尿病等[2]。脾臟作為外周免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞，具有儲(chǔ)血、濾血、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及免疫應(yīng)答等功能。免疫細(xì)胞因細(xì)胞膜中含有不飽和脂肪酸，所以對(duì)氧化應(yīng)激十分敏感，在受到自由基攻擊后，會(huì)影響免疫功能[3]。因此，通過(guò)使用抗氧化劑緩解脾臟氧化應(yīng)激，改善機(jī)體健康狀況意義重大。

多糖是一類從天然植物中提取的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抑菌及抗腫瘤等作用[4]。小麥麩皮中約含有46%左右的非淀粉多糖（果膠多糖、纖維素多糖及非纖維素多糖），且含有一定量的酚酸類物質(zhì)[5]。多項(xiàng)研究表明，小麥麩皮經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵處理會(huì)增加生物活性物質(zhì)的含量，進(jìn)而提高其抗氧化能力[6-7]。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)麥麩阿魏酰低聚糖可以緩解由AAPH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，提高氧化應(yīng)激大鼠心臟、肝臟和腎臟組織中過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性以及谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量。然而，關(guān)于發(fā)酵麥麩多糖（Fermentedwheat bran polysaccharides，F(xiàn)WBPs）在緩解脾臟氧化應(yīng)激方面的報(bào)道還不多見。因此，本試驗(yàn)通過(guò)體外抗氧化指標(biāo)評(píng)價(jià)FWBPs的抗氧化活性，并進(jìn)一步以腹腔注射敵草快（Diquat）建立大鼠氧化應(yīng)激模型，研究FWBPs對(duì)氧化應(yīng)激大鼠脾臟的保護(hù)作用，以期為FWBPs應(yīng)用于抗氧化方面保健產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)雄性SD大鼠 48只，20～22日齡，體重40～50 g，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（蒙）2015-0001，大鼠每天給予充足的水和飼料，3 d后開始試驗(yàn)；麥麩、豆粕粉、玉米粉 市場(chǎng)；DPPH（二苯基-2-三硝基苯肼）、丁基羥基茴香醚（BHA）、維生素 C（VC） 美國(guó) Sigma公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 2.119、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CGMCC 1.0892 內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心保存；無(wú)水乙醇、六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯仿（分析純）、異丙醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總抗氧化能力（Total antioxitant capacity，TAOC）、SOD、CAT測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；GSH-Px、GSH和 8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy deoxyguanosine，8-OHdG）試劑盒 武漢基因美生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；Invitrogen TRIzol試劑 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；FastQant RT Kit（with gDNase）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒 北京天根生化試劑有限公司；大鼠基礎(chǔ)飼糧 江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司。

HVA-85型壓力滅菌器 日本Hirayama公司；SW-CJ 超凈工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械；QYC-200恒溫培養(yǎng)搖床 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TDL-5-A型臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Epoch2 型微孔板分光光度計(jì) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FWBPs的制備 試驗(yàn)所用FWBPs制備方法參照李暄[9]。先將麥麩、豆粕和玉米粉碎，過(guò)40目篩，以麥麩、豆粕粉和玉米粉（質(zhì)量比=80.46:9.32:10.22）為基質(zhì)，按照10%接種量接入以混合種子液，混合種子液由比例為釀酒酵母和枯草芽孢桿菌6.7:3.3 組成，料水比 1:1，35.4 °C 發(fā)酵 48 h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵基質(zhì)于45 °C烘干48 h，粉碎后與蒸餾水1∶20混合，80 °C水浴浸提30 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇溶液，靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，經(jīng)過(guò)酶處理與Sevag法相結(jié)合法去除蛋白質(zhì)后，獲得FWBPs，多糖含量為633.58 mg/g，該多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成，摩爾比為5:4:46:9:67:46。

