鄧溫歆 崔紀(jì)翔 馮士騫 粟 耘 陳 暄 陳明華 張 濤 李志紅

(1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物生物安全系 100193) (2 北京市昌平糧食收儲庫 102200) (3 國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院 100037)

嚙總目(Psocodea)中部分物種是全球廣泛關(guān)注的倉儲害蟲，它們危害儲糧，極大降低了糧食的品質(zhì)[1,2]。此外，該類害蟲可傳播病原微生物，導(dǎo)致儲糧污染嚴(yán)重，并可能導(dǎo)致人類產(chǎn)生過敏反應(yīng)[3,4]。因此，嚙蟲被認(rèn)為是全球食品安全的一種生物風(fēng)險[5]。危害儲糧的嚙蟲主要屬于書虱科(Liposcelididae)的書虱屬(Liposcelis)和竊蟲齒科(Trogiidae)的鱗蟲齒屬(Lepinotus)[6]。截至目前，鱗蟲齒屬已報道12種[7]；其中，網(wǎng)翅鱗蟲齒(LepinotusreticulatusEnderlein)在中國云南省及浙江省已有記錄[8,9]；其在浙江省為野外記錄，在云南省為糧庫環(huán)境中的記錄。嚙蟲可隨糧食的運輸而擴散，作為儲糧害蟲防治的基礎(chǔ)性工作，嚙蟲種類的準(zhǔn)確鑒定尤為重要。

由于儲糧嚙蟲個體微小、近似種之間的形態(tài)差異細(xì)微，基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的種類鑒定需要一定的專業(yè)知識與技巧[10]。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，DNA條形碼被運用于生物物種鑒定，基于mtDNA COΙ條形碼，可快速、準(zhǔn)確鑒定出未知動物樣品的種類[11]。其中，F(xiàn)olmer等[12]設(shè)計了可擴增無脊椎動物mtDNA COΙ基因的通用引物，已被廣泛應(yīng)用。針對網(wǎng)翅鱗蟲齒，2012年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)報道了網(wǎng)翅鱗蟲齒在中國的新紀(jì)錄[8,9]；此外，Mohammad Arif等[13]基于普通PCR、SYBR Green qPCR以及HDA(helicase dependent amplification)的方法，對網(wǎng)翅鱗蟲齒的COΙ基因進(jìn)行擴增，更加快速、靈敏地鑒定出該物種。到目前為止，在NCBI網(wǎng)站中，鱗蟲齒屬中包括網(wǎng)翅鱗蟲齒(Lepinotusreticulatus)及帕特鱗蟲齒(Lepinotuspatruelis)兩個物種，共12條mtDNA COΙ基因序列可供下載并使用。除此之外，竊蟲齒亞目中包括竊蟲齒科、跳蟲齒科和鱗蟲齒科均有代表性的物種的mtDNA COΙ基因序列可供下載并使用。

本研究基于形態(tài)學(xué)與DNA條形碼相結(jié)合的方法，對采集自北京市昌平區(qū)某糧庫的嚙蟲樣品進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果為網(wǎng)翅鱗蟲齒。本研究實現(xiàn)了對網(wǎng)翅鱗蟲齒的快速、準(zhǔn)確鑒定，是該蟲在北京地區(qū)的首次報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究所用嚙蟲樣品于2019年6月采集自北京市昌平區(qū)某糧庫的準(zhǔn)低溫稻谷倉。樣品液浸于100%乙醇，置于-20℃冰箱保存于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物檢疫與入侵生物學(xué)實驗室(CAUPQL)。

1.2 儀器與設(shè)備

K-400L體視顯微鏡：香港生產(chǎn)；CX31光學(xué)顯微鏡：日本生產(chǎn)；EOS500D相機：日本生產(chǎn)；H2O3-PROIII金屬浴儀：北京生產(chǎn)；Q5000核酸濃度檢測儀；Veriti TM 96-well Thermal Cycler (ABI USA)型PCR儀：美國產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 形態(tài)學(xué)整體照片使用液浸樣品，浸泡在100%酒精中，于OLYMPUS CX31顯微鏡下鏡檢并使用Canon EOS500D進(jìn)行拍照。細(xì)節(jié)照片使用活蟲壓制玻片標(biāo)本，方法為將樣品浸泡于乳酸6 h，充分釋放內(nèi)容物，取出后用清水漂洗。在載玻片中央滴1滴霍氏液并將樣品置于霍氏液中。在體視顯微鏡下，用解剖鑷整姿后蓋上蓋玻片。靜置10 min，玻片標(biāo)本于70℃金屬浴上加熱5 min。待自然風(fēng)干兩周后于OLYMPUS CX31顯微鏡下鏡檢并使用Canon EOS500D拍攝重要形態(tài)學(xué)特征照片。照片標(biāo)尺基于ImageJ 1.8.0添加[14]。

