李 露，張普香，韓朋岑，李金容，葉瀟瑩，蔡韜敏，Isaac Newton ODEI ASARE，龍曉燕

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010）

抗氧化肽是近年來被廣泛研究的一類天然生物活性肽，作為一種天然抗氧化劑，其結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、易吸收、穩(wěn)定性好、無免疫反應(yīng)，不僅具有較強(qiáng)的抗氧化活性，還具有降血壓和抗癌等其他保健功效，在食品和醫(yī)療保健品領(lǐng)域越來越受到人們的關(guān)注[1]。動(dòng)物皮中含有的蛋白質(zhì)是天然抗氧化肽的原料來源之一，目前已有較多通過酶法水解方法從豬皮[2]、鴨皮[3]、雞皮[4]、魚皮[5-6]、蟾蜍皮[7]等動(dòng)物皮膚中提取出具有抗氧化活性多肽。我國是世界上牦牛飼養(yǎng)量最大的國家，飼養(yǎng)牦?？倲?shù)約1400多萬頭，主要分布于青海、西藏、四川等地，其中青海飼養(yǎng)量占30%以上，位居全國第一[8]。牦牛主要生活在高寒地區(qū)，能采食各種高原上的植物和多樣名貴藥材，因此牦牛皮相關(guān)的產(chǎn)品具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，如牦牛奶中的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)是中國荷斯坦牛乳的2倍[9]。牦牛皮是牦牛相關(guān)產(chǎn)品加工的副產(chǎn)物，研究表明，牦牛皮中粗蛋白占牦牛皮干重的89.74%，而膠原蛋白占粗蛋白含量的85%，相比普通蛋白質(zhì)，膠原蛋白具有更好的生物相容性、促凝血性、弱抗原性和可降解性，也更容易被人體吸收利用，因此，牦牛皮可以作為天然活性肽的原料[10-11]。但牦牛皮的加工利用大多集中在皮革行業(yè)，僅有少部分被用于提取牦牛皮膠原蛋白，再由酶法提取出膠原蛋白肽[12-13]，不理想的抗氧化活性及復(fù)雜的工藝降低了牦牛皮蛋白的利用率。

因?yàn)榍宄鼶PPH自由基能力的測(cè)定方法能夠涉及到單電子轉(zhuǎn)移（SET）的直接還原和氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）的兩種抗氧化肽清除自由基的機(jī)制來猝滅自由基[14]，故將其作為評(píng)價(jià)牦牛皮蛋白水解物抗氧化能力的指標(biāo)。本文采用堿性蛋白酶酶法水解制備牦牛皮抗氧化肽，先研究pH、水解溫度、酶用量、底物濃度及水解時(shí)間對(duì)牦牛皮蛋白水解物的影響，再結(jié)合響應(yīng)面（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)牦牛皮水蛋白解度（DH）及DPPH自由基清除能力的IC50值篩選牦牛皮抗氧化肽的最佳制備工藝，為牦牛皮的開發(fā)和應(yīng)用提供試驗(yàn)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛皮 來自青海省某大型屠宰場(chǎng)；DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Free Radical，1,1-二苯基-2-苦肼基自由基） 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；茚三酮 上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；抗壞血酸、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、無水乙醇等分析純?cè)噭┏啥际锌坡』瘜W(xué)品有限公司。

AR124CN電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；UV-8000S紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DZRW-D-1型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；Dynamica Velocity 14R臺(tái)式離心機(jī) 青島浩賽科技股份有限公司；UDK129半自動(dòng)凱氏定氮儀 VELP公司；雷磁PHS-3C電極PH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛皮抗氧化肽制備工藝 除去牦牛皮上肉、筋膜、牛毛等物質(zhì)，稱取牦牛皮，以烘干后牦牛皮重量的質(zhì)量體積比1:20與蒸餾水混合，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為8.5，根據(jù)不同底物濃度加入不同質(zhì)量的堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)相應(yīng)的水解溫度、水解時(shí)間，恒溫水浴攪拌進(jìn)行水解，90 ℃水浴滅活10 min，4 ℃、10000 r/min離心 10 min后得到牦牛皮抗氧化體，真空冷凍干燥后于-20 ℃下保存。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 每次單因素實(shí)驗(yàn)稱取5 g處理好的牦牛皮，以水解度（DH）和DPPH自由基清除能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)分別考察五個(gè)單因素對(duì)水解度及DPPH自由基清除率的IC50值影響。

