蒲盧蘭，謝少利，李金穗，蘇小涵，譚巧，高硯春，鄧世山，侯令密，3

[1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科、乳腺癌生物靶向研究室、院士（專家）工作站，四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，四川南充637000；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院營山醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川南充637000]

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一種雌孕激素受體及HER-2 表達(dá)均呈陰性且惡性程度極高的乳腺腫瘤，因?yàn)槿狈μ禺愋缘闹委煱袠?biāo)，臨床預(yù)后極差，尋找TNBC 早期診斷和治療的靶點(diǎn)尤其重要[1-2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)脂肪非典型鈣黏蛋白4（FAT4）在TNBC 組織中呈低表達(dá)，F(xiàn)AT4 的低表達(dá)與TNBC 患者的惡性生物學(xué)特征（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)等）及不良預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。但是FAT4 影響TNBC 的具體機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究表明FAT4 作為Hippo 信號(hào)通路的上游因子，能夠誘導(dǎo)該通路的磷酸化影響腫瘤細(xì)胞的功能表型[5-8]。為進(jìn)一步研究FAT4 對(duì)TNBC惡性生物學(xué)行為的影響，探討FAT4 在TNBC 中的作用機(jī)制。本研究通過細(xì)胞學(xué)模型檢測(cè)降低FAT4表達(dá)水平后TNBC 細(xì)胞系生物學(xué)行為（增殖與凋亡、遷徙與侵襲）的改變，并檢測(cè)細(xì)胞EMT 表型及通路下游蛋白YAP 的表達(dá)及磷酸化改變，初步探討其相關(guān)性與機(jī)理，旨在為FAT4 調(diào)節(jié)TNBC 增殖與凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A 及TNBC 細(xì)胞系BT-549、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-436 均購于中國科學(xué)院細(xì)胞總庫；川北醫(yī)學(xué)院分子免疫研究所提供轉(zhuǎn)染所需大腸桿菌DH5α 菌；慢病毒載體介導(dǎo)的FAT4 沉默體系及對(duì)照，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)構(gòu)建及包裝。

1.2 主要儀器設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱：德國HERAEUS 公司；冷凍離心機(jī)：美國THERMO 公司；-80 ℃冰箱：英國ABCAM公司；流式細(xì)胞儀：美國BD 公司；PCR 儀：美國BIO-RAD 公司；超純水器：中國四川卓越水處理設(shè)備有限公司；普通顯微鏡：日本OLYMPUS 公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

胎牛血清：美國GIBCO 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基/胰蛋白酶：美國HYCLONE 公司；青/鏈霉素：美國 INVITROGEN 公司； shRNA-FAT4/shRNANegative Control：中國上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；DEPC：美國SIGMA 公司；CHAPS：美國AMRESCO 公司；Western blot 電泳液/轉(zhuǎn)膜液/洗滌液：中國碧天云公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒：中國凱基生物公司；CCK-8 試劑盒：中國凱基生物公司；Transwell 試劑盒：美國MILLIPORE 公司；抗FAT4 抗體（Western blot）/抗β-actin 多克隆抗體/抗GAPDH 抗體：英國ABCAM 公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RPMI-1640 培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、1×105IU/L 鏈霉素、1×105IU/L 青霉素，制成培養(yǎng)液。正常人乳腺細(xì)胞株MCF-10A 及TNBC細(xì) 胞 株 BT-549、 MDA-MB-231、 MDA-MB-468、MDA-MB-436 在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5%CO2）。

1.4.2 檢測(cè)FAT4 在TNBC 細(xì)胞株中的表達(dá)水平 按照GIBCO 公司RNA 提取試劑盒操作說明提取細(xì)胞總RNA；BIO-RAD 公司蛋白質(zhì)提取試劑盒操作說明書提取總蛋白；qRT-PCR 技術(shù)及Western blot 技術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞系中FAT4 的mRNA 及蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 構(gòu)建及鑒定FAT4 低表達(dá)細(xì)胞系 FAT4-

