蔡麗秀，張蛟鯊，張 錦，包艾平，付 陽(yáng)

1.四川省成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院/四川大學(xué)華西空港醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科, 四川成都 610200；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041

血小板計(jì)數(shù)在血栓和出血性疾病的診斷和治療中有重要價(jià)值。國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦使用乙二胺四乙酸(EDTA)作為血常規(guī)檢測(cè)的抗凝劑，因其對(duì)血細(xì)胞的形態(tài)和血小板計(jì)數(shù)影響很小，因此被廣泛使用[1]。然而EDTA也有其弊端，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致血小板聚集，因?yàn)閮x器對(duì)聚集的血小板不能確認(rèn)，造成EDTA依賴性假性血小板減少癥(EDTA-PTCP)[2]。這種血小板假性減少現(xiàn)象若沒(méi)有及時(shí)發(fā)現(xiàn)并糾正，臨床上則可能采取非必要的骨髓穿刺、激素治療或施行脾臟切除術(shù)等治療方案[3]。因此，工作中能及時(shí)發(fā)現(xiàn) EDTA-PTCP患者并準(zhǔn)確進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)復(fù)檢尤為重要。本研究對(duì)成都市雙流區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科工作中發(fā)現(xiàn)的18例EDTA-PTCP患者，采用不同血小板計(jì)數(shù)方法評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性，為實(shí)驗(yàn)室尋找快速、準(zhǔn)確的EDTA-PTCP復(fù)檢方法提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年5-8月成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院18例EDTA-PTCP患者標(biāo)本，其中男6例，女12例；年齡2～78歲，平均46歲。分別來(lái)自住院部9例(50.0%)，門診4例(22.2%)，體檢科5例(27.8%)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) (1)血小板計(jì)數(shù)≤70×109/L；(2)EDTA抗凝標(biāo)本血小板計(jì)數(shù)隨著時(shí)間的推移呈進(jìn)行性減低；(3)外周血涂片血小板聚集。

1.3儀器與試劑 (1)中國(guó)邁瑞(BC-6900)全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及原裝試劑；(2)日本Olmpus CX23顯微鏡；(3)EDTA-K2抗凝真空采血管及無(wú)抗凝劑的紅色真空管、子彈頭(康健醫(yī)療用品有限公司，中國(guó)江蘇)；(4)血小板計(jì)數(shù)溶血?jiǎng)?凱諾威生物科技有限公司，中國(guó)成都)；(5)瑞氏-吉姆薩染液(貝索公司，中國(guó)珠海)。

1.4方法

1.4.1手工法 準(zhǔn)確采集所有患者末梢血20 μL，擦去管外余血，加至380 μL的血小板計(jì)數(shù)溶血?jiǎng)┲校浞只靹蚝笫覝仂o置，待完全溶血后再次混勻，充入2個(gè)計(jì)數(shù)池內(nèi)，靜置10～15 min，待血小板下沉后顯微鏡下計(jì)數(shù)2個(gè)計(jì)數(shù)池內(nèi)的血小板數(shù)量，取平均值。

1.4.2儀器稀釋法 抽取所有患者靜脈血2 mL于無(wú)抗凝劑的真空管中，立刻吸取40 μL血液加入140 μL的邁瑞B(yǎng)C-6900全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀稀釋液中，1～18例標(biāo)本采用儀器稀釋阻抗法測(cè)血小板法(PLT-I)上機(jī)檢測(cè)，10～18例標(biāo)本額外再采用儀器稀釋光學(xué)法測(cè)血小板法(PLT-O)上機(jī)檢測(cè)，記錄血小板數(shù)量。因儀器稀釋法在本實(shí)驗(yàn)室為采血稀釋后0～5 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，所以未進(jìn)行時(shí)間分組。

1.4.3PLT-I 采集所有患者EDTA-K2抗凝全血標(biāo)本，充分混勻后分別于不同時(shí)間點(diǎn)(0～5 min、20 min、1 h、2 h)采用PLT-I檢測(cè)血小板，記錄4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.4.4PLT-O 對(duì)1.4.3中采集的血液標(biāo)本于1 h內(nèi)采用PLT-O檢測(cè)血小板，記錄1 h內(nèi)PLT-O的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果。補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)：10～18例標(biāo)本補(bǔ)充了PLT-O的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，在0～5 min、20 min、1 h、2 h內(nèi)采用PLT-O檢測(cè)血小板，記錄PLT-O檢測(cè)的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果。對(duì)每份標(biāo)本進(jìn)行涂片染色，并觀察血小板聚集情況。

