胡劉平，劉 倩

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 310115；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201306

金黃色葡萄球菌是一種可以引起人類和動(dòng)物多種感染性疾病的革蘭陽(yáng)性菌，其致病性與細(xì)菌的凝集反應(yīng)和生物被膜形成密切相關(guān)，細(xì)菌通過復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)這些參與細(xì)菌凝集和生物被膜形成的毒力因子表達(dá)。據(jù)報(bào)道，金黃色葡萄球菌ArlRS二元調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)ebh基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制葡萄球菌表面蛋白表達(dá)，促進(jìn)凝集[1]。SaeRS二元調(diào)控系統(tǒng)在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。目前，關(guān)于SaeRS調(diào)控細(xì)菌生物被膜的分子機(jī)制尚有爭(zhēng)議，在不同菌株中調(diào)控方式不同[5-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，Newman(NM)菌株中由于SaeS第一個(gè)跨膜區(qū)點(diǎn)突變(L18P)導(dǎo)致其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改變，從而影響細(xì)胞外黏附蛋白eap表達(dá)，促進(jìn)細(xì)菌凝集，但在USA300菌株中并未發(fā)生這種變化[9]，提示金黃色葡萄球菌不同菌株調(diào)控方式不同。本研究通過外源性加入人血漿蛋白，探討不同金黃色葡萄球菌菌株的SaeRS在人血漿蛋白促進(jìn)細(xì)菌凝集和生物被膜形成中的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，人血漿蛋白通過促進(jìn)SaeRS調(diào)控靶基因的表達(dá)，促進(jìn)金黃色葡萄球菌的凝集和生物被膜形成[10]；SaeRS突變影響其調(diào)控方式，如在USA300菌株中，人血漿蛋白促進(jìn)凝固酶coa的高表達(dá)促進(jìn)細(xì)菌凝集；在NM菌株中，由于SaeS點(diǎn)突變，人血漿蛋白調(diào)控細(xì)菌凝集機(jī)制存在差異。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株 USA300、NM、ST398 09-1059、ST239 09-770、ST59 RJ2、ST9 2014-58、ST5 05-72、NMΔcoa、USA300Δcoa、NMΔeap和USA300Δeap。

1.1.2人血漿蛋白制備 收集10例健康體檢人員的靜脈抗凝(枸櫞酸鈉)血，男、女各5例，平均年齡29.9歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有全身性疾病和感染；(2)血紅蛋白水平低于110 g/L；(3)血小板計(jì)數(shù)低于150×109/L；(4)有吸煙習(xí)慣和在采血前5 d內(nèi)服用非甾體抗炎藥物。收集每例健康體檢人員2.7 mL靜脈血，每管含有0.3 mL枸櫞酸鈉溶液作為抗凝血?jiǎng)?60×g離心8 min，乏血小板血漿(PPP)、富血小板血漿(PRP)、濃縮紅細(xì)胞分層[10]。在無(wú)菌條件下，每管PPP約0.3 mL，位于分層溶液的頂部被抽吸。然后小心地收集位于紅細(xì)胞顆粒上的類似體積的PRP，以避免白細(xì)胞混入。PRP中血小板計(jì)數(shù)為285(183,386)×109/L;PPP中血小板計(jì)數(shù)為6(4,7)×109/L。血小板檢測(cè)采用Sysmex XN2800全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀。

1.2儀器與試劑 Molecular Devices SpectraMax250酶標(biāo)儀；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀；氣浴恒溫振蕩器(SHZ-82)；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)；RNeasy Mini Kit RNA 抽提試劑盒；Reverse Transcription Kit試劑盒。