shRNA 干擾序列（FAT4-shRNA1/2/3） 及陰性對(duì)照序列由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司設(shè)計(jì)合成。選擇pGPU6/GFP/Neo 質(zhì)粒作為載體包裝shRNA，通過轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌擴(kuò)增質(zhì)粒。293T 細(xì)胞接種到6 孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。BT-549、MDA-MB-436 細(xì)胞系進(jìn)行感染，提取細(xì)胞總RNA；qRT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞FAT4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)情況；提取細(xì)胞總蛋白；Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞FAT4 蛋白的相對(duì)表達(dá)情況（一抗：抗FAT4 抗體，1∶1 000，ab130076，Abcam；二抗：堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶2 000，A0239，碧天云）。篩選出最有效的干擾片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將TNBC 分別轉(zhuǎn)染FAT4-shRNA （FAT4敲低組）和陰性對(duì)照序列（陰性對(duì)照組），以未轉(zhuǎn)染的TNBC 作為空白對(duì)照組。

1.4.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8 實(shí)驗(yàn)） 將2×103/孔的細(xì)胞懸液加入96 孔板培養(yǎng)；將培養(yǎng)板分別培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h 后每孔加入CCK8 試劑10 μL；孵育1 h（37 ℃，5%CO2）；根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值分析細(xì)胞生長情況。

1.4.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染72 h 后細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基饑餓8 h，吸取500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI；設(shè)置流式細(xì)胞儀工作程序（激發(fā)波長Ex=488 nm；發(fā)射波長Em=530 nm）；Annexin V-FITC 的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測(cè)；PI 紅色熒光通過PI 通道（FL3）檢測(cè)，F(xiàn)lowjo v10 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。

1.4.6 細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn) 將小室放入24 孔板，在上室加入基質(zhì)膠，將小室的下室面均勻涂抹纖維蛋白（10 mg/L），更換無血清培養(yǎng)基讓細(xì)胞饑餓培養(yǎng)8 h；在Transwell 小室的上層小室中加入200 μL 細(xì)胞懸液，下層小室加入含10%的胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基；37℃培養(yǎng)箱孵育4 h；4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色微孔膜下面細(xì)胞；顯微鏡下選取3 個(gè)視野計(jì)數(shù)（200×），重復(fù)3 次取平均值。

1.4.7 Western blot 實(shí)驗(yàn) 按比例制備SDS-PAGE 膠，50 μg 蛋白樣品加入上樣孔槽中，轉(zhuǎn)膜，TBST 液將PVDF 膜浸泡，平衡，封閉，一抗孵育（一抗：抗E-cadherin 抗體，1∶2 000，ab133597，Abcam；抗N-cadherin 抗體，1∶2 000，ab76057，Abcam），二抗孵育（堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶2 000，A0239，碧天云），PVDF 膜置于暗室，用BICP/NBT phosphatase Substrate （KPL，美國） 避光顯色；掃描并保存圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中涉及的所有需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，均采用SPSS 26.0 for Windows 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，部分圖片由GraphPad Prism 9 輸出。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAT4在TNBC細(xì)胞系中的表達(dá)

以正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A 中FAT4 mRNA 表達(dá)量為參照，4 種TNBC 細(xì)胞系中FAT4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為BT-549：0.7012±0.044、MDA-MB-231：0.2899±0.035、MDA-MB-468：0.346±0.065、MDA-MB-436：0.5484±0.028，F(xiàn)AT4 mRNA 在各組細(xì)胞中表達(dá)有明顯差異（F=169.842，P=0.000）；相對(duì)于正常細(xì)胞系MCF-10A，各組的相對(duì)表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。在4 種TNBC 細(xì)胞系中，BT-549 和MDA-MB-436 細(xì)胞系中相對(duì)表達(dá)量較高（圖1A）。以MCF-10A 中FAT4 蛋白表達(dá)量為參照，TNBC 細(xì)胞系中FAT4 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為BT-549： 0.7225±0.071、 MDA-MB-231： 0.4225±0.039、MDA-MB-468：0.4194±0.056、MDA-MB-436：0.6975±0.063；FAT4 蛋白在各組細(xì)胞中表達(dá)有明顯差異（F=96.707，P=0.000）；相對(duì)于正常細(xì)胞系MCF-10A，各組的相對(duì)表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。在4 種TNBC 細(xì)胞系中，BT-549 和MDA-MB-436 細(xì)胞系中相對(duì)表達(dá)量較高（圖1B）。遂選取BT-549 和MDA-MB-436 細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 FAT4 mRNA及蛋白在各細(xì)胞系中的表達(dá)A：qRT-PCR檢測(cè)FAT4 mRNA相對(duì)表達(dá)量；B：Western blot檢測(cè)FAT4蛋白相對(duì)表達(dá)量Figure 1 Expressions of FAT4 mRNA and protein in cells of each cell lineA:Relative expression levels of FAT4 mRNA determined by qRT-PCR;B:Relative expression levels of FAT4 protein determined by Western blot

