胡盼盼

（呂梁學院生命科學系, 山西呂梁 033000）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）是藥食同源的植物之一[1]，屬于胡頹子科沙棘屬喬木或灌木，在我國沙棘資源占世界沙棘資源的90%以上[2]，多個地區(qū)均有分布，因此我國有“沙棘王國”之稱[3]。目前沙棘的應用主要集中在沙棘果實[4]，沙棘葉的研究較少，還未得到有效的開發(fā)和利用[5]。許多研究表明沙棘葉和沙棘果一樣富含豐富的黃酮[6]、多糖[7]等化合物，具有抗突變、抗菌、抗氧化等生物活性，并且沙棘葉產(chǎn)量大、易收集、容易貯藏。因此，研究沙棘葉多糖的提取工藝及其生物活性具有重要的實際意義。

結直腸癌（Colorectal cancer）是主要發(fā)生在結腸和直腸中的一種發(fā)病率和死亡率都較高的惡性腫瘤[8]，具有高復發(fā)率及高轉移率等的特征[9-10]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計其死亡率位于第二位，發(fā)病率位于全球癌癥的第三位[11]。目前針對結腸癌的治療手段主要手術及化療，但會對患者造成巨大痛苦，因此尋找一種能抑制結直腸癌的發(fā)生，提高患者生存質量和減少患者痛苦的天然物質成為迫在眉睫需要解決的問題[12]。植物多糖被證實具有抗腫瘤活性，如Liang等[13]從靈芝提取得到多糖GLPs，研究表明GLPs可以顯著的增加LoVo結腸癌細胞形態(tài)變化，細胞caspas-3,-8,-9的表達，促進細胞凋亡。Mao等[14]研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖（LBP）對SW480細胞和Caco-2均具有顯著的抑制作用，并通過G0/G1細胞周期的阻滯發(fā)揮促凋亡作用。陳貴娥等[15]研究發(fā)現(xiàn)蘋果多糖可以有效地抑制SW-620結腸癌細胞的侵襲與遷移，濃度依賴性地上調E-cadherin、下調N-cadherin的蛋白表達來發(fā)揮抑制作用。本論文采用正交設計試驗優(yōu)化呂梁沙棘葉多糖提取工藝，并分析其對結腸癌CT-26細胞的抑制作用，旨在為將來對沙棘葉多糖的結構解析以及生物活性的進一步研究提供理論依據(jù)，為綜合開發(fā)利用呂梁市沙棘資源提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘葉 于每年九月份采摘自呂梁汾陽市城子藥材種植有限公司；結腸癌CT-26細胞 通派上海生物科技有限公司；苯酚、濃硫酸、無水乙醇 均為分析純，河南東科化工產(chǎn)品銷售有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基 Hyclone公司；PBS、DMSO、胰酶、戊二醛、胎牛血清、雙抗、PI染液 上海碧云天生物有限公司。

VS-502FD型凍干機 河南?？藸杻x器儀表有限公司；BPN-50CHUV型細胞培養(yǎng)箱 濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；InfiniteM200型酶標儀 瑞士TECAN公司；S-1-150S型高速離心機 德國Sigma公司；CT115C型滅菌鍋 姜堰市新康醫(yī)療器有限公司；KQ2200B型超聲波儀 上海儀天科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘葉多糖提取工藝 采用超聲波波輔助提取沙棘葉多糖。采摘形狀完整、顏色均勻的新鮮沙棘葉到實驗室，充分清洗干凈后，放入50 ℃的恒溫干燥箱干燥后粉碎，過30目篩。取沙棘葉粉100 g，加入500 mL水，超聲波波萃取后進行濃縮，采用Sevag法去除蛋白，加入95%無水乙醇進行醇沉，離心得到沉淀，加入蒸餾水，采用苯酚-硫酸法[7]（y=0.0531x-0.0029，R2=0.9987）測定沙棘葉多糖的得率，冷凍干燥得到沙棘葉粗多糖，最后取一定量的粗多糖配制成多糖溶液來測定其純度。

