顧華蓉，張琦夢，穆洪濤，趙孟斌，陳瑜珠，高向陽,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院, 廣東省功能食品活性物重點實驗室, 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術廣東省實驗室, 廣東廣州 510642；2.廣東第二師范學院生物與食品工程學院, 廣東廣州 510303；3.汕頭魚露廠有限公司, 廣東汕頭 515021）

魚露是東南亞沿海國家的一種傳統(tǒng)調(diào)味品，以低價值的魚蝦為原料，經(jīng)自然發(fā)酵制成，具有獨特的鮮美風味[1]。魚露中的鮮味肽來自于原料的酶解產(chǎn)物，是魚露獨特滋味形成的重要原因[2]。目前對鮮味肽的研究多集中于分離鑒定，其呈鮮機理與構效關系尚不明確。鮮味肽評價主要依賴感官評價與電子舌分析，然而感官評價主觀性強、誤差大，電子舌又不能完全還原人的感官系統(tǒng)[3]，因此建立新型的鮮味評價模型對鮮味肽的研究具有重要意義。STC-1細胞為小鼠小腸內(nèi)分泌細胞，它可以表達多種鮮味受體與傳導元件，包括CaSR、GPRC6a、T1R1/T1R3、mGluR1、mGluR4、Gα-gustducin、PLC-β2 和 TRPM5[4-5]，其味覺信號傳導機制與舌上皮味覺細胞極其相似[6]，均涉及味覺感受細胞內(nèi)鈣儲存庫中Ca2+的釋放。同時，研究顯示L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸等多種L-氨基酸及寡肽可引起STC-1細胞內(nèi)的鈣離子信號[7-10]，說明STC-1細胞可作為評價鮮味肽的感知模型。此外，Yue等[11]研究發(fā)現(xiàn)黃連等苦味化合物使STC-1細胞內(nèi)鈣離子顯著增加，還使苦味受體TAS2R38的mRNA表達量增加，并通過基因敲除證明苦味化合物激活了TAS2R38受體。毛赟燕[12]用不同濃度的甜味劑刺激STC-1細胞，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)鈣離子濃度隨蔗糖濃度增加而升高，且蔗糖可誘導甜味受體mRNA表達。這些研究表明具有鮮味、苦味、甜味或濃厚感的物質(zhì)能引起STC-1細胞內(nèi)鈣離子信號響應以及相應味覺受體mRNA表達量的增加。然而，利用STC-1細胞對味覺物質(zhì)的劑量效應研究卻鮮有報道。

實驗室前期從傳統(tǒng)發(fā)酵1.5年的潮汕魚露中分離鑒定出了多種二肽與三肽，其中大多數(shù)含有脯氨酸。脯氨酸是甜味氨基酸[13]，且Shinoda等[14]研究發(fā)現(xiàn)含有脯氨酸殘基的苦味肽所呈現(xiàn)的苦味較溫和、易被接受甚至令人愉悅，說明已鑒定出的脯氨酸二肽可能對魚露鮮美滋味的形成起到重要作用。因此，本研究以實驗室從魚露中鑒定得到的12個脯氨酸二肽[2]為研究對象，利用STC-1細胞味覺感知模型，通過鈣離子成像技術探究脯氨酸二肽呈味強度與濃度的關系，并通過實時熒光定量PCR探究介導魚露脯氨酸二肽呈鮮的主要受體。本研究利用STC-1小鼠小腸內(nèi)分泌細胞客觀反映了鮮味肽的劑量效應，提供了一種鮮味肽呈味特性的新型評價方法，并為鮮味肽呈味機理與構效關系的研究提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚露中鑒定得到并進行固相合成的12個脯氨酸二肽（Ser-Pro、Pro-Ser、Gly-Pro、Pro-Gly、Ala-Pro、Pro-Ala、Val-Pro、Pro-Val、Tyr-Pro、Pro-Tyr、Ile-Pro、Pro-Ile）、二肽 pGlu-Pro（純度≥98%）、qRTPCR引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；谷氨酸鈉、蔗糖、檸檬酸、氯化鈉 食品級，廣州利成實業(yè)有限公司；奎寧 色譜純，廣州叢源儀器有限公司；STC-1小鼠小腸內(nèi)分泌細胞（338701） 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；杜氏細胞培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）（不含鈣鎂、酚紅）、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、PBS緩沖液生化試劑 Gibco公司；Fluo-8 AM 超級純，上海懋康生物科技有限公司；Steady Pure Universal RNA Extraction Kit、Evo M-MLV Premix for qPCR、SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit 湖南艾科瑞生物工程有限公司。