1.2.2.1 不同pH對(duì)牦牛皮水解的影響 在酶用量10000 U/g、水解溫度50 ℃、水解時(shí)間8 h、底物濃度 5%的水解條件下考察不同 pH（7、7.5、8、8.5、9、9.5、10）對(duì)水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.2.2 不同水解溫度對(duì)牦牛皮水解的影響 酶用量10000 U/g、底物濃度5%、水解時(shí)間8 h、pH8.5的水解條件下考察不同水解溫度（45、50、55、60、65 ℃）對(duì)水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.2.3 不同酶用量對(duì)牦牛皮水解的影響 在底物濃度5%、水解溫度50 ℃、水解時(shí)間8 h、pH8.5的水解條件下考察不同酶用量（4000、6000、8000、10000、12000 U/g）對(duì)水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.2.4 不同底物濃度對(duì)牦牛皮水解的影響 在酶用量 10000 U/g、水解溫度 50 ℃、水解時(shí)間 8 h、pH8.5的水解條件下考察不同底物濃度（3%、4%、5%、6%、7%）對(duì)水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.2.5 不同水解時(shí)間對(duì)牦牛皮水解的影響 在酶用量 10000 U/g、水解溫度 50 ℃、底物濃度 5%、pH8.5的水解條件下考察不同水解時(shí)間（4、6、8、10、12 h）對(duì)水解度及DPPH自由基清除能力的IC50值的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用軟件設(shè)計(jì)專家（Design-Expert 8.0.6）中的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，選取三個(gè)單因素：A（水解溫度，℃）、B（酶用量，U/g）、C（水解時(shí)間，h）為自變量，以牦牛皮水解物的水解度和DPPH自由基清除率的IC50值為響應(yīng)值進(jìn)行酶解工藝條件優(yōu)化。響應(yīng)面因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼Table 1 Factor level coding of response surface

1.2.4 水解度（DH）測(cè)定 分別測(cè)α-氨基酸態(tài)氮含量（α-Aminonitrogen，AN）與總氮含量（Totalnitrogen，TN）來計(jì)算水解度，AN采用茚三酮顯色法，用甘氨酸配制標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行測(cè)量計(jì)算α-氨基酸態(tài)氮含量[15]；TN采用中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5-2010）中的凱氏定氮法測(cè)定計(jì)算總氮含量。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 采用文獻(xiàn)[16-17]的方法并略微改進(jìn)，將不同濃度的牦牛皮蛋白水解物溶液2.0 mL與0.1 mmol/L DPPH自由基溶液2.0 mL混合，充分振蕩，避光孵育30 min（25 ℃），于波長517 nm測(cè)得混合溶液的吸光值A(chǔ)i；對(duì)照組用2.0 mL蒸餾水替代酶解溶液測(cè)得吸光值A(chǔ)0；空白組以2.0 mL無水乙醇替代DPPH溶液測(cè)得吸光值A(chǔ)j；VC作為陽性對(duì)照，并計(jì)算牦牛皮抗氧化肽對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值。

1.2.6 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定 采用Yap等[18]的方法并略微改進(jìn)，配制含有7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀的ABTS試劑，在室溫下孵育12～16 h。在734 nm下用無水乙醇稀釋為吸收值為0.700±0.005。取ABTS自由基陽離子工作液3.9 mL與0.1 mL不同濃度的牦牛皮抗氧化肽溶液混合，充分振蕩，23 ℃避光孵育6 min，測(cè)定混合溶液在波長734 nm處的吸光值A(chǔ)i，無水乙醇做空白對(duì)照測(cè)得吸光值A(chǔ)0，VC作為陽性對(duì)照，并計(jì)算牦牛皮抗氧化肽對(duì)ABTS自由基清除率的IC50值。

