夏娟 ，張書(shū)春 ，代紫陽(yáng) ，王亞

（1.唐山南湖醫(yī)院，唐山 063000；2.華北理工大學(xué)，唐山 063000）

高血糖通過(guò)加重炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激程度在糖尿病心肌損害病理過(guò)程中起重要作用[1]。姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種黃色酸性酚類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎等作用，諸多研究表明姜黃素降低血糖、防治糖尿病并發(fā)癥的藥理作用明確[2-3]，同時(shí)對(duì)心血管有保護(hù)作用[4-5]。在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)姜黃素可以明顯減輕糖尿病大鼠心肌損傷程度，然而糖尿病心肌損傷病理過(guò)程復(fù)雜，姜黃素減輕高血糖致心肌細(xì)胞損害的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。本研究以高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷模型為研究對(duì)象，給予姜黃素干預(yù)，觀(guān)察姜黃素對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并從炎癥反應(yīng)指標(biāo)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6），氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD），以及核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號(hào)通路探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 H9C2大鼠心肌細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.2 用藥及試劑 姜黃素粉末（#C1386）、胰蛋白酶（#59429C）購(gòu)自SIGMA公司；胎牛血清（#16000044）、低糖培養(yǎng)基（#12320032）、高糖培養(yǎng)基（#11965092）購(gòu)自 GIBCO 公司；TNF-α（#H052）、IL-6（#H007）、乳酸脫氫酶（LDH）（#A020-2-2）、MDA（#A003-4-1）、SOD（#A001-3-2）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠第一抗體 IκB 激酶 β（IKKβ）（#8943S）、NF-κB（#8242S）、p-NF-κB（#3031S），小鼠抗大鼠第一抗體 GAPDH（#51332S）購(gòu)自 Cell Signaling公司；MTT試劑盒（#ST316），BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（#P0012），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔第二抗體IgG（#A0208）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠第二抗體IgG（#A0216）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（上海易亮醫(yī)療器械有限公司）；BS224S精密電子天平（SARTORIUS）；ST 16R高性能通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó) Thermo Scientific Sorvall）；M200PRO酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）；電泳儀，半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，蛋白分析系統(tǒng)（BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 給予10%FBS DMEM低糖培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）培養(yǎng)，待細(xì)胞約鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿底面積80%時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸、計(jì)數(shù)后，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（2 000個(gè)細(xì)胞/孔），培養(yǎng)48 h。吸原培養(yǎng)基，按照說(shuō)明書(shū)加入100 μL新培養(yǎng)基及10 μL MTT溶液，將96孔板放置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)4 h。每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱 15 min，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm測(cè)定吸光度OD值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的計(jì)算公式判斷細(xì)胞活性。

2.3 姜黃素配制 使用分析級(jí)天平稱(chēng)取姜黃素粉劑，DMSO 溶解、配制成母液 1 mmol/L，0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，-20℃避光保存。

2.4 高糖孵育建立心肌細(xì)胞損傷模型 根據(jù)文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用含有葡萄糖不同濃度的培養(yǎng)基（5.5、11.1、22.2、33.3、44.4 mmol/L）分別孵育H9C2心肌細(xì)胞12、24、48 h。由于在葡萄糖濃度33.3 mmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)下H9C2心肌細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞存活率不斷下降且存活率趨近50%，因此選用高糖（33.3 mmol/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞24 h建立心肌細(xì)胞損傷模型[6]。

2.5 分組及給藥 無(wú)血清低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化后進(jìn)行分組。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、高糖對(duì)照組和姜黃素各劑量組（2.5、5、10、20 μmol/L）。正常對(duì)照組給予低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖對(duì)照組給予高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；姜黃素各劑量組先給予相應(yīng)劑量姜黃素預(yù)處理6 h，再給予高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.6 ELISA 法檢測(cè) TNF-α、IL-6，MDA、SOD，LDH的含量 收集培養(yǎng)基作待測(cè)標(biāo)本，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定出細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6，LDH的含量水平；收集細(xì)胞，加入提取液后超聲波破碎細(xì)胞，離心取上清作為待測(cè)樣本，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定出細(xì)胞中MDA、SOD的含量水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.7 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 吸棄各組培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入細(xì)胞裂解液，放置冰上裂解30 min后收集細(xì)胞，4℃，12 000 rpm離心15 min離心半徑10 cm。使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備分離膠和濃縮膠，SDS-PAGE電泳分離各蛋白。半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液封閉后，將PVDF膜放置于對(duì)應(yīng)的一抗液中孵育，4℃過(guò)夜。洗膜后室溫孵育對(duì)應(yīng)的第二抗體2 h。再次洗膜后，ECL顯色，暗室內(nèi)曝光。利用Image J軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度表示相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素對(duì)細(xì)胞活性的影響 MTT結(jié)果顯示，高糖對(duì)照組H9C2細(xì)胞活性較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）；姜黃素各劑量組H9C2細(xì)胞活性較高糖對(duì)照組均提高（P＜0.05）。姜黃素提高H9C2細(xì)胞活性的效果呈劑量依賴(lài)性，隨著姜黃素劑量的增加，H9C2細(xì)胞的活性越高，以姜黃素20 μmol/L劑量組細(xì)胞活性最高。見(jiàn)表1。