ZA120R4萬分之一分析天平 上海贊維衡器有限公司；Nikon ECLIPSE Ti系列倒置顯微鏡 日本尼康；5415R高速冷凍離心機 德國 Eppendorf；SMA4000微量紫外分光光度計 Merinton公司；A100基因擴增儀 杭州朗基科學儀器有限公司；StepOne實時熒光定量PCR儀 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官評價 感官評價小組由10名味覺正常的學生組成（5女5男，年齡在20～25歲），并依據(jù)GB/T 16291.1-2012[15]接受了感官培訓以辨別五種基本味覺（酸、甜、苦、咸、鮮）。參考叢艷君等[16]分別以檸檬酸（0.8 mg/mL）、蔗糖（10 mg/mL）、奎寧（0.8 mg/mL）、氯化鈉（3.5 mg/mL）和谷氨酸鈉（3.5 mg/mL）作為酸、甜、苦、咸、鮮的評價標準。樣品以超純水溶解，肽的初始濃度為2 mg/mL，并在此濃度下進行感官描述評價。采用三角試驗法[17]確定每個魚露二肽的味覺閾值，將恰好可以區(qū)分樣品與空白溶液時的稀釋倍數(shù)記為味覺稀釋因子（Taste dilution，TD），該濃度即為肽的味覺閾值。稀釋因子采用各感官評價員評定結果的平均值，且每個評定員之間的誤差應不超過2個稀釋水平。感官評價在恒定溫度（24±1 ℃）下進行。

1.2.2 STC-1細胞內(nèi)鈣離子熒光信號測定 以8×104個/孔的密度將STC-1細胞接種于24孔板，每孔加500 μL含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h至細胞占據(jù)孔板的70%左右時進行實驗，用5 μmol/L Fluo-8 AM鈣離子熒光探針在37 ℃孵育細胞30 min，分別用HBSS與DMEM基礎培養(yǎng)液（不含酚紅）對細胞進行漂洗與脫酯化。將細胞置于熒光倒置顯微鏡下，在第20 s加入不同濃度的谷氨酸鈉或脯氨酸二肽溶液，于490 nm（激發(fā)波長）和514 nm（發(fā)射波長）波長處采集細胞內(nèi)鈣離子熒光信號，每5 s一次圖像采集，持續(xù)180 s。樣品均以HBSS溶解，其中谷氨酸鈉（monosodium glutamate, MSG）終濃度為 0.5、1、2、4、8 mmol/L，二肽終濃度為 0.25、0.5、1、2、4 mmol/L，空白組加入等量HBSS。

1.2.3 STC-1細胞鮮味受體mRNA表達量測定 將生長匯集至60%左右的STC-1細胞在含有3 mmol/L二肽的培養(yǎng)液中孵育8 h，提取細胞總RNA并反轉錄，再采用SYBR Green嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR，以鼠源GAPDH基因作為內(nèi)參基因，檢測不同二肽刺激下細胞內(nèi)T1R1、T1R3、CaSR和GPRC6a受體mRNA表達量的變化。qPCR反應體系為20 μL：4 μL SYBR Green Premix Pro Taq HS Premix，2 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，其余用去離子水補齊。反應程序為：第一步：95 ℃，30 s；第二步：95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40個循環(huán)。引物序列如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

鈣離子信號的響應強度表示為相對熒光變化[18]：

式中：F表示實際熒光值，即細胞區(qū)域“實時熒光值-背景熒光值”；F0代表0 s時的“F”。使用NISElements軟件處理采集到的熒光圖像，每次試驗選擇30個細胞區(qū)域進行統(tǒng)計。本實驗每組平行測定4次。

qPCR實驗每個肽樣品設置3個實驗平行，每個基因設置3個復孔，T1R1、T1R3、CaSR和GPRC6a的 mRNA 相對表達量表示為 2-ΔΔCt，ΔΔCt為實驗組與對照組目的基因校正后PCR反應循環(huán)數(shù)的差值，其計算公式為：

實驗結果以平均值±標準偏差（mean±SD）表示，利用SPSS 25.0軟件對結果進行單因素方差分析，選擇LSD法進行多重比較，數(shù)據(jù)后標注的不同字母表示數(shù)據(jù)間具有顯著性差異（P＜0.05）。采用GraphPad Prism 8.0.1進行圖像繪制。

