王新為，宋 麗，王 銘，宋紅芹

沙門菌病(Salmonellosis)是由沙門菌引起動物和人類急性和慢性疾病的總稱。沙門菌(Salmonella)是一種革蘭氏陰性菌，同時也是重要的食源性人獸共患病原菌，宿主譜廣泛，且危害嚴(yán)重[1]。其中腸炎沙門菌可引起成年雞隱性感染，并通過糞便向外界環(huán)境排菌，導(dǎo)致病原菌難以凈化；受感染的雛雞則表現(xiàn)為嚴(yán)重的全身性感染和高死亡率[2]。近年，有報道指出，腸炎沙門菌正逐漸替代鼠傷寒沙門菌成為最常見的食源性沙門菌血清型[3]。因此，加強(qiáng)腸炎沙門菌感染防控的研究勢在必行。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，抗生素的濫用，導(dǎo)致沙門菌耐藥性增強(qiáng)，耐藥譜加寬，給沙門菌的防控造成困難[4]。與亞單位疫苗和滅活疫苗相比，減毒活疫苗免疫原性好，是預(yù)防沙門菌病的重要手段[5]。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭氏陰性菌菌體外膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，主要影響沙門菌的表型、毒力及菌株間的免疫交叉反應(yīng)[6-7]。LPS主要由O抗原、核心多糖以及類脂A組成[8]。參與LPS生物合成的相關(guān)基因主要為：rfa基因簇、rfb基因簇和rfc基因簇[9]。O抗原鏈的生物合成由rfb基因簇控制，其中rfbG基因負(fù)責(zé)編碼CDP-glucose 4,6-dehydratase脫水酶[10]。研究表明，rfbG基因的失活會導(dǎo)致腸炎沙門菌LPS的缺失，且rfbG基因的缺失會降低菌株的毒力，其基因位點(diǎn)可作為細(xì)菌鑒別疫苗(Differentiation of Infected and Vaccinated Animals，DIVA)的潛在靶點(diǎn)。

本研究以腸炎沙門菌Z11為研究對象，通過無標(biāo)記突變法，構(gòu)建腸炎沙門菌Z11ΔrfbG缺失株，并研究其基本的生物學(xué)特性，包括菌株的生長速率、生化特性、生物膜形成能力以及細(xì)胞毒性等，為腸炎沙門菌減毒活疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞信息見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞Tab.1 Bacterial strains, plasmids and cells used in this study

1.2 主要試劑 DNA膠回收試劑盒、XbaI限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒純化試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、氯霉素(Cm)、DNA Marker、Primestar max DNA Polymerase均購自寶生物工程(大連)有限公司；ClonExpress One Step Cloning一步法連接試劑盒和2×Taq Master mix購自南京Vazyme生物科技有限公司；API 20E腸道菌鑒定卡購自法國Bio Mérieux公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購自美國ThermoFisher公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒、高效感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒及其他常規(guī)試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；沙門菌屬診斷血清試劑盒購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)腸炎沙門菌Z11的rfbG基因序列，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，如表2所示。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

表2 PCR擴(kuò)增引物序列Tab.2 Primers used for PCR in this study

1.4 腸炎沙門菌Z11ΔrfbG缺失株的構(gòu)建

1.4.1 重組菌E.coliχ7213(pDM4-ΔrfbG)的構(gòu)建 以腸炎沙門菌Z11基因組為模板，分別以rfbG-UP-F/R和rfbG-DOWN-F/R為引物，利用PCR擴(kuò)增rfbG基因上下游同源片段，即rfbG-U和rfbG-D片段。利用XbaI限制性內(nèi)切酶對pDM4載體進(jìn)行酶切，用C115連接酶分別將rfbG-U和rfbG-D片段與pDM4載體連接，通過熱激法將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliχ7213 λpir感受態(tài)中，以pDM4-F/R為引物對陽性單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，獲得重組質(zhì)粒pDM4-ΔrfbG，即獲得供體重組菌E.coliχ7213(pDM4-ΔrfbG)。