1.2.7 羥自由基清除能力的測(cè)定 采用文獻(xiàn)[19-20]的方法做略微改進(jìn)，2 mL不同質(zhì)量濃度的牦牛皮抗氧化肽溶液置于10 mL具塞試管中，再加入2 mL的過氧化氫溶液（6 mmol/L）和2 mL硫酸亞鐵（6 mmol/L）溶液，充分振蕩后在避光處靜置30 min，再向離心管中加入剛配制好的2 mL水楊酸溶液（6 mmol/L），振蕩混勻，25 ℃環(huán)境下靜置10 min，于510 nm處測(cè)定反應(yīng)混合溶液的吸光度值A(chǔ)i，空白對(duì)照用蒸餾水代替樣品測(cè)得吸光度值A(chǔ)0，蒸餾水代替水楊酸溶液測(cè)得吸光度值為Aj，VC作為陽性對(duì)照，并計(jì)算牦牛皮抗氧化肽對(duì)羥自由基清除率的IC50值。

1.2.8 還原力測(cè)定 取0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）2.5 mL、1%（w/v）鐵氰化鉀溶液 2.5 mL與不同濃度的牦牛皮抗氧化肽溶液1 mL混勻，充分振蕩，50 ℃ 孵育 20 min，迅速冷卻，加入 10%（w/v）三氯乙酸溶液2.5 mL混勻，充分振蕩，5000 r/min離心10 min，取上層清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL及0.1%（w/v）三氯化鐵溶液0.5 mL，振蕩混勻，該混合物在室溫下保持10 min，測(cè)定其在波長700 nm處的吸光度，VC作為陽性對(duì)照。吸光度值越大，表示水解物的還原能力越強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Orgin 8.0和IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中IC50值由IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行計(jì)算。其中P＜0.05說明差異顯著，P＜0.01說明差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 pH對(duì)牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖1所示，隨著pH的逐漸增加，水解度呈現(xiàn)出先緩慢上升后趨于平緩的變化趨勢(shì)；不同pH條件下的牦牛皮抗氧化肽對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值變化趨勢(shì)與水解度相關(guān)，當(dāng)溶液pH在處于7～8.5時(shí)，水解度由34.26%±0.52%增加到 35.99%±0.73%，但 pH進(jìn)一步增加時(shí)，水解度不再上升、IC50值不再降低，這可能是由于堿性蛋白酶是一種一般在pH6～10時(shí)比較穩(wěn)定，在低于6或高于11時(shí)會(huì)很快失活，最適作用pH范圍在7～11的酶類[21]。結(jié)合圖中兩個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)說明水解度與DPPH自由基清除率的IC50值之間存在著一定的關(guān)系，一定程度上IC50值能隨著水解度的增大而減小，在pH7.5～9.5的范圍內(nèi)，pH對(duì)牦牛皮抗氧化肽的制備沒有顯著性影響。在pH 8.5時(shí)，水解度能達(dá)到最大值35.99%±0.73%，IC50達(dá)到最小值為2.965 mg/mL，在牦牛皮抗氧化肽為濃度8 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率是93.83%±0.86%。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇pH8.5作為使用堿性蛋白酶水解牦牛皮蛋白的最佳pH。