2 結果與分析

2.1 脯氨酸二肽的感官評價

對13個合成脯氨酸二肽進行感官評價，其感官特性與稀釋因子如表2所示。感官描述結果顯示，所有二肽在2 mg/mL濃度下多具有酸味和鮮味，均未表現(xiàn)出苦味。二肽的酸味主要由于R基或C端殘基中羧基的存在，其解離出的氫離子是引起酸味的重要物質(zhì)[19]。目前已報道的鮮味肽中，有很多肽不僅具有鮮味，同時還可能呈現(xiàn)一定的酸味、甜味、濃厚感或收斂感，這說明鮮味肽的呈味效果不是單一的，而可能具有豐富的口感[20]。因此，本研究中的魚露二肽可能對魚露的呈鮮起到了重要作用。此外，稀釋因子越大，說明肽的閾值越低，則呈味閾值較低的二肽有Ser-Pro、Gly-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Tyr-Pro、Pro-Ile和 pGlu-Pro。

表2 脯氨酸二肽的感官評價結果Table 2 Sensory evaluation of proline dipeptides

2.2 STC-1細胞對脯氨酸二肽鈣離子熒光響應

首先對鮮味基準物谷氨酸鈉引起的STC-1細胞響應進行測定。分別用0.5、1、2、4、8 mmol/L的谷氨酸鈉溶液刺激STC-1細胞，得到細胞內(nèi)鈣離子熒光強度隨時間變化的曲線（圖1）。相對熒光變化率大于0代表胞內(nèi)鈣離子濃度增加，說明樣品引起了細胞響應。由圖1可看出，相對熒光強度在加入谷氨酸鈉后迅速增加，持續(xù)一段時間后熒光開始減弱并逐漸恢復至平常狀態(tài)。圖1中顯示谷氨酸鈉在0.5 mmol/L時未引起明顯相對熒光變化，而在濃度達到1 mmol/L時引起明顯鈣熒光信號，說明其閾值介于0.5～1 mmol/L之間。人對谷氨酸鈉的感官閾值為0.012 g/100 mL[21]，即0.7 mmol/L，與本實驗結果相符合。為了盡可能排除加入樣品時物理壓力所引起的胞內(nèi)鈣離子濃度變化帶來的誤差，將相對熒光變化值大于或等于0.1（ΔF/F0≥0.1）視為有效鈣信號，同時將能夠引起ΔF/F0≥0.1的最低濃度記作細胞對刺激物的響應閾值，因此，將1 mmol/L記錄為STC-1細胞對谷氨酸鈉的響應閾值。

圖1 不同濃度谷氨酸鈉引起的STC-1細胞鈣離子熒光響應Fig.1 Calcium fluorescence response in STC-1 cells induced by different concentrations of MSG

根據(jù)谷氨酸鈉濃度，將13個脯氨酸二肽分別以0.25、0.5、1、2、4 mmol/L濃度刺激 STC-1細胞，得到不同程度的鈣信號響應曲線。pGlu-Pro是一種已在醬油、麥麩等物質(zhì)中被分離鑒定出來的鮮味肽[22]，圖2表明pGlu-Pro引起了STC-1細胞內(nèi)的鈣離子信號，進一步證明STC-1細胞可對鮮味物質(zhì)產(chǎn)生響應。魚露脯氨酸二肽引起的鈣離子響應情況如圖3所示，結合感官評價結果，所有脯氨酸二肽均未呈現(xiàn)苦味，說明鈣信號并不由苦味引起，而可能主要由二肽激活其他G蛋白偶聯(lián)受體（如鮮味或甜味受體）所引起。與谷氨酸鈉響應曲線類似，在加入樣品后，胞內(nèi)鈣離子濃度在短時間內(nèi)迅速增加至最大值再逐漸回歸常態(tài)。但是有些肽的曲線在一段時間內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)并緩慢回落，而有些會在達到頂峰后迅速降低，這可能與肽的呈味特性有關。其中，Gly-Pro、Ala-Pro、Ser-Pro與pGlu-Pro的熒光曲線變化相對平滑，在達到峰值后回落緩慢，說明細胞內(nèi)的鈣離子能在一定時間內(nèi)保持較高濃度，這可能會引起下游信號的持續(xù)傳遞，從而可能使得這些肽的呈味持續(xù)性較強且口感醇厚。相反有些肽的熒光信號由峰值回落的過程迅速，曲線較為尖銳，這可能表明肽的后味或持續(xù)感不足。

圖2 不同濃度pGlu-Pro引起的STC-1細胞鈣離子熒光響應Fig.2 Calcium fluorescence response in STC-1 cells induced by different concentrations of pGlu-Pro