1.4.2 接合轉(zhuǎn)移與Z11ΔrfbG缺失株的篩選鑒定 以E.coliχ7213(pDM4-ΔrfbG)為供體菌，腸炎沙門菌Z11為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。挑取陽性單菌落，以pDM4-F/rfbG-OUT-F和pDM4-R/rfbG-OUT-F兩對引物分別進(jìn)行PCR鑒定。將驗(yàn)證正確的陽性菌落接種于含Cm的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。以1∶50擴(kuò)大培養(yǎng)于含有15%蔗糖的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。挑取菌液，三區(qū)劃線于含有15%蔗糖的LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)。挑取陽性克隆制備模板，以rfbG-OUT-F/R為引物進(jìn)行PCR鑒定。將驗(yàn)證正確的菌株以rfbG-IN-F/R為引物進(jìn)行PCR鑒定，并將驗(yàn)證正確的菌株送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.5 腸炎沙門菌Z11ΔrfbG缺失株的生物學(xué)特性測定

1.5.1 生長速率測定 分別挑取野生株Z11和缺失株Z11ΔrfbG接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。次日，將各菌液轉(zhuǎn)入新的LB液體培養(yǎng)基中，并將轉(zhuǎn)接后的菌液調(diào)至OD600=0.05(記作0 h讀數(shù))。分別將OD600為0.05的菌液轉(zhuǎn)入96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測OD600，每0.5 h測定1次，繪制生長曲線。

1.5.2 生化特性測定 分別挑取野生株Z11和缺失株Z11ΔrfbG接種于LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)。次日，挑取各菌株菌苔，分別攪拌混勻至含0.45%生理鹽水的比濁管中，并將菌液比濁度調(diào)至0.6～0.8。根據(jù)使用說明書向生化鑒定卡中加入菌液，將API 20E生化鑒定卡置于37 ℃培養(yǎng)箱，24 h后觀察并記錄結(jié)果。

1.5.3 生物被膜形成測定 分別挑取野生株Z11和缺失株Z11ΔrfbG接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。次日，將各菌液OD600值調(diào)為1后，加入到96孔板中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。將菌液棄掉，用超純水洗滌；加入甲醇，固定一定時間，棄掉甲醇，晾干；加入結(jié)晶紫，染色一定時間，棄掉結(jié)晶紫；用超純水洗滌，烘干；加入95%酒精溶解；用全自動酶標(biāo)儀檢測OD595，定量分析生物被膜形成情況。

1.5.4 粗糙表型鑒定 在載玻片上分別滴加20 μL O9單抗和吖啶橙，接種環(huán)挑取少許菌株分別與O9單抗和吖啶橙混合涂劃均勻，觀察凝集反應(yīng)情況。

1.5.5 腸炎沙門菌Z11ΔrfbG缺失株的細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將J774A.1細(xì)胞接種至48孔板，每孔加入1.5×105個細(xì)胞，培養(yǎng)至次日使細(xì)胞覆蓋率為80%～90%。挑取野生株Z11和缺失株Z11ΔrfbG接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。將菌液4 500 r/min離心5 min，棄去上清，用無菌PBS洗滌，再用無菌PBS重懸，將其OD600調(diào)為1。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，換新鮮的無抗DMEM培養(yǎng)基，以MOI=100感染細(xì)胞。1 000 r/min離心10 min，37 ℃感染1 h。棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗滌。加入含有20 μg/mL慶大霉素的Opti-MEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 h。利用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒測定野生株與缺失株對J774A.1細(xì)胞的毒性。

1.5.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 腸炎沙門菌Z11ΔrfbG缺失株鑒定

2.1.1 重組菌E.coliχ7213(pDM4-ΔrfbG)的構(gòu)建及鑒定 以rfbG-UP-F/R和rfbG-DOWN-F/R為引物PCR擴(kuò)增rfbG基因上下游同源片段(rfbG-U和rfbG-D片段)，利用C115連接酶將rfbG-U和rfbG-D片段連接在pDM4載體上，再轉(zhuǎn)入E.coliχ7213 λpir感受態(tài)細(xì)菌中，構(gòu)建供體重組菌E.coliχ7213(pDM4-ΔrfbG)。以pDM4-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證構(gòu)建的的供體重組菌E.coliχ7213(pDM4-ΔrfbG)，條帶大小正確，約1 450 bp(圖1)。

M：DL2000 Maker；1：rfbG基因上下游同源片段圖1 重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR identification of E. coli χ7213(pDM4-ΔrfbG)