1.3生物被膜形成與測(cè)定 所用培養(yǎng)基為TSB(30 g/L)添加0.5%葡萄糖注射液。接種前預(yù)先在96孔板微滴板上加入200 μL 20%的健康人PPP，并在4 ℃下孵育過夜。棄上清液加入200 μL新配置的菌懸液后，蓋上蓋子，于37 ℃條件下恒溫恒濕培養(yǎng)24 h，棄去96孔板中的培養(yǎng)物，用200 μL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值7.3)沖洗3次，去除培養(yǎng)基和浮游狀態(tài)的細(xì)菌。在96孔板中每個(gè)孔加入乙醇200 μL加蓋靜置15 min，吸除乙醇后在30 ℃環(huán)境下自然風(fēng)干，固定生物膜。然后在每個(gè)孔中加入1滴1%結(jié)晶紫溶液，靜置染色30 min后棄去染色液，用水沖洗直至無(wú)色，晾干。在染色的孔中加入200 μL 5%冰乙酸溶液，以200 μL 5%冰乙酸溶液作為空白孔，測(cè)定各個(gè)檢測(cè)孔590 nm波長(zhǎng)的吸光度值(A值)。

1.4細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn) 挑取血平板上單個(gè)菌落于3 mL TSB 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，然后吸取80 μL 菌液加入到8 mL TSB培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，PBS洗滌3次后配置成A值為1.0的菌懸液2管，其中一管加入2.5%的PPP，室溫靜置培養(yǎng)2 h，每隔15 min吸取上清液檢測(cè)A600值直至2 h。

1.5反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 分別收集NM和USA300及其敲除sae 菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(2 h)的菌落，加入磁珠管內(nèi)用破碎機(jī)振蕩2次(頻率：1 600次/分)進(jìn)行金黃色葡萄球菌破壁，然后用RNeasy Mini Kit RNA抽提試劑盒提取RNA。利用IDT在線軟件根據(jù)已發(fā)表的金黃色葡萄球菌序列設(shè)計(jì)emp、eap、clfb、coa、gyrb引物，寡核苷酸引物序列見表1。取1 μg RNA配成7 μL體系用HifairTMⅢ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；然后取2.5 μL cDNA加入22.5 μL[引物+SYBR Green Master(ROX)+H2O]體系中，采用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀進(jìn)行擴(kuò)增，條件如下：50 ℃ 2 min，94 ℃ 15 min，40個(gè)循環(huán)(94 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 32 s)，繪制解離曲線(95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s)。所有標(biāo)本均重復(fù)3次，以gyrb作為參考基因。

表1 引物序列

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism5軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并繪制圖表。組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1金黃色葡萄球菌凝集和生物被膜形成檢測(cè) 首先通過外源性加入人血漿蛋白，體外檢測(cè)細(xì)菌凝集和生物被膜的形成。收集目前金黃色葡萄球菌臨床感染不同ST分型的臨床分離株(ST398 09-1059、ST239 09-770、ST59 RJ2、ST9 2014-58、ST5 05-72)和2株實(shí)驗(yàn)室菌株UAS300和NM。加入PPP血漿蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)細(xì)菌中加入PPP，所有檢測(cè)的金黃色葡萄球菌菌株相對(duì)于PBS對(duì)照組，均表現(xiàn)出更強(qiáng)的凝集效應(yīng)。PPP促進(jìn)不同菌株的凝集表型有差異，PPP促進(jìn)NM菌株凝集能力最強(qiáng)，而ST398 09-1059凝集能力最弱(圖1A)，提示人血漿蛋白可以促進(jìn)金黃色葡萄球菌的凝集發(fā)生，但不同臨床分離菌株中存在差異。細(xì)菌凝集和生物被膜的形成密切相關(guān)，本研究進(jìn)一步在人血漿蛋白中搭建了觀察金黃色葡萄球菌的生物被膜形成的檢測(cè)體系顯示，無(wú)論是在培養(yǎng)基中加入PRP或PPP，所有檢測(cè)的金黃色葡萄球菌體外生物被膜形成能力均明顯增強(qiáng)(圖1B)，提示人血漿蛋白促進(jìn)金黃色葡萄球菌生物被膜形成具有廣譜性。

注：A為金黃色葡萄球菌不同臨床菌株在PBS和PPP中的凝集表型比較，*P<0.05；B為金黃色葡萄球菌不同臨床菌株在PRP和PPP培養(yǎng)基中的生物膜結(jié)果，*P<0.05。