圖3 不同濃度脯氨酸二肽引起的STC-1細胞鈣離子熒光響應Fig.3 Calcium fluorescence response in STC-1 cells induced by different concentrations of proline peptides

將13個脯氨酸二肽與谷氨酸鈉的鈣離子熒光信號響應在相同氨基酸濃度下進行比較，各濃度下的熒光響應強度如折線圖4所示。除Pro-Ser與Val-Pro未引起有效鈣信號（ΔF/F0≥0.1），其余11個二肽均引起不同程度的鈣信號增強，其中Ser-Pro、Gly-Pro、Pro-Gly、pGlu-Pro、Ile-Pro與 Pro-Ile的熒光響應隨氨基酸濃度增加而增強；Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Tyr-Pro與Pro-Tyr的響應強度在一定范圍內(nèi)隨濃度增加而增加，而達到一定濃度后，其響應強度反而減弱。這說明肽的呈味效果可能并不會隨著濃度的增加而一直增強，而可能濃度越大，呈味效果越差。Zhuang等[23]通過感官評價實驗發(fā)現(xiàn)多肽ALPEEV、LPEEV、EAGIQ在濃度小于2 g/L時對谷氨酸鈉有增鮮作用，而在濃度超過2 g/L后，肽會呈現(xiàn)出非常強烈的酸澀味，反而會抵消增鮮作用。Xu等[24]自草菇鑒定出鮮味肽ASNMSDL與LQPLNAH，在谷氨酸鈉的存在下，這兩個多肽的鮮味強度在濃度為15 mg/mL之前隨肽濃度的增加而增強，而在超過15 mg/mL之后鮮味下降。本實驗從細胞響應的角度也得到了相似的結論。此外，Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala與pGlu-Pro在各濃度下的鈣信號強度均高于谷氨酸鈉，推測它們可能具有優(yōu)于鮮味基準物的呈味強度，而Tyr-Pro幾乎在各濃度下的鈣信號均弱于谷氨酸鈉。

圖4 脯氨酸二肽的熒光響應強度隨濃度變化情況Fig.4 Fluorescence response intensity of proline dipeptides varies with concentration

STC-1細胞對脯氨酸二肽的鈣離子熒光響應情況如表3所示，11個引起鈣信號的二肽中，除Pro-Gly的閾值為2 mmol/L，其余10個肽的響應閾值均小于或等于1 mmol/L，其中在相同氨基酸濃度下閾值低于谷氨酸鈉的二肽有Ser-Pro、Gly-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Pro-Ile、pGlu-Pro。結合感官評價結果，這些鈣信號響應閾值較低的二肽也具有較大的稀釋因子，說明二肽的呈味閾值與細胞響應閾值有一定相關性。兼具最低響應閾值（0.25 mmol/L）與較強最大信號響應（ΔF/F0≥0.5）的肽有 Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val與 Pro-Ile，表明這些二肽具有較強的呈鮮特性。在實驗濃度范圍內(nèi)，除Tyr-Pro外的10個脯氨酸二肽的最大鈣信號強度均高于谷氨酸鈉，將其按數(shù)值大小排序為Ile-Pro≈Pro-Val＞Ser-Pro＞Ala-Pro＞Pro-Ala＞Pro-Tyr＞Pro-Ile＞Gly-Pro≈Pro-Gly≈pGlu-Pro（“≈”表示兩者無顯著性差異）。

表3 STC-1細胞對脯氨酸二肽的鈣離子熒光響應情況Table 3 Calcium fluorescence response of STC-1 cells to proline dipeptides

2.3 脯氨酸二肽對STC-1細胞鮮味受體mRNA表達量的影響

文獻報道采用甜味或苦味化合物、氨基酸及濃厚感肽刺激STC-1細胞，發(fā)現(xiàn)相應味覺受體的mRNA表達量增加，并通過基因敲除等方法驗證了這些味覺物質(zhì)的呈味依賴于相應受體，說明味覺物質(zhì)能促進相應味覺受體mRNA的表達[10-12]。異源二聚體T1R1/T1R3已被確定是主要的鮮味受體[25-26]；CaSR與GPRC6a對某些L-氨基酸敏感，被看作是鮮味的候選受體[20,27-29]。因此本研究對魚露脯氨酸二肽刺激下STC-1細胞中T1R1、T1R3、CaSR和GPRC6a基因的mRNA表達量進行測定，探究脯氨酸二肽對鮮味受體基因表達的影響，進而判斷介導脯氨酸二肽呈鮮的受體。結果如圖5所示，相對表達量大于1說明實驗組的mRNA表達量大于空白組。在含有3 mmol/L二肽的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 h后，細胞中各個鮮味受體的mRNA表達量發(fā)生了不同程度的變化。已報道的鮮味肽pGlu-Pro對T1R1、T1R3和GPRC6a的mRNA表達量有上調(diào)作用，證明鮮味物質(zhì)可促進鮮味受體mRNA的表達。