2.1.2 接合轉(zhuǎn)移與ΔrfbG缺失株的篩選鑒定 以野生株Z11作為受體菌，重組菌E.coliχ7213(pDM4-ΔrfbG)作為供體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，在含有Cm和DAP的LB固體平板上，挑取陽性單菌落，以pDM4-F/rfbG-OUT-F和pDM4-R/rfbG-OUT-F兩對引物分別對其進(jìn)行PCR鑒定。對驗(yàn)證正確的菌株以含有15%蔗糖平板進(jìn)行負(fù)篩，以rfbG-OUT-F/R為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得候選缺失株約1 343 bp(圖2)。以rfbG-IN-F/R，不能擴(kuò)增出條帶(圖3)。結(jié)合測序結(jié)果，確定rfbG基因缺失株已構(gòu)建成功，即獲得缺失株Z11ΔrfbG。

M：DL5000 Maker；1-4：野生株；5：候選缺失株圖2 篩選缺失株P(guān)CR驗(yàn)證Fig.2 PCR identification of screening deletion strains

M：DL2000 Maker；1-5：Z11ΔrfbG缺失株；6：野生株圖3 缺失株P(guān)CR驗(yàn)證Fig.3 PCR identification of deletion strains

2.2 腸炎沙門菌Z11ΔrfbG缺失株的生物學(xué)特性測定結(jié)果

2.2.1 生長速率 利用全自動酶標(biāo)儀，在設(shè)定的時間點(diǎn)測定各菌液OD600值，從而繪制生長曲線(圖4)，結(jié)果顯示野生株生長速率高于缺失株。

圖4 Z11和Z11ΔrfbG生長曲線Fig.4 Growth curves of Z11 and Z11ΔrfbG

2.2.2 生化特性 野生株Z11和缺失株Z11ΔrfbG通過API 20E生化鑒定卡進(jìn)行生化特性鑒定，結(jié)果顯示rfbG基因的缺失對腸炎沙門菌Z11生化特性的主要指標(biāo)并無影響(表3)。

表3 Z11和Z11ΔrfbG生化特性Tab.3 Biochemical characteristics of Z11 and Z11ΔrfbG

2.2.3 生物被膜形成 將野生株Z11和缺失株Z11ΔrfbG分別置于96孔板中37 ℃培養(yǎng)48 h，用結(jié)晶紫對其生物被膜進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，缺失rfbG基因之后，腸炎沙門菌Z11形成生物被膜的能力顯著降低(圖5)。

①P<0.05圖5 Z11和Z11ΔrfbG生物被膜檢測Fig.5 Biofilm of Z11 and Z11ΔrfbG

2.2.4 粗糙表型鑒定 野生株Z11缺失rfbG基因后，不與O9單抗發(fā)生凝集，與吖啶橙溶液發(fā)生凝集(圖6)，符合粗糙型沙門菌的特點(diǎn)。

圖6 粗糙型菌株鑒定Fig.6 Identification of rough strains

2.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn) J774A.1細(xì)胞分別感染相同數(shù)量的野生株Z11和缺失株Z11ΔrfbG后，利用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒測定乳酸脫氫酶活性。結(jié)果表明，在缺失rfbG基因之后，腸炎沙門菌Z11對J774A.1細(xì)胞的毒力降低(圖7)。

①P<0.05圖7 細(xì)胞毒性檢測Fig.7 Cytotoxicity test of Z11 and Z11ΔrfbG

3 討 論

沙門菌減毒活疫苗具有免疫原性好和免疫方式類似自然感染等優(yōu)越性，可以通過口服途徑傳遞重組抗原到機(jī)體黏膜表面，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答來對抗病原體的感染[11]。盡管可以通過物理、化學(xué)等方法獲得減毒沙門菌，但其所得疫苗存在背景不清、毒力易返強(qiáng)等缺點(diǎn)[12]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用現(xiàn)代基因工程手段敲除單個或多個基因構(gòu)建減毒沙門菌，可使其在降低毒力的同時，仍保留著高度的免疫原性[13]。目前引起沙門菌毒力減弱的基因主要包括毒力相關(guān)基因、調(diào)控基因、管家基因以及編碼生物活性酶的基因，如cya、crp、steA、spiC、yieA、aceE等基因[11,13]。曹莉等[14]通過Red重組系統(tǒng)成功構(gòu)建腸炎沙門菌yjeA基因缺失株，研究結(jié)果表明，與親本株比較，yjeA基因缺失株生長穩(wěn)定，毒力降低，且能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。程瞾等[15]研究發(fā)現(xiàn)，雞傷寒沙門菌同時缺失spiC與crp基因后，缺失株生長速率減慢，與親本株相比其對雛雞的LD50升高107倍。焦揚(yáng)[16]利用信號標(biāo)簽誘變技術(shù)(STM技術(shù))分別篩選到rfbG與rfbH基因，且研究結(jié)果表明rfbG基因缺失株能對小鼠提供較為優(yōu)良的免疫保護(hù)效力，是理想的疫苗候選株。