圖1 pH對(duì)牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.1 Effects of pH on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.1.2 水解溫度對(duì)牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖2所示，伴隨水解溫度逐步上升，水解度呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)溫度從45 ℃升高到50 ℃時(shí)，水解度隨溫度的升高出現(xiàn)最大值（P＜0.05）；DPPH自由基清除率的IC50值呈現(xiàn)出先減小后增加的變化趨勢(shì)，當(dāng)溫度升高到50 ℃時(shí)，IC50值隨溫度的升高出現(xiàn)最小值（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)所用堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度約為40～55 ℃，酶促反應(yīng)中不同酶的最適溫度不同，當(dāng)?shù)陀谧钸m溫度時(shí)，酶的相關(guān)性質(zhì)發(fā)生改變，催化活性受到抑制后使其對(duì)底物的水解作用降低；而當(dāng)溫度升到一定限度時(shí)，酶結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不可逆的改變，從而失去催化活性[22]。所以在50 ℃之前，隨溫度增加，水解度也在顯著增加（P＜0.05），同時(shí)牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基的IC50值也在降低，在50 ℃之后兩者都出現(xiàn)不同程度的變化，并且大部分堿性蛋白酶多由微生物分泌的特點(diǎn)是耐熱性不佳，加熱可能會(huì)使酶活性受到損失[23]。結(jié)合圖中兩個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)說明溫度在50 ℃時(shí)兩個(gè)指標(biāo)達(dá)到最佳，水解物在濃度8 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率為89.34%±0.82%，IC50值為3.172 mg/mL；牦牛皮水解度為30.36%±0.70%。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇45 ～55 ℃作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)條件。

圖2 溫度對(duì)牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.2 Effects of temperature on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.1.3 酶用量對(duì)牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖3所示，隨著酶用量從4000 U/g增加到12000 U/g，水解度呈現(xiàn)出先上升后趨于不變的變化走向，DPPH自由基清除率的IC50值呈現(xiàn)出先減小后不變的變化趨勢(shì)。酶用量達(dá)到10000 U/g處，水解度出現(xiàn)顯著提高（P＜0.05）、IC50值出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），此時(shí)牦牛皮抗氧化肽在濃度為8 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率是 95.88%±0.83%，IC50值為 3.061 mg/mL；水解度為36.82%±1.98%。在這之后隨著酶用量增加到12000 U/g，對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值和水解度趨于不變。由于在底物濃度一定的條件下，酶促反應(yīng)速率會(huì)和酶濃度呈正比，伴隨加酶量增加，水解反應(yīng)速率加快，水不溶性的蛋白在蛋白酶的作用下逐漸被切割成小分子肽段[24]。但酶的用量超過其與底物充分反應(yīng)所需數(shù)值時(shí)，隨著酶用量的增加，蛋白質(zhì)不發(fā)生更為強(qiáng)烈的水解，也不會(huì)產(chǎn)生更多的活性肽及活性官能團(tuán)[25]。因此隨著酶用量的增加，水解度呈現(xiàn)出先增后緩的變化趨勢(shì)。結(jié)合圖圖中兩個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)選擇最適的酶用量為8000～12000 U/g進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖3 酶用量對(duì)牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.3 Effects of enzyme dosage on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.1.4 底物濃度對(duì)牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖4所示，隨底物濃度的增加，水解度呈現(xiàn)出緩慢增大后緩慢減小變化趨勢(shì)，在4%～7%內(nèi)差異不太明顯；從圖4中可以看出牦牛皮抗氧化肽在不同的底物濃度下，DPPH自由基清除率的IC50值呈現(xiàn)出先減小后趨于不變的走向。在底物濃度為5%時(shí)，兩者都達(dá)到最佳，牦牛皮抗氧化肽在濃度8 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到93.41%±0.86%，IC50值為2.936 mg/mL；水解度為35.25%±1.71%，但當(dāng)?shù)孜餄舛冗M(jìn)一步增加時(shí)，兩者趨于不變。可能是由于酶與底物的接觸機(jī)率隨底物濃度的增加可擴(kuò)大，充分發(fā)揮堿性蛋白酶對(duì)牦牛皮蛋白的水解作用，產(chǎn)生數(shù)量更多的抗氧化物質(zhì)；底物濃度不停增大時(shí)，在超越了酶的作用范圍后，酶對(duì)牦牛皮蛋白的水解作用及水解程度均不同程度的受到限制而減弱，使得水解物的抗氧化活性及水解度出現(xiàn)降低現(xiàn)象[26]。結(jié)合圖中兩個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)，在底物濃度4%～6%范圍內(nèi)，對(duì)牦牛皮抗氧化肽的制備工藝無顯著性影響（P＞0.05），但在底物濃度為5%時(shí)水解度與IC50值能取得最佳值，故選擇最佳底物濃度5%作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