圖5 脯氨酸二肽對STC-1細胞鮮味受體mRNA表達量的影響Fig.5 Effect of proline dipeptides on mRNA expression of umami receptors in STC-1 cells

13個脯氨酸二肽中有11個肽對T1R1的mRNA表達具有上調(diào)作用，其中Ser-Pro、Gly-Pro、Pro-Gly、Ala-Pro、Pro-Val、Tyr-Pro與 pGlu-Pro對T1R1上調(diào)作用顯著（P＜0.05），多為X-Pro肽，說明這些脯氨酸二肽可能激活了T1R1受體從而呈現(xiàn)鮮味。有8個肽對T1R3的mRNA表達有上調(diào)作用，其中具有顯著上調(diào)作用（P＜0.05）的均為Pro-X二肽（Pro-Gly、Pro-Val、Pro-Ile），而有輕微上調(diào)作用的均為XPro二肽（Ser-Pro、Gly-Pro、Ala-Pro、Val-Pro、pGlu-Pro）。日本學者認為CaSR是濃厚感物質(zhì)的主要感受器，可感知濃厚感肽[30]，結果顯示Pro-Tyr與Ile-Pro對T1R1、T1R3無顯著影響，但對CaSR有顯著上調(diào)作用，說明它們可能激活了CaSR而呈現(xiàn)濃厚感。對GPRC6a有顯著上調(diào)作用的肽有Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Pro-Ile與 pGlu-Pro，其中在 Ala-Pro與Pro-Ala的影響下GPRC6a的mRNA表達量分別達到了空白組的29倍和16.5倍左右，這可能與GPRC6a對小分子中性L-氨基酸敏感有關[31]。與鈣信號響應實驗結果一致的是，Pro-Ser與Val-Pro對四個受體的表達并無顯著上調(diào)甚至有抑制效果，進一步解釋了這兩個肽不具有鮮味的原因。

此外，氨基酸組成相同的一對肽，其鈣信號響應活性及對鮮味受體表達的影響大多有明顯區(qū)別，說明肽的一級結構影響其呈味活性。Ishibashi等[32]通過感官評價發(fā)現(xiàn)二肽Phe-Pro的苦味明顯強于Pro-Phe，說明氨基酸的排列順序確實會影響肽的呈味特性。Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Val對四個受體 mRNA的促表達程度均分別強于Pro-Ser、Pro-Ala和Val-Pro，且在胞內(nèi)鈣信號實驗中，Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Val具有更低的閾值及更大的最大響應值，表明二肽的呈味活性與其對鮮味受體mRNA表達的影響之間可能存在一定正相關性。

3 結論

本文以STC-1細胞為味覺感知模型，結合感官評價，對魚露中脯氨酸二肽的呈鮮特性進行了研究。結果表明，魚露中的12個脯氨酸二肽多具有鮮味和酸味，均無苦味；二肽的呈味閾值與其細胞響應閾值有一定相關性，且呈味強度高的肽其響應閾值也較低。呈味活性較強的肽按強弱順序依次為Pro-Val、Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Ile，其中Ser-Pro、Ala-Pro與Pro-Ala活性強于谷氨酸鈉，它們可能是魚露呈鮮的關鍵鮮味肽。脯氨酸二肽對四個鮮味受體的mRNA表達量有不同程度的影響，多數(shù)對T1R1的表達有上調(diào)作用，表明T1R1可能是介導脯氨酸二肽呈鮮的重要受體。此外，脯氨酸二肽的呈味活性與其對鮮味受體mRNA表達的影響之間存在一定正相關性。本研究提供了一種非人工感官的評價方法來反映鮮味肽的呈鮮特性，同時為鮮味肽呈味機理的研究提供了一定理論基礎。魚露脯氨酸二肽呈鮮的構效關系尚未明確，下一步將利用分子對接方法對這些二肽與鮮味受體的相互作用進行研究，同時這些鮮味肽與其他鮮味物質(zhì)的協(xié)同效應也有待進一步探索。