綜上所述，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，以腸炎沙門菌Z11為研究對象，以rfbG作為目的基因，利用自殺質(zhì)粒pDM4介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，構(gòu)建腸炎沙門菌Z11ΔrfbG缺失株。研究表明，rfbG基因缺失株與野生株相比，展示出相似的生化特性，但是在生長曲線前期則存在明顯的差異，表明rfbG基因缺失對腸炎沙門菌Z11生長速率有一定影響。細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌自身分泌的，如多糖、蛋白、脂質(zhì)等細(xì)胞外多聚物，將細(xì)菌彼此黏附所形成的一種復(fù)雜的聚集體[17]。當(dāng)細(xì)菌存在于生物被膜中時，其對抗生素的耐藥性會提高10～1 000倍，生物被膜對細(xì)菌會產(chǎn)生保護(hù)作用[18]。本研究生物被膜試驗(yàn)結(jié)果顯示，rfbG基因缺失株能夠降低腸炎沙門菌Z11形成生物被膜的能力。曹堃[19]研究表明腸炎沙門菌G9ΔhilA生物被膜形成能力強(qiáng)，耐藥性高，而G9ΔssrAB生物被膜形成能力弱。由此推測rfbG基因缺失株可能會降低其對抗生素的耐藥性，這部分工作值得進(jìn)一步研究。

細(xì)菌感染細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)液里，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH的活性，可以對細(xì)胞毒性進(jìn)行定量分析。LDH活性越高，壞死的細(xì)胞越多，則細(xì)菌毒性越強(qiáng)；反之，則細(xì)菌毒性越弱[20]。本研究細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示，野生株感染J774A.1細(xì)胞后，LDH的活性高。而與野生株相比，rfbG基因的缺失降低了菌株的毒力。

可鑒別疫苗即DIVA疫苗可利用簡便的血清檢測手段，快速甄別免疫動物與天然感染動物。DIVA疫苗所用的減毒株多為特定抗原(如脂多糖、神經(jīng)氨酸酶)缺失菌株，因此LPS是構(gòu)建DIVA疫苗合適的選擇靶標(biāo)[21]。郭榮顯[22]研究表明，rfaL基因編碼O-抗原連接酶，參與LPS的合成，缺失后形成截短的LPS結(jié)構(gòu)，雞白痢沙門菌S06004ΔspiCΔrfaL與O9單抗不發(fā)生凝集，與吖啶橙溶液發(fā)生凝集現(xiàn)象，具有顯著的DIVA特征。本研究結(jié)果與其研究結(jié)果相似，腸炎沙門菌Z11缺失rfbG基因后，O9單抗玻板凝集試驗(yàn)呈陰性，吖啶橙凝集試驗(yàn)呈陽性，Z11ΔrfbG符合粗糙型沙門菌的特點(diǎn)，即rfbG基因的缺失會影響LPS的合成。根據(jù)rfbG缺失株的這一特點(diǎn)，rfbG基因具有作為DIVA疫苗靶點(diǎn)的潛力?？傊?，腸炎沙門菌Z11是由本實(shí)驗(yàn)室從雞體分離所得，適于構(gòu)建預(yù)防家禽腸炎沙門菌感染的減毒疫苗候選株，而且Z11ΔrfbG具有DIVA疫苗的功能，開發(fā)前景廣闊。

利益沖突：無

引用本文格式：王新為，宋麗，王銘，等.腸炎沙門菌rfbG基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2021，37(11)：971-976，984. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.137