圖4 底物濃度對(duì)牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.4 Effects of substrate concentration on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.1.5 水解時(shí)間對(duì)牦牛皮抗氧化肽制備的影響 如圖5所示，隨時(shí)間的增加，水解度呈現(xiàn)先增加后趨于不變的變化趨勢(shì)，對(duì)水解度（DH）的影響比較顯著（P＜0.05）；牦牛皮抗氧化肽在不同的時(shí)間下，DPPH自由基清除率的IC50值呈現(xiàn)出先減小后趨于不變的走向。水解時(shí)間從4 h增加到10 h時(shí)，兩個(gè)指標(biāo)隨時(shí)間出現(xiàn)不同程度的變化，在此之后隨時(shí)間的增加，兩者趨于平緩不變。水解時(shí)間不斷增加，酶對(duì)底物的水解作用更充分，會(huì)產(chǎn)生更多的肽片段和氨基酸殘基，因此水解度會(huì)出現(xiàn)較大幅度的增加；同時(shí)水解物中產(chǎn)生了更多的抗氧化物質(zhì)，故而呈現(xiàn)出更高的自由基清除活性。但是多肽的抗氧化活性與其肽段長度、構(gòu)象以及氨基酸組成等因素有關(guān)[27]。隨水解時(shí)間的增加，酶的持續(xù)水解會(huì)影響牦牛皮蛋白水解產(chǎn)物中的肽段氨基酸組成和構(gòu)象，深度水解會(huì)破壞抗氧化肽的結(jié)構(gòu)從而會(huì)影響到水解物的抗氧化活性[28]。結(jié)合圖中兩個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)，在水解時(shí)間為10 h時(shí)，兩者都達(dá)到最佳值，牦牛皮抗氧化肽在濃度8 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到95.62%±2.37%，IC50值為2.979 mg/mL；牦牛皮水解度為37.31%±0.23%。不同的水解時(shí)間對(duì)牦牛皮抗氧化肽的制備工藝影響較明顯，因此，選取水解時(shí)間8～12 h進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖5 水解時(shí)間對(duì)牦牛皮抗氧化肽的水解度及DPPH自由基清除率IC50值的影響Fig.5 Effects of hydrolysis time on the DH of yak hide antioxidant peptides and the IC50 value of DPPH free radical scavenging rate

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇A（水解溫度）、B（酶用量）和C（水解時(shí)間）這3個(gè)單因素為自變量，酶解后的水解度（DH）和對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值為響應(yīng)值，使用Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，相應(yīng)的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面模型的建立與分析 運(yùn)用Design Expert 8.06軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析并進(jìn)行多元回歸擬合，以溫度、酶用量和時(shí)間三個(gè)單因素為自變量，以水解度為響應(yīng)面響應(yīng)值，得到的二元回歸方程為：Y1=38.18+2.50A+2.13B+1.20C-1.05AB-0.78AC-0.17BC-5.91A2-2.16B2-1.71C2；以牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基的IC50值為響應(yīng)面響應(yīng)值，得到的二元回歸方程為：Y2=3.01-0.23A-0.22B-0.13C+0.22AB-0.036AC+0.11BC+0.91A2+0.17B2+0.32C2。方差分析結(jié)果見表3、表4。

表3 水解度回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of hydrolysis degree regression model

表4 DPPH自由基清除率IC50值回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of DPPH free radical scavenging rate IC50 value regression model

由表3可知水解度的回歸模型F值為58.61，P＜0.01，失擬項(xiàng)P=0.4629＞0.05，說明所得模型極顯著，模型失擬項(xiàng)不顯著，得到的回歸方程的擬合度較高；模型決定系數(shù)R2=0.9869，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.9701，說明該模型可以解釋97.01%的響應(yīng)值變化，該模型的水解度的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值良好，回歸方程可以用來分析與預(yù)測(cè)酶法水解制備牦牛皮抗氧化肽的工藝結(jié)果。同時(shí)模型中A、B、C、A2、B2和C2對(duì)水解度都有極顯著的影響（P＜0.01），AB對(duì)水解度的影響顯著（P＜0.05），其余不顯著（P＞0.05）。通過方差分析中F值的大小可評(píng)價(jià)各因素對(duì)指標(biāo)的影響程度，F(xiàn)值越大影響越顯著[29]。因此對(duì)工藝的影響順序依次為：水解溫度＞酶用量＞水解時(shí)間。