2 結(jié) 果

2.118例標(biāo)本不同檢測(cè)方法及不同時(shí)間點(diǎn)血小板計(jì)數(shù)結(jié)果比較 隨著時(shí)間的推移，EDTA-K2抗凝管PLT-I血小板檢測(cè)數(shù)量呈進(jìn)行性下降，但下降程度與時(shí)間存在個(gè)體差異，1 h內(nèi)PLT-O檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)明顯高于PLT-I，見(jiàn)圖1。

圖1 18例標(biāo)本不同檢測(cè)方法及不同時(shí)間點(diǎn)血小板計(jì)數(shù)結(jié)果比較

2.2不同檢測(cè)方法血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確率比較 準(zhǔn)確率最高的方法是用EDTA-K2抗凝管全血0～5 min內(nèi)采用PLT-I上機(jī)檢測(cè)，準(zhǔn)確率為77.8%；其次是儀器稀釋法，準(zhǔn)確率為72.0%；EDTA-K2抗凝全血1 h內(nèi)PLT-O的準(zhǔn)確率也較高，為61.0%。EDTA-K2抗凝全血1 h內(nèi)的準(zhǔn)確率PLT-O明顯高于PLT-I。見(jiàn)表1。

表1 不同檢測(cè)方法血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確率比較(%,n=18)

2.3補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中10～18例標(biāo)本手工法與PLT-O血小板計(jì)數(shù)結(jié)果比較 補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中10～18例EDTA-K2抗凝標(biāo)本PLT-O血小板計(jì)數(shù)隨時(shí)間呈進(jìn)行性下降，隨著血小板聚集程度加重，PLT-O準(zhǔn)確檢測(cè)血小板的能力呈下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中10～18例標(biāo)本手工法與PLT-O血小板計(jì)數(shù)結(jié)果比較

2.4外周血涂片鏡檢結(jié)果 通過(guò)外周血涂片鏡檢，所有EDTA-K2抗凝全血標(biāo)本隨時(shí)間推移均發(fā)生血小板聚集，且聚集程度隨時(shí)間呈加重趨勢(shì)，見(jiàn)圖3。

2.5PLT-O不同時(shí)間點(diǎn)準(zhǔn)確率比較 補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中10～18例標(biāo)本準(zhǔn)確率最高的方法是用EDTA-K2抗凝管采全血后0～5 min內(nèi)采用PLT-O上機(jī)檢測(cè)，準(zhǔn)確率為100.0%，其次為采血后20 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)及儀器稀釋后0～5 min內(nèi)采用PLT-O檢測(cè)，準(zhǔn)確率均為77.8%，見(jiàn)表2。

圖3 EDTA-K2抗凝全血血小板聚集情況(瑞氏-吉姆薩染色，×1 000)

2.6血小板形態(tài) 通過(guò)外周血涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)第2例EDTA-PTCP住院患者血小板形態(tài)異常，隨著病情恢復(fù)，血小板未再發(fā)生聚集，形態(tài)也恢復(fù)正常，其余17例患者血小板形態(tài)均正常，見(jiàn)圖4。

圖4 EDTA-PTCP患者血小板形態(tài)(瑞氏-吉姆薩染色×1 000)

表2 PLT-O不同時(shí)間點(diǎn)準(zhǔn)確率比較(%,n=9)

3 討 論

EDTA-PTCP似乎與年齡和性別無(wú)關(guān)，是否與特定的疾病和藥物相關(guān)也無(wú)明確結(jié)論，存在于健康受試者和各種疾病患者中[4-6]。本研究中住院患者占50.0%，門診患者占22.2%，體檢者占27.8%，最小年齡為2歲，最大年齡為78歲，存在于各種疾病患者中。但部分EDTA-PTCP患者因血小板還未明顯聚集已上機(jī)檢測(cè)，導(dǎo)致無(wú)法及時(shí)發(fā)現(xiàn)，特別是門診患者。成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院要求30 min內(nèi)審核報(bào)告，從圖1可以看出，部分患者采血后30 min內(nèi)已上機(jī)檢測(cè)，其血小板計(jì)數(shù)大于100×109/L，這部分患者很難被發(fā)現(xiàn)，所以實(shí)際發(fā)生率可能更高。