2.2 下調(diào)FAT4 表達(dá)對(duì)TNBC 細(xì)胞系的增殖能力的影響

在BT-549 細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染24、48、72 h 各組細(xì)胞OD 值：空白對(duì)照組分別為0.322±0.032、0.467±0.042、0.563±0.063；陰性對(duì)照組分別為0.341±0.043、0.493±0.053、0.586±0.084；FAT4 敲低組分別為0.492±0.053、0.675±0.084、0.782±0.065。3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間OD 值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.38，P=0.000；F=16.538，P=0.000；F=14.294，P=0.001）；其中，F(xiàn)AT4 敲低組在3 個(gè)時(shí)間的OD 值均明顯高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照（均P＜0.05），而后兩組在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD 值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。在MDA-MB-436 細(xì)胞系中，24、48、72 h 各組細(xì)胞OD 值：空白對(duì)照組分別為0.333±0.076、0.396±0.086、0.505±0.048；陰性對(duì)照組分別為0.374±0.042、0.432±0.046、0.532±0.104；FAT4 敲低組分別為0.457±0.046、0.556±0.093、0.798±0.096。3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間OD 值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.308，P=0.013；F=5.801，P=0.017；F=5.801，P=0.017）。其中，F(xiàn)AT4 敲低組在3 個(gè)時(shí)間的OD 值均明顯高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照（均P＜0.05），而后兩組在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD 值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖2）。

圖2 下調(diào)FAT4對(duì)BT-549和MDA-MB-436細(xì)胞系的增殖能力的影響Figure 2 Effect of down-regulation of FAT4 on the proliferation of BT-549 and MDA-MB-436 cell lines

2.3 下調(diào)FAT4表達(dá)對(duì)TNBC細(xì)胞系凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在BT-549 細(xì)胞中的凋亡率分別為：空白對(duì)照組（15.16±0.62）%、陰性對(duì)照組（17.24±0.27）% 、 FAT4 敲低組（7.0±0.94）%，F(xiàn)AT4 敲低組的凋亡率明顯低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組（均P＜0.05），而后兩組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在MDAMB-436 細(xì)胞中的凋亡率分別為：空白對(duì)照組（18.31±0.55）%、陰性對(duì)照組（20.27±0.47）%、FAT4 敲低組（8.90±0.48）%，F(xiàn)AT4 敲低組的凋亡率明顯低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組（均P＜0.05），而后兩組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 下調(diào)FAT4對(duì)BT-549和MDA-MB-436細(xì)胞系凋亡的影響Figure 3 Effect of down-regulation of FAT4 on apoptosis of BT-549 and MDA-MB-436 cell lines

2.4 下調(diào)FAT4 對(duì)TNBC 細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響

Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低FAT4 表達(dá)水平后，在BT-549 細(xì)胞系中，各組穿室細(xì)胞數(shù)分別為：空白對(duì)照組（39±6） 個(gè)、陰性對(duì)照組（44±5） 個(gè)、FAT4 敲低組（59±10） 個(gè)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.617，P=0.003）。其中，F(xiàn)AT4 敲低組的穿室細(xì)胞數(shù)明顯多于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組（均P＜0.05），而后兩組的穿室細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在MDA-MB-436 細(xì)胞系中，各組穿室細(xì)胞數(shù)分別為：空白對(duì)照組（36±7）個(gè)、陰性對(duì)照組（42±9）個(gè)、FAT4 敲低組（62±9） 個(gè)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.942，P=0.001）。其中，F(xiàn)AT4 敲低組的穿室細(xì)胞數(shù)明顯多于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組（均P＜0.05），而后兩組的穿室細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 下調(diào)FAT4對(duì)BT-549和MDA-MB-436細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響Figure 4 Effect of down-regulation of FAT4 on migration/invasion abilities of BT-549 and MDA-MB-436 cell lines