由表4可知牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基IC50值的回歸模型F值為45.22，P＜0.01，失擬項(xiàng)P=0.2441＞0.05，說明所得模型極顯著，模型失擬項(xiàng)不顯著，得到的回歸方程的擬合度較高；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9831，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.9614，說明該模型可以解釋96.14%的響應(yīng)值變化，該模型的牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基IC50值的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值良好，所得的回歸方程可以用于分析與預(yù)測(cè)酶法水解制備牦牛皮抗氧化肽的工藝結(jié)果。模型中A、B、AB、A2、C2對(duì)牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基IC50值都有極顯著的影響（P＜0.01），C和B2對(duì)牦牛皮水解物的DPPH自由基清除率IC50值影響顯著（P＜0.05）。依據(jù)F值大小能夠得出對(duì)工藝的影響順序依次為：溫度＞酶用量＞時(shí)間。

2.2.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析 響應(yīng)曲面坡度和凹凸程度能夠反映各因素對(duì)牦牛皮抗氧化肽提取的影響大小[30]，三維響應(yīng)面的坡度陡峭和曲率越大則說明兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，如果坡度相對(duì)比較平緩，則表示當(dāng)兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值變化影響較小[31-32]。兩因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響如圖6所示。由圖6a～圖6c可以看出，圖6a響應(yīng)曲面陡峭，等高線密集，說明溫度與酶用量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。在因素水平范圍內(nèi)溫度和酶用量交互作用的顯著程度大于時(shí)間與溫度和時(shí)間與酶用量。從圖6d～圖6f響應(yīng)面的坡度與等高線的密集程度可知，溫度和酶用量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響相對(duì)于溫度與時(shí)間、酶用量與時(shí)間的交互作用更為顯著。

圖6 各因素交互對(duì)水解度及對(duì)DPPH自由基清除率IC50值影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the interaction of various factors on the degree of hydrolysis and the IC50 value of DPPH radical scavenging rate

2.2.4 最佳工藝條件確定及驗(yàn)證 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析回歸模型，得到水解牦牛皮抗氧化肽的最佳工藝條件為：水解溫度50.77 ℃，酶用量10889.68 U/g，水解時(shí)間10.59 h。為進(jìn)一步確定最佳工藝，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，得到的實(shí)際最佳工藝為：水解溫度51 ℃，酶用量 10890 U/g，水解時(shí)間 10.6 h，pH8.5，底物濃度5%。預(yù)測(cè)的水解度為39.02%、清除DPPH自由基的IC50值為2.953 mg/mL。進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到實(shí)際水解度為41.39%±0.69%，與預(yù)測(cè)值相差5.73%；牦牛皮抗氧化肽清除DPPH自由基的IC50值為2.884 mg/mL，與預(yù)測(cè)值相差2.34%，牦牛皮抗氧化肽濃度為8 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到92.73%±0.47%。兩者實(shí)測(cè)值均接近預(yù)測(cè)值，說明該響應(yīng)面模型得到的參數(shù)可靠。

2.3 牦牛皮抗氧化肽體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 從圖7a中可知，VC對(duì)DPPH 自由基有顯著清除作用（P＜0.05） ，VC水溶液在1～12 mg/mL范圍內(nèi)各濃度之間對(duì)DPPH自由基清除率無顯著性差異（P＞0.05）；與VC相比牦牛皮抗氧化肽對(duì)DPPH自由基有較好的清除活性，在濃度為8～12 mg/mL時(shí)清除率比較接近VC，并且不再增加（P＞0.05）。牦牛皮抗氧化肽濃度為8 mg/mL時(shí)達(dá)到最大DPPH自由基清除率，為92.73%±0.47%，其清除DPPH自由基的IC50值為2.884 mg/mL，根據(jù)從動(dòng)物中提取的抗氧化肽清除DPPH自由基的IC50值來看，海參性腺水解物IC50為3.39 mg/mL[33]、南極磷蝦多肽IC50為5.65 mg/mL[34]、豬肩胛骨酶解液IC50為4.59 mg/mL[35]，對(duì)比結(jié)合本實(shí)驗(yàn)所得牦牛皮抗氧化肽的DPPH自由基清除率IC50值，可以表明其具有較好的抗氧化活性。

