李飛飛,劉克海,2*

脆江蘺多糖的理化分析及其抗氧化活性評價

李飛飛1,劉克海1,2*

1. 上海海洋大學食品科學與技術(shù)學院, 上海 201306 2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心, 上海 201306

以脆江蘺為原料，采用熱水浸提法得到脆江蘺瓊脂糖（agarose，GCA）和脆江蘺硫瓊脂（agaropectin，GCAP），GCAP經(jīng)三氯乙酸脫蛋白、透析、柱層析純化（DEAE-cellulose色譜柱及Sephadex色譜柱）等，得到純化的脆江蘺硫瓊脂（purifiedagaropectin，PGCAP），并對GCA、GCAP、PGCAP進行化學組成、傅里葉紅外、分子量、單糖組成及抗氧化能力測定。結(jié)果表明，3種多糖均含有約10%的糖醛酸，PGCAP的蛋白含量僅為0.11%，而GCA中3,6-內(nèi)醚半乳糖含量約高達52%；GCA、GCAP、PGCAP分子量分別2.076×104、5.392×105、4.347×104Da；GCA、GCAP、PGCAP主要由半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸組成，但占比略有差異；在1～3.5 mg/mL范圍內(nèi)，3種多糖均具有一定的DPPH清除能力，PGCAP超氧化自由基（O2-·）清除率最高（52%），而GCA羥基自由基（·OH）清除率最高（56%）。3種多糖的理化組成存在差異性，其抗氧化能力各異。PGCAP的抗氧化能力整體上強于GCA和GCAP，而GCAP最弱。本研究為推動脆江蘺的綜合利用和高值化開發(fā)提供了理論支持。

脆江蘺; 多糖; 理化性質(zhì); 抗氧化

脆江蘺（）隸屬于江蘺屬，藻體肥厚多汁、質(zhì)脆、易折斷，是我國沿海常見的大型經(jīng)濟紅藻，可用于水質(zhì)改善、漁業(yè)養(yǎng)殖、瓊脂提取，亦常制成涼菜、湯液等而被食用[1]。目前，對于脆江蘺的高值化開發(fā)利用尚需提升，基于海藻活性成分的精深加工是調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、實現(xiàn)增值增效、保護生態(tài)環(huán)境的重要途經(jīng)。陳偉洲等[2]研究表明脆江蘺富含大量碳水化合物，且不易被消化，是攝取優(yōu)質(zhì)膳食纖維的重要來源。鞠瑤瑤等[3]研究表明，多糖約占脆江蘺質(zhì)量的1/3，是其重要的組成成分。多糖作為一種重要的天然成分，具有優(yōu)良的生物活性和開發(fā)潛力，是當前海藻研究的熱點。

江蘺屬多糖多為瓊脂型多糖，主要為瓊脂糖和硫瓊脂，前者具有凝膠性，其基本骨架是由重復的→3)-α-D-半乳糖-(1→4)-3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖-(1→片段形成的線性大分子[5]。瓊脂糖的凝膠強度通常與3,6-內(nèi)醚半乳糖含量成正比，與硫酸基含量成反比[6]。硫瓊脂常發(fā)生硫酸基等取代，因而無凝膠性[7]。研究發(fā)現(xiàn)，3,6-內(nèi)醚半乳糖因其結(jié)構(gòu)的獨特性，在抗氧化、抑制α葡萄糖苷酶活力等方面顯示出潛在的生物活性，且發(fā)現(xiàn)純化多糖比粗多糖具有更好的生物活性[3,4,8,9]。提取分離脆江蘺中瓊脂糖和硫瓊脂，并進行結(jié)構(gòu)和活性分析，目前尚未見報道。本研究以脆江蘺為原料，分離出瓊脂糖和硫瓊脂，并純化得到均一的硫瓊脂，進而對3種多糖進行理化分析及抗氧化活性評價，為脆江蘺的綜合利用和高值化開發(fā)利用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脆江蘺購買于山東省愛蓮灣海域，經(jīng)清洗、烘干，剪切成1 cm片段，備用；DEAE-cellulose（52）填料、交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-100）填料、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、乙縮醛、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等均為分析純.