1.2.2 FWBPs體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.2.2.1 還原力的測(cè)定 還原力的測(cè)定方法參照J(rèn)ia等[10]， 分別取不同濃度（0、0.5、1、2、4 mg/mL）的FWBPs溶液0.75 mL，依次各加入0.75 mL的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）及0.75 mL的六氰合鐵酸鉀溶液（1%），混勻，50 ℃ 水浴 20 min，冷卻，再加入0.75 mL的10%三氯乙酸終止反應(yīng)，3000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液，加入1.5 mL蒸餾水和 400 μL 0.1% 三氯化鐵，室溫反應(yīng) 10 min，700 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1，空白對(duì)照以蒸餾水代替FWBPs溶液測(cè)得吸光度值A(chǔ)0，還原力=A1-A0。以BHA作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定方法同上。

1.2.2.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 DPPH自由基清除率的測(cè)定參照Z(yǔ)hang等[11]方法，取2 mL不同濃度（0、0.5、1、2、4 mg/mL）的 FWBPs溶液和 2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L，95%乙醇溶液）混勻，室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min，517 nm測(cè)定吸光度值A(chǔ)。以BHA作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定方法同上。計(jì)算公式：

式中：A0：樣品吸光度；A1：乙醇代替DPPH溶液吸光度；A2：蒸餾水代替樣品吸光度。

1.2.2.3 羥基自由基清除率的測(cè)定 羥基自由基清除率的測(cè)定參照Z(yǔ)hang等[11]的方法，取0.5 mL濃度為（0、0.5、1、2、4 mg/mL）的 FWBPs與 0.5 mL硫酸亞鐵溶液（9.0 mmol/L）和 0.5 mL雙氧水溶液（8.8 mmol/L）混合，室溫反應(yīng)10 min，再加入0.5 mL水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L），室溫反應(yīng) 30 min，510 nm測(cè)定得吸光度A。以BHA作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定方法同上。計(jì)算公式：

式中：A0：樣品吸光度；A1：蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液吸光度；A2：蒸餾水代替樣品吸光度。

1.2.3 FWBPs對(duì)氧化應(yīng)激大鼠脾臟保護(hù)作用評(píng)價(jià)

1.2.3.1 動(dòng)物分組及造模給藥處理 將48只健康斷奶雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6個(gè)組，每組8只，動(dòng)物分組及造模給藥處理如表1。FWBPs（低、中、高）組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠持續(xù)灌胃14 d，每日1次，正常對(duì)照組和氧化應(yīng)激模型組大鼠灌胃給予等量的生理鹽水。最后一次灌胃2 h后，除正常對(duì)照組外，其它五組腹腔注射敵草快（0.1 mmol/kg BW）建立氧化應(yīng)激模型。24 h后，乙醚致暈，剖開腹腔，收集脾臟組織，液氮速凍，存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。試驗(yàn)在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院進(jìn)行，常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由采食、飲水。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design and animal grouping

1.2.3.2 抗氧化相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 取適量脾臟組織，加磷酸緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4）制備 10%（w/w）組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液用于總蛋白、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px、GSH和 8-OHdG的測(cè)定，所有操作均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3.3 抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平分析 采用Trizol法提取大鼠脾臟組織總RNA。經(jīng)微孔板分光光度計(jì)測(cè)得A260nm和A280nm比值在1.8～2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳法評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量。參照FastQant RT Kit（with gDNase）說(shuō)明書分別將各樣品的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板，使用表2所列的引物，按照 SuperRealPreMix Plus（SYBR Green）說(shuō)明書進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。以β-肌動(dòng)蛋白（βactin）為內(nèi)參，谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（Glutamate cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基（Glutamate cysteine ligase modifiersubunit，GCLM）、醌氧化還原酶 1（NAD（P）Hquinoneoxidoreductase 1，NQO1）、血紅素氧合酶（heme oxygenase-1，HO-1）及核因子E2相關(guān)因子 2（Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。引物由上海生工生物有限公司合成，詳細(xì)信息見表2。

表2 抗氧化基因的引物序列Table 2 Primer sequences of antioxidant genes

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中正常對(duì)照組和氧化應(yīng)激組進(jìn)行t檢驗(yàn)，低、中、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果均以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 FWBPs體外抗氧化活性