圖7 不同濃度下牦牛皮抗氧化肽的體外抗氧化能力Fig.7 Antioxidant capacity of yak hide antioxidant peptides in vitro at different concentrations

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 由圖7b可知，VC對(duì)ABTS+自由基有顯著清除作用，VC水溶液在1～12 mg/mL范圍內(nèi)各濃度之間對(duì)ABTS+自由基清除率無顯著性差異（P＞0.05）；與VC相比，牦牛皮抗氧化肽對(duì)ABTS+自由基有較好的清除活性，在濃度為1～10 mg/mL時(shí)，清除率隨濃度的增加出現(xiàn)明顯增長（P＜0.05），呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，并在濃度為 10～12 mg/mL 時(shí)清除率趨于平緩，不再增加（P＞0.05），牦牛皮抗氧化肽濃度為10 mg/mL時(shí)，最大ABTS+自由基清除率為89.58%±1.11%，其清除ABTS+自由基的IC50值為2.110 mg/mL。

2.3.3 羥自由基清除能力 由圖7c可知，VC對(duì)羥自由基有顯著的清除作用，VC水溶液在1～12 mg/mL范圍內(nèi)各濃度之間對(duì)羥自由基清除率無顯著性差異（P＞0.05）；與VC相比牦牛皮抗氧化肽對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除活性，在濃度從1增加到8 mg/mL時(shí)清除率隨濃度的增加出現(xiàn)顯著增長（P＜0.05），呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，并在濃度為10～12 mg/mL時(shí)趨于不變，無顯著性差異（P＞0.05），在牦牛皮抗氧化肽濃度為8 mg/mL時(shí)達(dá)到最大清除率90.05%±0.13%，其清除羥自由基的IC50值為2.523 mg/mL。

2.3.4 還原能力 由圖7d可知，VC水溶液在 1～5 mg/mL范圍內(nèi)的吸光度值出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），5 mg/mL之后吸光度值不再增加，各濃度之間無顯著性差異（P＞0.05）；與VC相比牦牛皮抗氧化肽的還原能力，在濃度從1 mg/mL增加到12 mg/mL時(shí)吸光度值隨濃度的增加呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），說明隨濃度增加反應(yīng)體系中普魯士藍(lán)的生成量在增多，也能說明牦牛皮抗氧化肽具有一定的還原能力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以牦牛皮蛋白為原料，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法建立酶法水解牦牛皮蛋白制備抗氧化肽工藝的回歸模型，所得到的模型顯著，回歸方程擬合度較好。并通過對(duì)回歸方程的分析解決多變量問題，尋找最佳水解工藝，經(jīng)分析兩者對(duì)水解工藝的影響程度均為：溫度＞酶用量＞時(shí)間。得到的最佳水解工藝為：水解溫度51 ℃，酶用量10890 U/g，水解時(shí)間10.6 h，pH8.5，底物濃度5%，此工藝條件下的實(shí)際水解度為41.39%±0.69%、對(duì)DPPH自由基清除率IC50值為2.884 mg/mL，水解物濃度8 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到92.73%±0.47%，與預(yù)測(cè)值接近，表明通過響應(yīng)面分析得到的回歸方程能較好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

通過體外的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，牦牛皮抗氧化肽對(duì)DPPH·、ABTS+·和羥自由基的清除率的 IC50值分別為2.884、2.110、2.523 mg/mL，并且還原能力也較強(qiáng)，這可以表明提取的牦牛皮抗氧化肽具有良好的抗氧化能力，可以作為天然抗氧化肽的原料來源。