朱 盈，楊啟文

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100730；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100730

近年來，由于靜脈導(dǎo)管留置、機(jī)械通氣、腸外給藥等侵入性設(shè)備及治療的廣泛應(yīng)用,免疫抑制劑及大量抗菌藥物的濫用,血流感染的發(fā)病率逐年上升[1]。然而，臨床血流感染標(biāo)本中病原微生物水平較低，部分標(biāo)本病原菌甚至無法培養(yǎng)，導(dǎo)致標(biāo)本陽性檢出率較低，臨床診斷困難。宏基因組學(xué)近年來被廣泛應(yīng)用于環(huán)境學(xué)、農(nóng)業(yè)學(xué)等方面的研究。宏基因組學(xué)直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,或通過測序探究環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能,克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺陷,極大地豐富了對(duì)標(biāo)本微生物多樣性及其功能的認(rèn)識(shí)[2]。宏基因組學(xué)在醫(yī)學(xué)微生物方面的研究有以下優(yōu)勢：不受靶標(biāo)限制、可以預(yù)測耐藥性、快速制備文庫和實(shí)時(shí)采集數(shù)據(jù)[3]。將宏基因組學(xué)測序技術(shù)應(yīng)用于臨床微生物診斷可以全面快速地探索標(biāo)本中病原菌的分布特征及耐藥基因組學(xué)和毒力基因組學(xué)的特征。研究有效的去宿主核酸處理方法有助于提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，減少數(shù)據(jù)分析困難，并且能在一定程度上降低檢測成本。為此，本研究將臨床常見的3種病原微生物(金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和白色念珠菌)注入到健康人血液中制備模擬標(biāo)本，以綜合評(píng)估3種標(biāo)本預(yù)處理方法[皂素去宿主核酸法(Saponin法)、SDS去宿主核酸法(SDS法)和水洗法]的去人源核酸效果，旨在對(duì)將來的宏基因組學(xué)測序技術(shù)流程進(jìn)一步發(fā)展及改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 本研究使用臨床模擬血液標(biāo)本，將健康獻(xiàn)血者含白細(xì)胞血漿與懸浮紅細(xì)胞按體積1∶1混合，模擬全血標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)菌株使用臨床質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923、白色念珠菌ATCC 90028和臨床肺炎克雷伯菌(R16)。將菌懸液注入到全血標(biāo)本中，最終得到濃度為103cfu/mL的含菌血液[4]。每份標(biāo)本進(jìn)行2次重復(fù)平行試驗(yàn)。

1.2儀器與試劑 核酸提取選用Zymo BIOMICS DNA minipre Kit核酸提取試劑盒。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)使用羅氏LightCycler?480儀器，選用Takara TB Green Premix Ex Taq 酶或Apllied Biosyetems TaqMan Universal Master Mix Ⅱ試劑進(jìn)行檢測。在去宿主核酸處理步驟中使用熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶(HL-SAN)(ActicZymes?)、Saponin干粉(Sigma-Aldrich?)、SDS、蛋白酶K凍干粉(Solarbio)。

1.3方法

1.3.1Saponin法[3]取8 mL含菌血液，800 r/min離心5 min，留取血漿，棄下層血細(xì)胞；將血漿以9 000 r/min離心5 min，棄上清液，200 μL 磷酸鹽緩沖液(PBS) 重懸沉淀，再加入200 μL 5% Saponin溶液(終濃度為2.5%)，37 ℃振蕩孵育15 min，孵育過程中每2 min混勻1次，保證中間充分反應(yīng)；加入350 μL無菌純水，靜置30 s，再加入12 μL NaCl溶液(5 moL/L)，渦旋混勻。8 000 r/min離心5 min，棄上清液，100 μL PBS重懸沉淀，再加入100 μL HL-SAN buffer(5.5 moL/L NaCl，100 mmoL/L MgCl2水溶液)，混勻。加入10 μL HL-SAN，立即混勻，37 ℃ 1 300 r/min孵育15 min；每管加入1 mL PBS，8 000 r/min離心3 min；棄上清液，1 mL PBS重懸，8 000 r/min離心3 min；棄上清液，用250 μL PBS重懸沉淀，重懸液用于核酸提取。

1.3.2SDS法 取8 mL含菌血液，800 r/min離心5 min，留取血漿，棄下層血細(xì)胞；將血漿以9 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入160 μL 無菌PBS 重懸沉淀，再加入80 μL 無菌5% SDS溶液(終濃度為1.6%)，37 ℃振蕩孵育15 min，孵育過程中每2 min混勻1次，保證中間充分反應(yīng)；加入350 μL無菌純水，靜置30 s，再加入12 μL NaCl溶液(5 mol/L)，渦旋混勻。8 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS洗滌SDS，再以8 000 r/min離心5 min。重復(fù)上一步。100 μL PBS重懸沉淀，再加入100 μL HL-SAN buffer，混勻。加入10 μL HL-SAN，立即混勻，37 ℃ 1 300 r/min孵育15 min；每管加入1 mL PBS，8 000 r/min離心3 min；棄上清液，1 mL PBS重懸，8 000 r/min離心3 min；棄上清液，用250 μL PBS重懸沉淀，重懸液用于核酸提取。