2.5 下調(diào)FAT4 表達(dá)水平對(duì)TNBC 細(xì)胞系Hippo 信號(hào)通路的影響

在BT-549 細(xì)胞系中，以空白對(duì)照組為參照，陰性對(duì)照組、FAT4 敲低組中YAP 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.954±0.062、 0.942±0.04； 磷酸化YAP （p-YAP） 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.963±0.079、0.263±0.088； E-cadherin 相對(duì)表達(dá)量為0.972±0.025、0.234±0.032； N-cadherin 相對(duì)表達(dá)量為0.982±0.044、1.796±0.092。各組間YAP 蛋白表達(dá)無明顯差異（F=2.636，P=0.112 5）；各組間p-YAP 蛋白表達(dá)有明顯差異（F=143.537，P=0.000）， 其中，F(xiàn)AT4 敲低組p-YAP 蛋白表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組（均P＜0.05），而后兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 各組間E-cadherin 與N-cadherin 表達(dá)量均有明顯差異（F=394.452，P=0.000；F=212.208，P=0.000），其中，F(xiàn)AT4 敲低組的E-cadherin 表達(dá)量較陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組明顯降低，而N-cadherin 表達(dá)量較陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組明顯升高（均P＜0.05），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間E-cadherin 與N-cadherin 表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。在MDA-MB-436 細(xì)胞系中，以空白對(duì)照組為參照，陰性對(duì)照組、FAT4 敲低組中YAP 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.961±0.035、0.972±0.029；p-YAP 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.964±0.031、 0.275±0.032； E-cadherin 相對(duì)表達(dá)量為0.948±0.046、0.194±0.056；N-cadherin 相對(duì)表達(dá)量為0.963±0.049、2.181±0.193。各組間YAP 蛋白表達(dá)無明顯差異（F=2.397，P=0.133）；各組間p-YAP蛋白表達(dá)有明顯差異（F=400.352，P=0.000），其中，F(xiàn)AT4 敲低組p-YAP 蛋白表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組（均P＜0.05），而后兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組間E-cadherin 與Ncadherin 表達(dá)量均有明顯差異（F=390.204，P=0.000；F=160.888，P=0.000），其中，F(xiàn)AT4 敲低組的E-cadherin 表達(dá)量較陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組明顯降低，而N-cadherin 表達(dá)量較陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組明顯升高（均P＜0.05），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間E-cadherin 與N-cadherin 表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖5）。

圖5 下調(diào)FAT4對(duì)TNBC細(xì)胞系Hippo信號(hào)通路和EMT表型的影響Figure 5 Effect of down-regulation of FAT4 on Hippo signaling pathway and EMT phenotype in TNBC cell lines

3 討論

TNBC 作為一種惡性程度極高的乳腺癌亞型，受到科研與臨床的高度重視[9-11]。盡管國際上開展了大量的針對(duì)性臨床試驗(yàn)，但其治療現(xiàn)狀一直未得到較好的改善[9,12-13]。目前迫切需要尋找有效診斷TNBC 的特異性治療靶點(diǎn)，臨床策略提供新徑。

本研究篩選了FAT4 相對(duì)穩(wěn)定高表達(dá)的TNBC細(xì)胞系BT-549 和MDA-MB-436 進(jìn)行細(xì)胞功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。CCK-8 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)降低FAT4 表達(dá)后，BT-549 和MDA-MB-436 細(xì)胞系的增殖能力顯著加強(qiáng)。細(xì)胞的增殖能力作為腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特異性標(biāo)志，與腫瘤的惡性程度直接相關(guān)[14-15]。Ragni 等[16]通過對(duì)小鼠心肌細(xì)胞的體內(nèi)模型研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT4 可能通過Hippo 通路調(diào)節(jié)下游YAP 核轉(zhuǎn)位促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖能力，F(xiàn)AT4 突變的小鼠因FAT4 低表達(dá)導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖能力增加而心肌更肥厚。細(xì)胞凋亡是一個(gè)嚴(yán)格調(diào)控的生物學(xué)過程，在參與組織重塑、維持組織穩(wěn)態(tài)平衡和促進(jìn)損傷修復(fù)中起著重要作用[17]。凋亡的調(diào)節(jié)失衡可能與惡性腫瘤的發(fā)生有著極為緊密的聯(lián)系[18-19]。Ma 等[20]通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)降低FAT4 表達(dá)能夠減弱胃癌細(xì)胞的凋亡能力。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，降低FAT4 表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的凋亡能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性發(fā)展。Transwell 小室實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)AT4 低表達(dá)后細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著加強(qiáng)，說明在TNBC 的惡性生物學(xué)進(jìn)程上，F(xiàn)AT4 起到了重要的調(diào)節(jié)作用。Ma等[20]通過細(xì)胞學(xué)模型也發(fā)現(xiàn)FAT4 低表達(dá)后胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，可能與細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的表達(dá)能直接引起細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)。