1.2.2 單因素實驗 超聲波功率為300 W、超聲波時間為20 min，超聲波次數(shù)為1次時，選取60、70、80、90 ℃研究超聲波溫度對多糖得率的影響；超聲波溫度為80 ℃、超聲波時間為20 min，超聲波次數(shù)為1次時，選取200、300、400、500 W研究超聲波功率對多糖得率的影響；超聲波溫度為80 ℃、超聲波功率為400 W、超聲波次數(shù)為1次時，選取10、20、30、40 min研究超聲波時間對多糖得率的影響；超聲波溫度為80 ℃、超聲波功率為400 W、超聲波時間為30 min時，選取1、2、3、4次研究超聲波次數(shù)對多糖得率的影響。

1.2.3 正交設計優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素實驗結果，4個因素：超聲波溫度（A）、超聲波功率（B）、超聲波時間（C）、超聲波次數(shù)（D）各選擇3個水平進行正交試驗，以多糖得率為試驗結果，設計了L9（34）的正交試驗。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Design of orthogonal experimental factors

1.2.4 MTT試驗 待CT-26細胞生長狀態(tài)良好后消化收集并調整細胞濃度為105個/mL，每孔100 μL加入96孔板。將終濃度為0、250、500、1000、2000、2500 μg/mL的沙棘葉粗多糖加入96孔板中，各設置5個重復孔。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)72 h后倒走舊液，加入PBS清洗兩遍，然后每孔中加入100 μL的0.5 mg/mL MTT，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)4 h，倒走MTT后每孔中加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min后用酶標儀在490 nm下測定吸光值，計算細胞活力[16]。

1.2.5 透射電鏡觀察細胞形態(tài) CT-26細胞經(jīng)過沙棘葉多糖處理72 h后，胰酶消化后收集細胞至1.5 mL離心管，使用預冷PBS清洗兩次，加入戊二醛，4 ℃溫度下靜置過夜，之后PBS清洗兩次，之后交至哈爾濱醫(yī)科大學電鏡中心進行后續(xù)透射電鏡實驗。

1.2.6 細胞周期測定 將細胞以1×106個/mL接種于六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔2 mL。待細胞長滿后加入終濃度為 2000 μg/mL的沙棘葉粗多糖，培養(yǎng)72 h后，胰酶消化細胞，和上清液中合并后離心（1000 r/min，5 min）；用 4 ℃ 預冷 PBS 清洗三次后加入-20 ℃預冷的70%的乙醇1 mL，放于4 ℃過夜固定；離心后倒掉固定液，PBS清洗兩次，離心后加入0.5 mL 的PI染液（含100 μg/mL RnaseA，100 μg/mL，0.2%Triton X-100），在避光環(huán)境下反應30 min之后通過流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.2.7 反轉錄酶-聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR） 經(jīng)過2000 μg/mL的沙棘葉粗多糖處理CT-26細胞72 h后，收集細胞，采用Trizol法提取細胞的總RNA，根據(jù)試劑盒說明書反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板，進行擴增反應，以β-actin為內(nèi)參，采用RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA的表達水平。

1.2.8 Western blot 經(jīng)過 2000 μg/mL的沙棘葉多糖處理CT-26細胞72 h后，收集細胞，RIPA裂解細胞提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將樣品進行SDS-PAGE電泳后進行轉膜，脫脂奶粉封閉后孵育一抗，洗膜三次后孵育二抗，最后加入發(fā)光液進行曝光，并對條帶進行灰度掃描。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗都重復三次，結果以平均值±標準差表示，使用GraphPad Prism 5軟件進行one-way ANOVA分析并作圖，P＜0.05表示數(shù)據(jù)之間差異顯著。不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 超聲波溫度對沙棘葉多糖得率的影響

超聲波溫度對沙棘葉多糖得率的影響見圖1，溫度對沙棘葉多糖的得率具有一定影響。由圖1可知，超聲波溫度在60 ℃時，多糖的得率較低，隨著超聲波溫度的增加，多糖得率也不斷增大，在80 ℃時，沙棘葉多糖得率最大（P＜0.05），這可能是由于隨著溫度不斷升高，沙棘葉溶解度升高，提取較為充分。因此正交設計試驗超聲波溫度為70～90 ℃。