目前，EDTA-PTCP的發(fā)生機(jī)制并不明確，主要有以下原因：(1)與自身抗體相關(guān)。自身抗體與血小板上的隱匿性抗原結(jié)合，導(dǎo)致血小板發(fā)生聚集，這種自身抗體可以是抗血小板抗體，也可以是抗心磷脂抗體。(2)與血小板上的隱匿性抗原相關(guān)。EDTA與Ca2+鰲合，導(dǎo)致血小板的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露出隱匿性抗原，抗原與抗血小板抗體結(jié)合，導(dǎo)致血小板聚集。(3)與血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa相關(guān)。GPⅡb/Ⅲa之間存在神秘表位，GPⅡb/Ⅲa需要Ca2+保持其二聚體結(jié)構(gòu)，EDTA與Ca2+鰲合導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致表位暴露在GPⅡb上，與抗血小板抗體結(jié)合發(fā)生聚集。但 EDTA依賴性抗體并不特異，除EDTA-PTCP外，也觀察到EDTA依賴性白細(xì)胞聚集[11]。盡管目前的研究從不同角度闡述了各自的理論，但尚不能全部解釋其發(fā)生機(jī)制。從圖4可以看出,第2例EDTA-PTCP患者血小板形態(tài)異常，隨著病情的恢復(fù)，當(dāng)血小板未再發(fā)生聚集時(shí)血小板形態(tài)恢復(fù)正常，但無(wú)法明確是否與用藥或者其他治療相關(guān)。

針對(duì)EDTA-PTCP目前提出了諸多解決方法，主要分為兩類。第一類是不需要二次采血的方法，主要有加入阿米卡星及振蕩法等，加入阿米卡星能較好地解聚血小板，但等待解聚的時(shí)間較長(zhǎng)，且靈敏度和特異度存在個(gè)體差異[7-10]；抽血后1 h內(nèi)加入6.5 mg/mL阿米卡星能有效解聚血小板，但文獻(xiàn)[11-12]的標(biāo)本僅有2例，是否存在不能解聚的情況還需進(jìn)一步研究；振蕩法比較簡(jiǎn)便快速，但不能解聚血小板的概率高，且振蕩后破碎紅細(xì)胞也會(huì)對(duì)血小板的測(cè)定造成干擾[13]。第二類是需要二次采血的方法，主要有手工法、儀器稀釋法、抗凝劑替代法等，目前手工法仍是血小板計(jì)數(shù)的金標(biāo)法，缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)；儀器稀釋法準(zhǔn)確，但因無(wú)抗凝劑的參與，采血稀釋過(guò)程中容易發(fā)生血液凝固導(dǎo)致血小板減低[10]；抗凝劑替代法是目前最常用的方法，但多種抗凝劑依賴的患者不能采用此法。根據(jù)近來(lái)報(bào)道，邁瑞血細(xì)胞分析儀網(wǎng)織通道檢測(cè)血小板效果較理想，邁瑞B(yǎng)C-6800和BC-6900全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀PLT-O具有血小板解聚功能[14]，血小板聚集標(biāo)本與反應(yīng)溶液(解離試劑)在42 ℃的恒溫條件下混合，然后在1 400 r/min的高速渦旋中進(jìn)行攪拌，在劇烈振蕩中對(duì)血小板聚集的物理結(jié)構(gòu)進(jìn)行機(jī)械破壞，并通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)逐一檢測(cè)。在這種情況下，血小板聚集迅速有效地解離，血小板使用光學(xué)方法被準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，通過(guò)此方法能較好地解決EDTA-PTCP，但目前的研究并未對(duì)PLT-O進(jìn)行時(shí)間分組[15-16]。