Western blot 檢測(cè)上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAT4 敲低組中TNBC 細(xì)胞的上皮細(xì)胞表面分子E-cadherin 表達(dá)顯著降低，間質(zhì)細(xì)胞表面分子N-cadherin 表達(dá)顯著增高。說明FAT4 的低表達(dá)在一定程度上促進(jìn)了EMT 的生物學(xué)進(jìn)程。而EMT 作為一個(gè)特殊生理環(huán)境下的生物學(xué)狀態(tài)，在許多腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中均被實(shí)驗(yàn)證明EMT 的存在[21-25]。能夠引起EMT 表型的變化，無疑是FAT4 影響TNBC 細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移最直接的證據(jù)。Zhou 等[26]建立小鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型，通過對(duì)原發(fā)腫瘤、循環(huán)血液和轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行提取分析，結(jié)果顯示乳腺癌轉(zhuǎn)移的病理生理過程是由癌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)EMT 所介導(dǎo)的，阻斷EMT 可能成為防治乳腺癌轉(zhuǎn)移的新策略。Cai 等[27]發(fā)現(xiàn)敲除FAT4 后胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，且FAT4 通過對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)控來抑制腫瘤的EMT。FAT4 在TNBC 中也很可能參與EMT 的誘導(dǎo)發(fā)生，但目前相關(guān)具體機(jī)制與報(bào)道甚少。

FAT4 在Hippo 信號(hào)通路中發(fā)揮上游促發(fā)因子的作用，該通路的作用靶點(diǎn)主要是下游蛋白YAP，Hippo 通路的激活能夠引起YAP 蛋白的第127 位絲氨酸殘基磷酸化，使YAP 與14-3-3 蛋白結(jié)合停留在細(xì)胞質(zhì)；而阻斷該通路可降低YAP 磷酸化水平，未磷酸化的YAP 能夠順利進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TEAD 結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與腫瘤產(chǎn)生[21-22,28-30]。因此YAP 的磷酸化對(duì)能夠降低細(xì)胞增殖、遷移的能力。該結(jié)果表明，F(xiàn)AT4 的表達(dá)水平與下游YAP 的表達(dá)水平?jīng)]有顯著的相關(guān)性，但是YAP 的磷酸化水平卻顯著降低，說明FAT4 影響下游靶點(diǎn)YAP 的磷酸化水平，可能通過該信號(hào)通路，調(diào)控TNBC 細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。Li 等[31]在鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了EMT 特性加強(qiáng)，細(xì)胞增殖和遷徙能力增強(qiáng)，而通過消耗Hippo 信號(hào)通路下游逆轉(zhuǎn)EMT 表型，且恢復(fù)耐藥細(xì)胞的治療敏感性。但是Hippo 信號(hào)通路在TNBC 中的研究目前報(bào)道較少，該通路的驗(yàn)證，能為TNBC 的基礎(chǔ)研究拓展思路，為后期臨床轉(zhuǎn)歸和甚至藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)指明了方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，降低FAT4 表達(dá)水平后TNBC 細(xì)胞系BT-549 和MDA-MB-436 細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、凋亡能力減弱、侵襲遷移能力增強(qiáng)。FAT4 可能通過Hippo 信號(hào)通路誘導(dǎo)TNBC 細(xì)胞EMT 的發(fā)生，影響腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力。說明FAT4 可能對(duì)TNBC發(fā)生發(fā)展有重要影響，有可能成為早期診斷和治療的候選基因。