圖1 超聲波溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharide yield

2.2 超聲波功率對沙棘多糖得率的影響

超聲波功率對沙棘葉多糖得率的影響見圖2。由結果可知，沙棘葉多糖的得率隨著超聲波功率的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。超聲波功率為200 W時，多糖得率僅有4%；在400 W時，沙棘葉多糖的得率達到最大，顯著高于其他功率組（P＜0.05），之后得率反而減少，這可能是由于在一定功率范圍內(nèi)有利于細胞的破壁，而功率過大過小均可能由于破壁不充分或破壞多糖結構而導致多糖得率的減少[17]。因此設定超聲波功率為300～500 W。

圖2 超聲波功率對多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.3 超聲波時間對沙棘多糖得率的影響

超聲波時間對沙棘葉多糖得率的影響見圖3。由結果可知，超聲波時間能夠明顯影響沙棘葉多糖的得率。處理時間20 min時，沙棘多糖得率最低，隨著超聲波時間的延長，沙棘葉多糖得率不斷增加，超聲波30 min的時候，多糖得率達到最大（P＜0.05），并且繼續(xù)延長超聲波的時間，對多糖得率影響較小。這可能是由于超聲波處理時間越長，對細胞壁的破碎程度越大，沙棘葉多糖得率也就越高，但是達到一定處理時間后，溶液滲透壓達到平衡狀態(tài)，多糖得率趨于平穩(wěn)不再增加[18-19]。因此設定超聲波時間為20～40 min。

圖3 超聲波時間對-多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield

2.4 超聲波次數(shù)對多糖得率的影響

超聲波次數(shù)對沙棘葉多糖得率的影響見圖4。結果可知，超聲波處理一次后，沙棘葉多糖得率為6.31%，超聲波處理兩次后，多糖得率最大，顯著高于提取 1、3、4 次組（P＜0.05），但繼續(xù)增加超聲波次數(shù)，多糖得率沒有明顯的增加。因此設定超聲波次數(shù)為1～3次。

圖4 超聲波次數(shù)對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on polysaccharide yield

2.5 正交設計試驗

根據(jù)單因素實驗結果進行了沙棘葉多糖提取工藝的正交優(yōu)化。由表2可知，影響沙棘葉多糖得率的因素大小排序是：B（超聲波功率）＞C（超聲波時間）＞A（超聲波溫度）＞D（超聲波次數(shù)），最佳提取工藝是A1B2C2D2，即超聲波溫度是70 ℃、超聲波功率是400 W，超聲波時間為30 min，超聲波次數(shù)為2次，在此條件下提取得到的沙棘葉多糖得率最多7.95%，之后根據(jù)最優(yōu)提取條件進行三次重復試驗，沙棘葉多糖得率為7.93%±0.07%，與優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)接近，提取參數(shù)可靠。最終所得多糖純度為79.34%±0.17%。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal experimental design and results

2.6 沙棘葉多糖對CT-26細胞的抑制作用

如圖5所示，通過MTT法檢測沙棘葉多糖對CT-26細胞的抑制作用。由圖5可知，當多糖濃度為 250 μg/mL 的時候，抑制效果不顯著（P＞0.05），但隨著沙棘葉多糖濃度的增加，抑制作用越來越明顯，呈現(xiàn)濃度依賴性。當多糖濃度增加到2000 μg/mL時，抑制作用達到最大（P＜0.05），繼續(xù)增加到2500 μg/mL時抑制效果差異不顯著（P＞0.05），因此采用2000 μg/mL濃度做后續(xù)的研究。

圖5 沙棘葉多糖對CT-26細胞的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of sea buckthorn polysaccharide on CT-26 cells

2.7 細胞形態(tài)變化

細胞凋亡指的是細胞程序性死亡，在此過程中細胞形態(tài)會發(fā)生明顯的變化[20-21]。如圖6所示，對照組細胞形態(tài)正常，各個結構正常，細胞表面絨毛正常，經(jīng)過2000 μg/mL沙棘葉多糖處理后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞核固縮，細胞內(nèi)細胞器排序紊亂，大量液泡產(chǎn)生，內(nèi)質網(wǎng)腫脹且細胞表面出現(xiàn)明顯的凋亡小體，由此說明沙棘葉多糖能夠抑制CT-26細胞的生長，誘導其發(fā)生凋亡。