2.1.1 還原力 還原力是評(píng)價(jià)抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)[12]，還原力越強(qiáng)，表明其抗氧化能力越高。由圖1所示，隨著FWBPs溶液濃度的增加，其還原力也逐漸增加；當(dāng)FWBPs溶液濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，其還原力顯著提高（P＜0.05），但仍顯著低于陽(yáng)性對(duì)照BHA（P＜0.05）。與上述研究結(jié)果相似，杜涓等[13]研究結(jié)果顯示，當(dāng)樣品濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，四種不同組分的 FWBPs（吸光值分別為 0.24、0.58、0.67、0.61）的還原力增加，但不如BHA的還原力強(qiáng)。FWBPs是一種混合物，其中含有的低聚糖基團(tuán)和阿魏?；鶊F(tuán)可能會(huì)影響氧化還原電位，影響其還原力[14]。由此推測(cè)，F(xiàn)WBPs的抗氧化作用可能是由于其含有低聚糖和酚酸類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，低聚糖在抗氧化方面有良好作用[15]，而阿魏酸是一種公認(rèn)的抗氧化劑，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域[16]。

2.1.2 DPPH自由基清除率 過(guò)量的DPPH自由基會(huì)破壞機(jī)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成其功能障礙甚至死亡[17]。由圖1所示，當(dāng)FWBPs濃度在 0.5～2 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，DPPH自由基清除能力顯著提高（P＜0.05），4 mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率最高，可達(dá)92.35%，且與陽(yáng)性對(duì)照BHA的清除能力相當(dāng)。此結(jié)果與杜涓等[13]研究結(jié)果相似，四種不同組分的FWBPs均有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，4 mg/mL的清除率可達(dá)80%。此結(jié)果表明，F(xiàn)WBPs對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用。

圖1 不同濃度FWBPs的體外抗氧化活性Fig.1 In vitro antioxidant activity of FWBPs with different concentrations

2.1.3 羥基自由基清除率 羥基自由基是一種極具危害的自由基，具有很強(qiáng)的氧化活性，可以直接損傷核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子，進(jìn)而影響機(jī)體健康[12]。由圖1所知，當(dāng)FWBPs濃度在0.5～2 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，其羥基自由基清除率顯著高于同濃度的陽(yáng)性對(duì)照 BHA（P＜0.05）；當(dāng)濃度在 4 mg/mL 時(shí)，BHA的羥基自由基清除率與FWBPs相當(dāng)。與上述結(jié)果相似，呂青青[18]研究發(fā)現(xiàn)，小麥麩皮多糖有較強(qiáng)羥基自由基清除能力，可達(dá)30%。

2.2 FWBPs對(duì)氧化應(yīng)激大鼠脾臟保護(hù)作用

2.2.1 FWBPs對(duì)氧化應(yīng)激大鼠脾臟抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響 動(dòng)物機(jī)體可以通過(guò)抗氧化體系來(lái)清除過(guò)量自由基，進(jìn)而緩解氧化應(yīng)激。抗氧化體系包括由GSH-Px、CAT及SOD等抗氧化酶組成的酶體系和由GSH、維生素C、維生素E、類胡蘿卜素、類黃酮、膽紅素及微量元素硒等物質(zhì)組成的非酶體系[19-21]。8-OHdG是一種有害氧化代謝產(chǎn)物，是目前研究公認(rèn)的評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激損傷的指標(biāo)[22]。如表3所示，敵草快攻毒會(huì)導(dǎo)致大鼠脾臟GSH-Px活性顯著下降（P＜0.05），T-AOC和 8-OHdG的含量顯著增加（P＜0.05），這說(shuō)明敵草快攻毒導(dǎo)致抗氧化酶活性降低，而氧化代謝產(chǎn)物8-OHdG含量增加，大鼠脾臟氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。有趣的是，敵草快攻毒提高了T-AOC，這可能與攻毒條件下抗氧化體系被激活有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。與氧化應(yīng)激模型組相比，低和中劑量組中GSH-Px活性顯著增加（P＜0.05）；低劑量組中 GSH 含量顯著增加（P＜0.05）；而中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組中8-OHdG的含量顯著降低（P＜0.05）。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)WBPs可提高大鼠組織中SOD、CAT及GSH-Px等抗氧化酶的活力及mRNA表達(dá)水平[23-24]。與本試驗(yàn)結(jié)果相似，殼聚糖可通過(guò)增加敵草快攻毒仔豬血清中GSH-Px、CAT及SOD的活性，進(jìn)而緩解氧化應(yīng)激[25]。此結(jié)果表明，F(xiàn)WBPs可通過(guò)增加GSH-Px活力、GSH含量，降低8-OHdG的含量緩解敵草快攻毒所致的脾臟氧化應(yīng)激。