表1 姜黃素對(duì)H9C2細(xì)胞活性的影響（±s）

表1 姜黃素對(duì)H9C2細(xì)胞活性的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖對(duì)照組比較，#P<0.05。

組別 實(shí)驗(yàn)次數(shù) 姜黃素含量（μmol/L） 存活率（%）正常對(duì)照組 6高糖對(duì)照組 6姜黃素組6 6 6 6-100.00-68.90±2.54*2.5 71.12±3.19 5.0 76.98±3.96#10.0 83.93±4.03#20.0 88.01±4.16#

3.2 姜黃素對(duì)TNF-α、IL-6和LDH含量的影響 與正常對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6和 LDH 的含量均明顯增加（P＜0.05）；與高糖對(duì)照組比較，姜黃素各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6和 LDH 的含量均有所降低（P＜0.05），且降低效果呈姜黃素劑量依賴(lài)性，隨著姜黃素劑量的增加，上述指標(biāo)含量降低越明顯，以姜黃素20μmol/L劑量組最為顯著。見(jiàn)表2。

表2 各組H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6和LDH 的含量（±s）

表2 各組H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6和LDH 的含量（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖對(duì)照組比較，#P<0.05。

組別 實(shí)驗(yàn)次數(shù)姜黃素含量（μmol/L）TNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）LDH（μ/L）正常對(duì)照組高糖對(duì)照組姜黃素組6 6 6 6 6 6- 73.1±7.51 94.8±9.81 199.6±18.94- 148.2±12.03* 299.8±28.97* 291.0±23.63*2.5 129.1±12.27# 238.6±21.65# 274.5±20.07#5.0 115.4±10.98# 189.3±19.18# 260.6±21.23#10.0 96.5±10.12# 155.2±14.74# 248.3±20.29#20.0 90.1±10.21# 131.5±12.58# 229.2±20.91#

3.3 姜黃素對(duì)MDA和SOD含量的影響 與正常對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組心肌細(xì)胞MDA含量明顯增加（P＜0.05），SOD 含量明顯降低（P＜0.05）；與高糖對(duì)照組比較，姜黃素各劑量組心肌細(xì)胞MDA含量均有所降低（P＜0.05），SOD含量均有所增加，且干預(yù)效果呈姜黃素劑量依賴(lài)性，隨著姜黃素劑量的增加，上述指標(biāo)含量改變?cè)矫黠@，以姜黃素20 μmol/L劑量組最為明顯。見(jiàn)表3。

表3 各組H9C2細(xì)胞中MDA和SOD的含量（±s）

表3 各組H9C2細(xì)胞中MDA和SOD的含量（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖對(duì)照組比較，#P<0.05。

組別 實(shí)驗(yàn)次數(shù)姜黃素含量（μmol/L）MDA（μmol/g）SOD（103μ/g）正常對(duì)照組 6高糖對(duì)照組 6姜黃素組6 6 6 6- 20.3±2.11 208.6±12.21- 30.7±3.96* 163.1±11.33*2.5 29.0±2.65 172.8±11.25 5.0 27.2±3.01# 180.0±12.24#10.0 26.1±2.17# 183.9±12.92#20.0 24.2±2.32# 198.3±13.22#

3.4 姜黃素對(duì) IKKβ，NF-κB p65，p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組心肌細(xì)胞IKKβ、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05），但 NF-κB p65蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與高糖對(duì)照組比較，姜黃素各劑量組IKKβ、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且蛋白表達(dá)的變化呈現(xiàn)姜黃素劑量依賴(lài)性，以姜黃素20 μmol/L劑量組最為明顯（P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖1。

表4 姜黃素對(duì)IKKβ，NF-κB p65，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響（±s）

表4 姜黃素對(duì)IKKβ，NF-κB p65，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖對(duì)照組比較，#P<0.05。

組別 實(shí)驗(yàn)次數(shù)姜黃素含量（μmol/L）IKKβ/GAPDH NF-κB p65/GAPDH p-NF-κB p65/GAPDH正常對(duì)照組高糖對(duì)照組姜黃素組6 6 6 6 6 6- 100.0 100.0 10.0±1.73- 361.2±30.82* 101.3±14.03▲ 59.6±6.01*2.5 232.8±25.91# 103.8±13.43▲ 50.3±5.92 5.0 208.9±21.67# 100.6±14.72▲ 38.1±4.15#10.0 151.5±17.05# 102.1±13.97▲ 34.8±3.95#20.0 131.1±14.98# 100.9±14.86▲ 30.4±3.01#

圖1 姜黃素對(duì)IR H9C2細(xì)胞IKKβ，NF-κB p65，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