1.3.3水洗法 取8 mL含菌血液，3 200 r/min離心30 s，留取血漿，棄下層血細(xì)胞；量取血漿于新的5 mL低吸附管內(nèi)，并加入等體積無菌超純水，渦旋混勻；室溫孵育5 min，期間不斷混勻；13 300 r/min離心2 min；棄上清，250 μL PBS重懸沉淀，重懸液用于核酸提取。

1.3.4核酸提取 嚴(yán)格按照Zymo BIOMICS DNA minipre Kit核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行核酸提取。

1.3.5qPCR 分別使用nuc[5]、phoE和CALB[6]基因?qū)?biāo)本中的金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和白色念珠菌進(jìn)行熒光定量分析。采用GAPDH[7]和β-actin[7]基因?qū)?biāo)本中的人源核酸進(jìn)行熒光定量分析。其中GAPDH、β-actin、nuc、phoE基因的檢測采用探針法qPCR，CALB基因的檢測采用染料法qPCR。均采用25 μL體系，程序設(shè)定為95 ℃ 10 min 1個(gè)循環(huán)：預(yù)變性；40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)：變性，退火，延伸; 40 ℃ 1 s 1個(gè)循環(huán)：冷卻。具體引物及探針序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物和探針

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將制備的未去宿主處理和去宿主處理的臨床模擬標(biāo)本組的核酸作為模板，進(jìn)行qPCR檢測，獲得各標(biāo)本中不同目的基因的Ct值。因Ct值與核酸水平呈反比，故比較其Ct值即可對(duì)比其中人源核酸及病原菌核酸的數(shù)量。按如下公示計(jì)算：未進(jìn)行去宿主處理的標(biāo)本Ct值-對(duì)應(yīng)的去宿主處理后的標(biāo)本Ct值=ΔCt

2 結(jié) 果

圖1 標(biāo)本中人源核酸變化

表2 3種方法標(biāo)本中核酸總體變化

圖2 標(biāo)本中病原菌基因變化

3 討 論

本研究采用Saponin法和SDS法進(jìn)行去宿主核酸的原理類似，Saponin和SDS皆為表面活性劑，可以起到裂解細(xì)胞膜的作用，因?yàn)榧?xì)菌、真菌均有細(xì)胞壁，對(duì)細(xì)胞膜有保護(hù)作用，所以可以針對(duì)性地裂解人源細(xì)胞膜，暴露人源核酸，并且通過滲透裂解進(jìn)一步裂解細(xì)胞膜，同時(shí)使用非特異性核酸內(nèi)切酶HL-SAN進(jìn)行核酸降解。由于SDS法對(duì)HL-SAN的酶發(fā)揮作用有影響，所以在SDS法的流程中增加了洗滌的步驟。水洗法的實(shí)驗(yàn)原理是通過ANSON等[8]實(shí)驗(yàn)中評(píng)估的不同離心條件來分離菌體與人類細(xì)胞，選擇最佳離心條件，同時(shí)使用低吸附管，減少核酸耗損，然后再用等體積無菌純水渦旋、孵育，達(dá)到低滲裂解的效果，再離心，分離暴露的人源核酸和完整的菌體，最終達(dá)到去宿主核酸的目的。

Saponin法整體效果最優(yōu)，去宿主核酸處理步驟使病原菌菌體充分暴露，核酸提取效率明顯增加。而SDS法雖有效去除了人源核酸，但病原菌核酸也發(fā)生了丟失，判斷可能是因?yàn)镾DS解構(gòu)蛋白能力較強(qiáng)，導(dǎo)致在去宿主核酸處理的步驟中，病原菌核酸也發(fā)生了丟失。

本研究結(jié)果顯示，水洗法去宿主核酸效果劣于Saponin法和SDS法，考慮到操作誤差及檢測中的隨機(jī)誤差同時(shí)存在于另外兩種方法，故可以排除隨機(jī)誤差的影響，認(rèn)為是方法學(xué)的問題：一方面水洗法的步驟較為簡單，低滲裂解比較溫和，核酸去除效果不佳；另一方面去宿主處理后的標(biāo)本經(jīng)過了稀釋重懸，在核酸提取步驟中破膜效果更好，核酸提取效率提高。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行水洗法去宿主核酸處理后再提取核酸雖然提高了病原菌核酸提取效率，但同時(shí)也提高了人源核酸的提取效率，并且對(duì)人源核酸的富集效果優(yōu)于病原菌核酸，因此，沒有達(dá)到理想的去宿主核酸效果。