圖6 透射電鏡觀察細胞變化Fig.6 Changes of cells observed by transmission electron microscope

2.8 沙棘葉多糖對細胞周期及凋亡率的影響

細胞周期分為分裂期（M期）、DNA合成前期（G0期）、DNA合成后期（G1期）和DNA合成期（S期）[22]。本試驗檢測2000 μg/mL的沙棘葉多糖處理CT-26細胞72 h后對細胞周期的影響，結果如圖7所示。與對照組相比，多糖組細胞G1期減小，但差異不顯著（P＞0.05），G2期也明顯的減小，差異也不顯著（P＞0.05），S 期細胞數(shù)量顯著性增多（P＜0.05），細胞凋亡數(shù)量顯著增加（P＜0.05），由此說明，沙棘葉多糖可以通過通過阻滯CT-26細胞的S期來抑制細胞的生長。

圖7 沙棘葉多糖對CT-26細胞周期和凋亡率的影響Fig.7 Effect of polysaccharide from seabuckthorn leaves on cell cycle and apoptosis ratio of CT-26

2.9 沙棘葉多糖對凋亡相關基因的影響

將2000 μg/mL沙棘葉多糖加入CT-26細胞并處理72 h后，通過RT-PCR方法檢測細胞中caspase-3、Bax、Bcl-2基因的表達變化。結果如圖8所示，經(jīng)過多糖處理后，caspase-3基因和Bax基因表達量顯著增大（P＜0.05），Bcl-2基因表達量顯著減?。≒＜0.05）。

圖8 CT-26細胞凋亡相關基因表達變化Fig.8 Effect of polysaccharide on apoptosis gene in CT-26 cell

2.10 沙棘葉對凋亡蛋白的影響

將2000 μg/mL的沙棘葉多糖加入CT-26細胞并處理72 h后，通過Western blot方法檢測細胞中caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達變化。結果如圖9所示，經(jīng)過多糖處理后，Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著增大（P＜0.05），Bax蛋白表達量顯著增大（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達量與基因表達結果不同，沒有顯著性差異（P＞0.05）。Caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在人類細胞中Caspase-3的超量表達和激活均會引起細胞凋亡，因此，又稱死亡蛋白酶[23-24]，Bcl-2家族蛋白也是細胞凋亡過程中重要的凋亡蛋白之一，其蛋白家族中的Bcl-2蛋白可以抑制細胞的凋亡，Bax蛋白具有促進凋亡的作用[25]。由此基因和蛋白結果證明，沙棘葉多糖確實能夠顯著促進CT-26細胞的凋亡。

圖9 CT-26細胞凋亡蛋白表達變化Fig.9 Effect of polysaccharide on apoptosis protein in CT-26 cell

3 結 論

通過單因素實驗和正交試驗對超聲波輔助提取沙棘葉多糖的工藝進行了優(yōu)化，得到最終的優(yōu)化條件是：超聲波溫度為70 ℃、超聲波功率為400 W，超聲波時間為30 min，超聲波次數(shù)為2次。主次因素排序是：超聲波功率＞超聲波時間＞超聲波溫度＞超聲波次數(shù)，通過最優(yōu)條件提取的沙棘葉多糖得率達到最大為7.93%±0.07%。

沙棘粗多糖對結腸癌CT-26細胞具有明顯的抑制作用，通過MTT試驗結果可知，將不同濃度的沙棘葉多糖加入CT-26細胞處理72 h后能夠明顯促進細胞的凋亡，抑制細胞增殖，當多糖濃度為2000 μg/mL時效果最佳，透射電鏡觀察細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)，通過流式細胞儀檢測可知，2000 μg/mL沙棘葉多糖可通過阻滯CT-26細胞的S期來顯著誘導細胞凋亡，由RT-PCR結果可知，沙棘葉多糖處理CT-26細胞后，能夠顯著增加細胞內(nèi)caspase-3表達以及Bax/Bcl-2比值（P＜0.05），由此闡明沙棘葉多糖對結腸癌CT-26細胞具有抑制作用。后續(xù)將對沙棘葉粗多糖進行分離純化，并進一步解析多糖的結構的組成，制備沙棘純多糖來深入研究其抗結腸癌的細胞信號通路，以期為沙棘葉在抗腫瘤領域的綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。