相關(guān)形態(tài)學(xué)鑒定特征參考梁飛揚等[8]。

1.3.2 DNA提取 對嚙蟲樣品的基因組DNA提取選用TIANamp Micro DNA Kit試劑盒，參照試劑盒的使用說明進(jìn)行單頭提取，共提取4頭樣蟲。應(yīng)用Quawell Q5000核酸濃度檢測儀檢測所提取DNA的濃度和純度，并置于-70℃保存。

1.3.3 PCR擴增及序列測定 選取mtDNA中的COΙ基因作為DNA條形碼進(jìn)行PCR擴增。擴增引物參考Folmer等[12]，LCO1490(5′-GGTCAATCATAAAGATATATTGG-3′)，HCO2198(5′-TAAACTTCAGG-GTGAAAAAATCA-3′)。PCR反應(yīng)在Veriti TM 96-well Thermal Cycler型PCR儀中完成。PCR體系選用25 μL體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，前、后引物各1.0 μL 及基因組DNA模板1.0 μL。擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30sec-52℃退火30sec-72℃延伸30sec為1個循環(huán)，共設(shè)置35次循環(huán)，72℃補齊10 min，14℃保存PCR產(chǎn)物[15,16]。針對PCR產(chǎn)物，使用1.5%瓊脂糖1×Tris Acetate-EDTA凝膠電泳，使用Gene Green Nucleic Acid Dye為染色劑，選用D2000 Marker為參考條帶長度，在Gel Logic 212 PRO型紫外燈下檢測PCR產(chǎn)物的擴增結(jié)果。全部PCR產(chǎn)物由北京進(jìn)行雙端一代測序。

1.3.4 序列分析 所測序列基于Chromas檢測其質(zhì)量[17]，并應(yīng)用MEGA 7拼接并去除引物序列[18]。應(yīng)用MEGA 7基于MUSCLE將所測序列與同源序列進(jìn)行比對后剪切至合適長度[20]，上傳剪切后序列至GenBank獲得Accession number?；贜CBI中BLAST功能與nt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對。GenBank中下載網(wǎng)翅鱗蟲齒同屬及相關(guān)物種的同源序列(表1)，竊蟲齒亞目中每個屬選取1個物種作為代表，用于系統(tǒng)發(fā)育樹分析。由于11條已知網(wǎng)翅鱗蟲齒的COΙ序列之間相似度高于96%，因此隨機選取一條COΙ序列作為該種的代表參與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。參考Yoshizawa等[19]，粉蟲齒亞目的嗜蟲書虱和嗜卷書虱被選取為外群用于進(jìn)行竊蟲齒亞目相關(guān)倉儲害蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析。應(yīng)用MEGA 7基于Kimura 2-Parameter模型對COΙ序列進(jìn)行對偶遺傳距離計算，并構(gòu)建Neighbor-joining(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置自我檢測1000次，結(jié)果標(biāo)注于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相應(yīng)節(jié)點旁。

表1 網(wǎng)翅鱗蟲齒及相關(guān)物種用于系統(tǒng)發(fā)育分析的相關(guān)序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果

嚙蟲樣品玻片標(biāo)本顯示，該樣品雌蟲體長約1 mm(圖1a)。頭紅褐色，胸部和腹部為黃褐色，無單眼和頭蓋縫臂。復(fù)眼上具2根剛毛，其中一剛毛僅剩毛窩(圖1b)。內(nèi)顎葉頂端具2齒，外側(cè)為大齒，內(nèi)側(cè)為小齒(圖1c)。該樣品僅具1對前翅，翅脈網(wǎng)格狀，多毛(圖1a,d)，無后翅。后足脛節(jié)具2尖刺(圖1e)，跗節(jié)3節(jié)，第一跗節(jié)上無刺。近肛門處，肛側(cè)板上具一長剛毛(圖1f)。雌蟲生殖突外瓣發(fā)達(dá)，具幾根細(xì)小剛毛，頂端具一長剛毛(圖1g)，無受精囊。以上形態(tài)特征與已有描述相符，基于形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，所采集的嚙蟲樣品可被鑒定為網(wǎng)翅鱗蟲齒。

a成蟲背面觀

b復(fù)眼

c內(nèi)顎葉頂端

d前翅

e后足脛節(jié)、跗節(jié)

f肛側(cè)板

g生殖突外瓣

2.2 分子鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示，COΙ基因擴增結(jié)果條帶清晰，片段長度約為700 bp。