目前，去宿主核酸處理主要包括細(xì)胞處理和核酸處理兩種方法。本實(shí)驗(yàn)中，水洗法利用了人源細(xì)胞與菌體的密度差異去除宿主細(xì)胞，在人源核酸去除方面效果略差于Saponin法和SDS法。而在關(guān)晴輝[9]的研究中，利用人類細(xì)胞與細(xì)菌直徑的差異，使用過濾膜處理模擬痰標(biāo)本，最終的去宿主核酸效果與NEB試劑盒相近且耗時(shí)更短。細(xì)胞處理法試劑耗材少、成本低、耗時(shí)短，值得進(jìn)一步研究優(yōu)化。

核酸層面的處理方法包括商品化試劑盒、滲透壓裂解細(xì)胞膜和細(xì)胞裂解液(Saponin、Triton X-100、吐溫-20)等。MAROTZ等[10]研究表明，滲透壓裂解細(xì)胞膜的效果比較差，不宜單獨(dú)使用，但可以在實(shí)驗(yàn)流程中配合其他細(xì)胞裂解液使用以提高去宿主核酸效率。PMA、Saponin、Triton-100、吐溫-20等均為表面活性劑，能夠裂解膜蛋白，配合核酸內(nèi)切酶(HL-SAN、Turbo DNase等)使用可以達(dá)到去宿主核酸效果[10-15]，本研究中Saponin法和SDS法就是采用該原理，聯(lián)合使用滲透壓裂解液、表面活性劑和核酸內(nèi)切酶，證明該方法可行且效果較好。

本方案還有待改進(jìn)，下一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)考慮將方案應(yīng)用于真實(shí)多樣的臨床標(biāo)本，并采用宏基因組學(xué)測序?qū)θニ拗骱怂崽幚矸椒ǖ撵`敏度、重復(fù)性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)于Saponin及SDS裂解液的水平還可以進(jìn)一步進(jìn)行探索。盡可能提高方法的檢測下限及排除干擾是分子診斷技術(shù)將來的發(fā)展方向。檢測下限降低能夠保證檢測方法的靈敏度，并且在患者發(fā)病早期甚至還未發(fā)病前進(jìn)行預(yù)測診斷，提前干預(yù)，減少不恰當(dāng)?shù)脑\療。而高靈敏度的檢測方法帶來的也可能是更多的干擾信息，環(huán)境中諸多的污染菌群及人體定植菌群極易混入檢測標(biāo)本中，規(guī)范標(biāo)本采集技術(shù)、縮短標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間、提高臨床結(jié)果判讀能力是解決該問題的關(guān)鍵。對(duì)于背景更復(fù)雜的其他標(biāo)本(如痰液、肺泡灌洗液等)，各種方法的處理流程及效果尚需進(jìn)一步探討。且本研究未將病毒納入研究對(duì)象，在之后的研究中可以考慮擴(kuò)大研究范圍，全面探索細(xì)菌、真菌及病毒感染標(biāo)本的去宿主處理方法。

未來的去宿主處理方法可以從技術(shù)層面研究新方法，降低人源細(xì)胞的干擾，富集病原菌，提高檢出率。同時(shí)，還可以探索新物質(zhì)，尋找更高效的去除標(biāo)本中人類細(xì)胞或核酸的試劑或酶，或者尋找新的方法，在盡可能剔除人源細(xì)胞或核酸的基礎(chǔ)上，減少病原菌核酸丟失。解決標(biāo)本前處理問題，提高標(biāo)本中病原菌核酸占比，能進(jìn)一步推動(dòng)宏基因組學(xué)測序技術(shù)在病原微生物診斷及預(yù)測方面的應(yīng)用，最大限度地縮短病原菌鑒定及耐藥基因檢測的時(shí)間?？焖贉?zhǔn)確的血流感染診斷、及時(shí)高效的耐藥基因篩查能夠幫助臨床醫(yī)生盡早選擇適當(dāng)?shù)目咕幬镞M(jìn)行治療，改善治療療效，減少臨床不恰當(dāng)?shù)慕?jīng)驗(yàn)用藥案例，為臨床診療提供極大的便利。同時(shí)，隨著病原菌基因組學(xué)研究的進(jìn)一步深入，臨床對(duì)于耐藥基因的認(rèn)識(shí)也會(huì)越來越深，使用宏基因組學(xué)測序技術(shù)可以更快、更全面地獲得菌株耐藥信息，幫助臨床優(yōu)化抗菌藥物管理，對(duì)應(yīng)對(duì)突發(fā)流行性疾病十分重要。同時(shí)也能為宏基因組學(xué)測序技術(shù)在其他方面的應(yīng)用提供思路，如腫瘤DNA檢測、流行病學(xué)調(diào)查研究等。