表3 FWBPs對(duì)氧化應(yīng)激大鼠脾臟抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of FWBPs supplementation on antioxidant indices in spleen of oxidative stress rats

2.2.2 FWBPs對(duì)氧化應(yīng)激大鼠脾臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步探討FWBPs對(duì)大鼠脾臟氧化應(yīng)激緩解作用的可能分子機(jī)制，本試驗(yàn)測(cè)定了脾臟抗氧化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。由表4所示，敵草快攻毒會(huì)導(dǎo)致大鼠脾臟GCLM的mRNA表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。與氧化應(yīng)激模型組相比，中劑量組大鼠脾臟中NQO1和Nrf2的mRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。核因子 E2 相關(guān)因子 2（Nrf2）信號(hào)通路是目前研究發(fā)現(xiàn)的最經(jīng)典的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路之一[26]。在氧化應(yīng)激發(fā)生后，Nrf2會(huì)被活化，與kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（kelchlike ECH associated protein1，Keap1）解離，進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant response element，ARE）結(jié)合，促進(jìn)HO-1、NQO1、GCLC和 GCLM的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)CAT、SOD和GSH-Px等抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而緩解氧化應(yīng)激[27]。HO-1可通過(guò)與金屬離子螯合、修飾蛋白巰基及清除自由基等方式防御氧化應(yīng)激[28]。醌類可被NQO1直接被還原成氫醌，進(jìn)而減少醌類轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的氧自由基，從而緩解醌類物質(zhì)代謝引起氧化應(yīng)激損傷[29]。谷氨酸-半胱氨酸連接酶是由催化亞基GCLC和調(diào)節(jié)亞基GCLM組成的二聚體，它可以調(diào)控GSH的合成[30]。由此結(jié)果推測(cè)，F(xiàn)WBPs可通過(guò)激活Nrf2，增加NQO1的mRNA表達(dá)量，進(jìn)而緩解敵草快攻毒所致的脾臟氧化應(yīng)激。

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與肥胖、糖尿病、帕金森病及心腦血管疾病等慢性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[31]。一般通過(guò)攝食抗氧化類物質(zhì)來(lái)提高機(jī)體抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激。動(dòng)物機(jī)體主要通過(guò)抗氧酶和抗氧化物質(zhì)抵抗氧化應(yīng)激。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激模型組大鼠脾臟GSH-Px活力下降，而FWBPs預(yù)處理可增加氧化應(yīng)激大鼠脾臟GSH-Px活力、GSH含量及NQO1和Nrf2的mRNA表達(dá)量，并可降低8-OHdG的含量。由此推測(cè)，F(xiàn)WBPs的抗氧化作用可能是通過(guò)激活Nrf2，促進(jìn)NQO1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)GSHPx的表達(dá)和GSH的分泌，進(jìn)而緩解敵草快攻毒所致的脾臟氧化應(yīng)激，保護(hù)脾臟健康。FWBPs的抗氧化作用機(jī)制可能是多途徑的，后續(xù)有待深入研究脾臟組織中抗氧化信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，以探明FWBPs的靶向作用機(jī)制。

體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，4 mg/kg BW FWBPs對(duì)DPPH自由基和羥基自由基都有較強(qiáng)的清除作用，且與陽(yáng)性對(duì)照BHA作用相當(dāng)，這證明FWBPs有較強(qiáng)的體外抗氧化作用。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)WBPs預(yù)處理可增加氧化應(yīng)激大鼠脾臟GSH-Px活力、GSH含量及NQO1和Nrf2的mRNA表達(dá)量，并可降低8-OHdG的含量。綜上所述，F(xiàn)WBPs具有較好的體外、體內(nèi)抗氧化能力及氧化應(yīng)激修復(fù)作用，可作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域，本試驗(yàn)也為FWBPs的開發(fā)利用提供了理論參考。