4 討論

糖尿病心肌損害的病理過(guò)程復(fù)雜[7]，是心肌細(xì)胞面對(duì)高血糖應(yīng)激表現(xiàn)出來(lái)的病理改變。LDH是心肌細(xì)胞內(nèi)的一種酶，細(xì)胞損傷時(shí)會(huì)被大量釋放出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)中高糖孵育H9C2心肌細(xì)胞24 h，細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH含量增加，提示心肌細(xì)胞存在損傷，成功建立高糖致心肌損傷模型。H9C2心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)姜黃素預(yù)處理6 h，其活力明顯增強(qiáng)，釋放至細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的LDH含量明顯降低，提示姜黃素可以保護(hù)心肌細(xì)胞，減輕高糖所致?lián)p傷。

炎癥反應(yīng)是高糖致心肌損傷的重要機(jī)制[8]，眾多研究顯示在糖尿病心肌損傷相關(guān)動(dòng)物、細(xì)胞模型中存在大量炎癥細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α的分泌[9-10]，持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致心肌損傷。由于糖脂代謝紊亂，糖尿病機(jī)體的供能物質(zhì)由葡萄糖轉(zhuǎn)為脂肪酸或酮體，心肌細(xì)胞耗氧增加，加之糖尿病機(jī)體微血管病變常見(jiàn)，造成心肌細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，低氧應(yīng)激導(dǎo)致心肌組織TNF-α的分泌增多，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥過(guò)程。此外，最新研究證實(shí)高血糖/高濃度葡萄糖在胞外與血清蛋白形成的糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）可以直接結(jié)合細(xì)胞膜上的髓樣分化蛋白2，從而激活模式識(shí)別受體TLR4，形成的三者復(fù)合物激活炎癥信號(hào)通路[11]。氧化應(yīng)激也是高糖致心肌損傷的一個(gè)重要因素[12]，心肌細(xì)胞是高耗能單元，線(xiàn)粒體是其能量代謝的中心，高血糖造成的低氧狀態(tài)使線(xiàn)粒體產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS直接損傷心肌細(xì)胞[13]。MDA和SOD是氧化應(yīng)激系統(tǒng)中兩個(gè)重要的指標(biāo)[14]，其中MDA反應(yīng)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，其含量過(guò)高說(shuō)明細(xì)胞受氧自由基損傷程度較嚴(yán)重，SOD含量直接反應(yīng)細(xì)胞清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)中高糖對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯升高，提示高糖致心肌損傷模型細(xì)胞存在炎癥反應(yīng)過(guò)度；細(xì)胞內(nèi)MDA含量增加、SOD含量降低，提示模型細(xì)胞存在過(guò)高的氧化應(yīng)激水平。姜黃素預(yù)處理H9C2心肌細(xì)胞6 h可以明顯降低細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6含量，降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量并增加SOD含量，說(shuō)明姜黃素可以降低高糖致心肌損傷細(xì)胞模型的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平。

NF-κB是一種與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子[15]。當(dāng)細(xì)胞受到多種因素刺激后，IκB 激酶復(fù)合體（IKK）激活 NF-κB[16]，后者轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與特定靶基因結(jié)合并調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，釋放IL-6、TNF-α等相關(guān)炎癥因子；并上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，增加過(guò)氧化物的形成。而TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放可反饋性作用于NF-κB；過(guò)氧化物可導(dǎo)致心肌中糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）積累增多，而AGEs與其受體結(jié)合可以激活NF-κB，進(jìn)而持續(xù)又不斷加重的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)造成心肌損傷[18]。IKKβ是炎癥因子激活NF-κB所必需的IKK復(fù)合物活性亞基。NF-κB p65是NF-κB家族中的重要成員之一，可與NF-κB p50構(gòu)成最為廣泛的異源二聚體，NF-κB p65磷酸化后從胞漿進(jìn)入胞核，從而激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)中高糖致心肌損傷細(xì)胞模型中IKKβ蛋白表達(dá)增加，NF-κB磷酸活化水平加強(qiáng)，提示模型細(xì)胞內(nèi)IKK/NF-κB通路過(guò)度激活。姜黃素預(yù)處理H9C2心肌細(xì)胞6 h可以明顯降低細(xì)胞IKKβ蛋白表達(dá)，下調(diào)NF-κB磷酸活化水平，抑制IKK/NF-κB信號(hào)通路過(guò)度激活。

綜上所述，高糖刺激誘導(dǎo)的持續(xù)且不斷加重的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激狀態(tài)以及IKK/NF-κB信號(hào)通路過(guò)度激活參與糖尿病心肌損傷的病理過(guò)程。姜黃素對(duì)糖尿病心肌損害具有較好的防治作用，其機(jī)制可能與抑制IKK/NF-κB通路的過(guò)度激活，繼而降低了炎癥反應(yīng)水平及氧化應(yīng)激程度有關(guān)。此外，本研究中各項(xiàng)異常指標(biāo)的改善情況顯示姜黃素的干預(yù)作用具有劑量依賴(lài)性，隨著姜黃素劑量的增加，異常指標(biāo)的改善越明顯，以姜黃素20 μmol/L劑量組最為顯著。