本研究在前階段實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，即使采用PLT-O檢測(cè)血小板，其計(jì)數(shù)仍會(huì)隨著時(shí)間呈下降趨勢(shì)，所以進(jìn)行了補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，在10～18例標(biāo)本中對(duì)PLT-O進(jìn)行了時(shí)間分組，最終發(fā)現(xiàn)PLT-O優(yōu)于PLT-I，而PLT-O中，采血后0～5 min內(nèi)采用PLT-O上機(jī)檢測(cè)的準(zhǔn)確率為100.0%，故針對(duì)接受二次采血的非急重癥患者，推薦使用此法。未加抗凝劑的儀器稀釋后PLT-O雖然準(zhǔn)確率為78.0%，10～18例標(biāo)本中有2例偏差大于12.5%，但均為PLT-O大于手工法，考慮這其中存在隨機(jī)誤差，故對(duì)于靜脈穿刺較難的嬰幼兒和重癥患者，采集末梢血儀器稀釋后采用PLT-O為一種較好的方法。PLT-O隨著標(biāo)本放置時(shí)間延長(zhǎng)，準(zhǔn)確率呈下降趨勢(shì)，這似乎與血小板聚集的嚴(yán)重程度相關(guān)，當(dāng)血小板聚集特別嚴(yán)重時(shí)PLT-O準(zhǔn)確率較低。18例標(biāo)本1 h內(nèi)PLT-O準(zhǔn)確率為61.0%，但全部標(biāo)本血小板計(jì)數(shù)均大于70×109/L，2020年中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)科學(xué)會(huì)發(fā)布的《中國(guó)成人血小板減少癥診療專家共識(shí)》指出，腰椎穿刺需要PLT≥40×109/L，肝臟活檢需要PLT≥50×109/L，腎活檢需要PLT≥100×109/L，牙科手術(shù)需要PLT≥(30～50)×109/L，一般大手術(shù)需要PLT≥50×109/L。故對(duì)于急需手術(shù)的患者，采血后1 h內(nèi)采用PLT-O上機(jī)檢測(cè)血小板仍為較好的一種方法，既為手術(shù)爭(zhēng)取了時(shí)間，也不易導(dǎo)致誤診。

本研究通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)，部分患者即使采血后立即上機(jī)檢測(cè)同樣發(fā)生了血小板聚集，而采血后0～5 min內(nèi)PLT-O準(zhǔn)確率為100.0%，PLT-I為77.8%，PLT-O在一定程度上解決了這一問(wèn)題，但因?yàn)椴±邢?，是否存在采用此法不能解決的患者還有待進(jìn)一步收集數(shù)據(jù)驗(yàn)證。 本研究對(duì)邁瑞-6900全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀PLT-O進(jìn)行時(shí)間分組實(shí)驗(yàn)，因EDTA-PTCP個(gè)體差異較大，用均值和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)對(duì)比血小板計(jì)數(shù)不能準(zhǔn)確反映出方法的準(zhǔn)確性，故本研究最終采用準(zhǔn)確率來(lái)評(píng)估方法的準(zhǔn)確性。但本研究最準(zhǔn)確的方法仍不能避免二次采血，如何能快速、準(zhǔn)確又不需要二次采血的解決這一問(wèn)題還需繼續(xù)研究。

綜上所述，對(duì)于EDTA-PTCP患者，最準(zhǔn)確的檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)的方法為采血后0～5 min內(nèi)采用PLT-O上機(jī)檢測(cè)，可有效縮短檢測(cè)時(shí)間及減少誤診的方法為1 h內(nèi)采用PLT-O上機(jī)檢測(cè)。所以本科室針對(duì)EDTA-PTCP患者制訂了以下復(fù)檢方案：針對(duì)不是急查血小板計(jì)數(shù)的EDTA-PTCP患者，采血后0～5 min內(nèi)采用PLT-O上機(jī)檢測(cè)；對(duì)于靜脈穿刺較難的嬰幼兒和重癥患者，采集末梢血儀器稀釋后采用PLT-O上機(jī)檢測(cè)；對(duì)于急查血小板計(jì)數(shù)的患者，采血后1 h內(nèi)采用PLT-O上機(jī)檢測(cè)。