注：M為D2000 Marker，1～4為4頭樣蟲，5為陰性對照

經(jīng)測序得到長度為683 bp的高質(zhì)量COΙ序列4條(MW134455-MW134458)。其與已知網(wǎng)翅鱗蟲齒的mtDNA COΙ序列的BLAST結(jié)果如表2所示，E value為0，相似度為97.26%～99.24%?；贙imura 2-Parameter模型對COΙ序列進(jìn)行對偶遺傳距離計算結(jié)果見表3，樣品與已知網(wǎng)翅鱗蟲齒同源序列間K2P對偶遺傳距離范圍最小，為0.012～0.020。在基于鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，4頭嚙蟲樣品均與已知網(wǎng)翅鱗蟲齒樣品聚在同一支(圖3)，能夠與竊蟲齒亞目其他種群明顯區(qū)分?；谝陨辖Y(jié)果，所采集的嚙蟲樣品為網(wǎng)翅鱗蟲齒。

表2 基于COΙ條形碼的嚙蟲樣品與網(wǎng)翅鱗蟲齒的BLAST結(jié)果

表3 基于COΙ條形碼的嚙蟲樣品與相關(guān)物種對偶遺傳距離計算結(jié)果

圖3 鄰接法(NJ)構(gòu)建嚙蟲樣品及其相關(guān)物種系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

網(wǎng)翅鱗蟲齒是一種個體微小、短翅、能夠孤雌生殖的倉儲害蟲[21-23]，也能在室外的地面垃圾、鳥類及哺乳動物巢中，甚至鳥類羽毛中偶然發(fā)現(xiàn)該蟲[9]。本研究基于形態(tài)學(xué)鑒定方法，對采集自北京市昌平區(qū)某糧庫的嚙蟲樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并對其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)描述，樣品被鑒定為網(wǎng)翅鱗蟲齒。同時，基于DNA條形碼鑒定方法，嚙蟲樣品的mtDNA COΙ條形碼序列被測定，比對了相似度，并被基于Kimura 2-Parameter模型計算對偶遺傳距離，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。最終，分子鑒定結(jié)果支持形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，即所采集的嚙蟲樣品是網(wǎng)翅鱗蟲齒。

DNA條形碼技術(shù)依據(jù)簡短且標(biāo)準(zhǔn)化的基因序列進(jìn)行物種鑒定，其準(zhǔn)確性的高低取決于已有基因庫的豐富程度[24]。mtDNA COΙ作為一種典型的模式條形碼，已較為廣泛地用于未知物種的分子鑒定[23]。鱗蟲齒屬的不同種類間，由于蟲體微小，形態(tài)特征差異細(xì)微，形態(tài)鑒定有較大難度。DNA條形碼鑒定可以克服嚙蟲處于不同生長階段，形態(tài)特征差別細(xì)微所導(dǎo)致的鑒定困難，即能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定各蟲態(tài)的嚙蟲樣品。

到目前為止，在NCBI網(wǎng)站中，鱗蟲齒屬僅有12條mtDNA COΙ基因序列可供下載與使用。在GenBank及BoldSystems等多種數(shù)據(jù)庫中，所包含鱗蟲齒屬的mtDNA COΙ序列具有一定的重合，但仍有部分序列未同步。此外，數(shù)據(jù)庫中上傳的mtDNA COΙ基因序列之間長度不一致，這可能為鱗蟲齒屬的準(zhǔn)確鑒定帶來不便。為進(jìn)一步提高DNA條形碼鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨著鱗蟲齒屬在世界范圍內(nèi)新紀(jì)錄的增加，應(yīng)盡量增添該屬不同種和種群的mtDNA COΙ序列檢測結(jié)果，同時統(tǒng)一序列長度范圍并在多數(shù)據(jù)庫中同步更新，以提高多數(shù)據(jù)庫中該基因的豐富程度。

針對網(wǎng)翅磷蟲齒的生物學(xué)特性、危害特點以及在糧庫中的發(fā)生規(guī)律和致害機制，有待進(jìn)一步研究。在本研究中，網(wǎng)翅磷蟲齒被發(fā)現(xiàn)于經(jīng)過熏蒸的準(zhǔn)低溫稻谷倉中。有學(xué)者曾針對其食物偏好性及種群增長特點進(jìn)行過報道[23]。為了實現(xiàn)儲糧嚙蟲的綠色可持續(xù)防治，未來應(yīng)進(jìn)一步加強網(wǎng)翅磷蟲齒對熏蒸劑和低溫的耐受能力及其機制的研究。