2.2人血漿蛋白通過調(diào)控SaeRS二元調(diào)控系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)菌凝集和生物被膜形成 本研究分別向NM和USA300菌株的PBS培養(yǎng)基中加入PPP，在PPP組這兩種菌株均出現(xiàn)了凝集效應(yīng)，NM菌株的凝集效果明顯強(qiáng)于USA300菌株。在NM和USA300菌株中引入sae基因突變后，對(duì)應(yīng)的凝集效應(yīng)均明顯降低。結(jié)果顯示，sae的存在能夠明顯影響金黃色葡萄球菌的凝集能力(圖2A)。進(jìn)一步通過體外生物被膜研究發(fā)現(xiàn)，人血漿蛋白不能促進(jìn)NMΔsae或者是USA300Δsae敲除菌株的生物被膜形成(圖2B)。為了進(jìn)一步證實(shí)SaeRS調(diào)控細(xì)菌凝集過程，本研究在NMΔsae菌株中分別回補(bǔ)SaeRS和SaeRS L18P的表達(dá)，構(gòu)建了互補(bǔ)菌株NMpSaeRS和NMpSaeRS L18P。本研究顯示，SaeRS和SaeRS L18P菌株在人血漿蛋白中均可回復(fù)sae敲除菌株細(xì)菌凝集活性，并且回復(fù)活化狀態(tài)的SaeRS L18P的菌株，其凝集活性明顯強(qiáng)于pSaeRS(圖3)，進(jìn)一步證實(shí)人血漿蛋白通過調(diào)控SaeRS二元調(diào)控系統(tǒng)影響細(xì)菌凝集，NM菌株中SaeRS系統(tǒng)的高度活化導(dǎo)致NM菌株的高度凝集狀態(tài)。

注：A為金黃色葡萄球菌(USA300和NM)sae 敲除菌株的凝集表型比較，*P<0.05；B為金黃色葡萄球菌(USA300和NM)sae敲除菌株的生物膜結(jié)果，*P<0.05。

注：*P<0.05。

2.3人血漿蛋白調(diào)控coa和eap敲除菌株凝集檢測(cè) 為了探討在不同菌株中人血漿蛋白調(diào)控SaeRS系統(tǒng)的分子機(jī)制，本研究分別構(gòu)建了SaeRS系統(tǒng)調(diào)控的靶基因coa和eap敲除菌株并檢測(cè)其凝集活性，研究發(fā)現(xiàn)，PPP可以促進(jìn)NMΔcoa敲除菌株的凝集活性，但不能促進(jìn)USA300Δcoa敲除菌株的凝集活性，PPP仍然可以促進(jìn)NMΔeap和USA300Δeap敲除菌株的凝集活性，見圖4A、4B。

注：A為金黃色葡萄球菌(NM和USA300)coa和eap敲除菌株在觀察終點(diǎn)(2 h)的凝集結(jié)果，*P<0.05；B為金黃色葡萄球菌(NM和USA300) coa敲除菌株的生物膜結(jié)果，*P<0.05。

2.4金黃色葡萄球菌在人血漿蛋白作用時(shí)不同基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平 USA300菌株SaeRS可能通過調(diào)控靶基因coa的表達(dá)發(fā)揮功能，但是NM菌株中SaeRS靶基因coa和eap敲除后均不影響人血漿蛋白對(duì)細(xì)菌凝集表型的影響。為了進(jìn)一步探討人血漿蛋白調(diào)控細(xì)菌凝集的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了人血漿蛋白作用下USA300和NM菌株中SaeRS調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明，USA300菌株中人血漿蛋白明顯促進(jìn)coa基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而在NM菌株中人血漿蛋白作用下，SaeRS調(diào)控的多個(gè)靶基因(coa、eap、clfb、emp)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)。見圖5。

注：*P<0.05。

3 討 論

金黃色葡萄球菌可以利用宿主血漿蛋白促進(jìn)自身凝集，本研究發(fā)現(xiàn),人血漿蛋白可促進(jìn)金黃色葡萄球菌不同來(lái)源的臨床分離菌株的凝集及生物被膜形成，但是不同臨床分離菌株對(duì)人血漿蛋白的效果不同。據(jù)報(bào)道，NM菌株中SaeRS L18P點(diǎn)突變使其處于高度活化狀態(tài)[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，人血漿蛋白促進(jìn)NM菌株凝集活性最強(qiáng)，推測(cè)是否是因?yàn)镾aeRS二元調(diào)控系統(tǒng)高度活化導(dǎo)致的這種現(xiàn)象，進(jìn)一步分別以USA300和NM 為背景構(gòu)建sae敲除菌株發(fā)現(xiàn)，在NM和USA300菌株中引入sae基因突變后，對(duì)應(yīng)的凝集效應(yīng)和生物被膜形成能力均明顯降低，提示SaeRS二元調(diào)控系統(tǒng)在人血漿蛋白促進(jìn)細(xì)菌凝集和生物被膜形成過程中發(fā)揮重要作用。

據(jù)報(bào)道，金黃色葡萄球菌SaeRS調(diào)控系統(tǒng)的靶基因coa可促進(jìn)細(xì)菌凝集[14]。NM菌株中三磷酸腺苷依賴蛋白酶FtsH通過促進(jìn)SaeRS靶基因eap的高表達(dá)促進(jìn)細(xì)菌凝集[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，SaeRS二元調(diào)控系統(tǒng)在不同菌株中通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而影響細(xì)菌凝集和生物被膜形成。在USA300菌株中人血漿蛋白主要通過調(diào)控SaeRS調(diào)控因子coa的表達(dá)促進(jìn)細(xì)菌凝集，但在NM菌株中人血漿蛋白調(diào)控SaeRS下游eap的表達(dá)并不是促進(jìn)細(xì)菌凝集的唯一機(jī)制，人血漿蛋白可能通過調(diào)控SaeRS下游多個(gè)靶基因的表達(dá)協(xié)同作用而促進(jìn)細(xì)菌凝集。

細(xì)菌的凝集反應(yīng)和生物被膜形成與金黃色葡萄球菌的致病性密切相關(guān)[15-16]，但SaeRS調(diào)控細(xì)菌生物被膜的分子機(jī)制尚有爭(zhēng)議。PAHARIK等[17]研究發(fā)現(xiàn),SaeRS通過促進(jìn)核酸酶表達(dá)降解細(xì)菌DNA抑制生物被膜形成。本研究通過對(duì)不同臨床分離菌株研究發(fā)現(xiàn)，人血漿蛋白通過SaeRS二元調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)菌凝集和生物被膜形成。本研究利用人血漿蛋白成功建立了用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的凝集活性和生物被膜形成的體系，具體通過檢測(cè)A值及相應(yīng)百分比進(jìn)行量化。本研究分別采用兩種不同的血漿蛋白進(jìn)行作用，結(jié)果表明，人血漿蛋白促進(jìn)金黃色葡萄球菌凝集發(fā)生和生物被膜的形成具有廣譜性，并且與血漿中血小板無(wú)關(guān)，提示主要是因?yàn)槿死w維蛋白原在這個(gè)過程中發(fā)揮功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由于SaeRS二元調(diào)控系統(tǒng)活性變化會(huì)導(dǎo)致人血漿蛋白調(diào)控機(jī)制發(fā)生改變。NM菌株中SaeS的點(diǎn)突變導(dǎo)致SaeRS系統(tǒng)呈高活化狀態(tài)時(shí)，人血漿蛋白調(diào)控機(jī)制發(fā)生變化，提示毒力調(diào)控蛋白單個(gè)氨基酸改變可以導(dǎo)致整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化。

據(jù)報(bào)道，凝固酶通過降解宿主纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白促進(jìn)細(xì)菌凝集和生物被膜形成[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，NM菌株中SaeRS對(duì)coa的調(diào)控并不是其唯一的調(diào)控機(jī)制，一方面提示細(xì)菌中還有其他毒力因子參與宿主蛋白相互作用；另一方面提示宿主其他一些未知血漿蛋白也參與細(xì)菌的凝集過程。后期需要通過構(gòu)建可能參與凝集的細(xì)菌毒力因子多敲除菌株進(jìn)一步探尋細(xì)菌與宿主相互作用的主要分子，為治療金黃色葡萄球菌感染提供新的藥物靶標(biāo)及理論依據(jù)。