SynergyTM Mx酶標儀（美國BioTek公司）；Nicolet 6700紅外光譜儀（美國Thermo Scientific公司）；Waters 2695 HPLC（美國Waters公司）；ICS-2500高效離子色譜儀（美國Dionex公司）。國產(chǎn)RE3000-D旋蒸儀、80-2高速冷凍離心機、UV/V-16 /18紫外可見分光光度計、XMTD-7000水浴鍋。

1.2 脆江蘺多糖的分離、純化

取50 g脆江蘺，以料液1:50（g/mL）的比例加入去離子水，于80 ℃下保溫提取2次，每次4 h，合并濾液，4 ℃下過夜，離心得到凝膠性瓊脂糖，命名為GCA，非凝膠部分為硫瓊脂，命名為GCAP。將GCAP減壓濃縮至原液的1/3，并用3倍體積的無水乙醇沉淀多糖。之后，將上述乙醇溶液中沉降組分離心，加入濃度為3%的三氯乙酸，過夜去除蛋白，將上述多糖再次醇沉，并于透析袋（3500 Da）透析48 h，濃縮，凍干。

將上述凍干粉配成20 mg/mL的溶液，選擇DEAE-52纖維素色譜柱（50 cm × 1.6 cm）過柱，依次采用超純水、不同濃度的氯化鈉溶液（0.1、0.3和0.5 mol/L）逐步洗脫，用恒流泵監(jiān)控流速，每隔4 min收集1管（6 mL/管，1.5 mL/min），采用紫外分光光度計測定每管中多糖含量并繪圖[10]。合并、濃縮0.3 mol/L氯化鈉的洗脫峰，選擇Sephadex G-100柱（70 cm × 2.6 cm）以1 mL/min進一步洗脫，合并、濃縮洗脫液，凍干，即為PGCAP（其洗脫曲線見尚未發(fā)表的文獻）。

1.3 化學組成檢測

總糖含量測定：參考史瑞琴等[10]方法測定GCA、GCAP、PGCAP中總糖含量。

糖醛酸含量測定：參考Bltter等[12]方法測定GCA、GCAP、PGCAP中糖醛酸含量。

蛋白含量測定：參考莫開菊等[13]方法測定GCA、GCAP、PGCAP中蛋白含量。

3,6-內(nèi)醚半乳糖含量測定：參考Yaphe等[14]方法測定GCA、GCAP、PGCAP中3,6-內(nèi)醚半乳糖含量。

1.4 紅外光譜分析

取300 mg KBr充分碾磨，加入3 mg多糖，充分混合，壓片（薄而透明）。用KBr扣除背景板，在350到4000 cm-1波長內(nèi)對樣品進行FI-IR掃描測定[15]。

1.5 分子量測定

參考Liu等方法進行分子量測定[16]。分別稱取5 mg的GCA、GCAP、PGCAP樣品，溶解、過濾、上機檢測。色譜條件：Waters 2695 HPLC系統(tǒng)配備示差折光檢測器、UV檢測器、示差折光檢測器（RI）、多角度激光光散射檢測器（RI）；色譜柱為TSK-GEL系列G6000PWXL、G4000PWXL和 G2500PWXL分析柱（TOSOH 公司，日本）；以硝酸鈉（0.15 mol/L）和酸性磷酸鈉（0.05 mol/L）為流動相；流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃。

1.6 單糖組成測定

采用離子色譜法進行單糖組成測定[17]。分別稱取2 mg GCA、GCAP、PGCAP樣品，加入2 mol/L三氟乙酸于110 ℃油浴4 h。于上述冷卻液中加入甲醇，N2吹干，重復多次。然后加水溶解、過濾、上機檢測。色譜條件：Dionex ICS2500系統(tǒng)；CarboPacMA-1陰離子交換分析柱（Dionex公司，美國）；用氫氧化鈉（0.48 mol/L）為流動相，流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃。

1.7 抗氧化活性評價

1.7.1 DPPH自由基清除率采用Wu等[18]的方法測定GCA、GCAP、PGCAP對DPPH的清除能力，精確吸取等體積的一定濃度的樣品（0、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL）與DPPH-無水乙醇溶液（0.1 mmol/L）于96孔板中，充分混勻，蓋上錫箔紙反應(yīng)0.5 h，然后用酶標儀測定吸光值。以不同濃度的L-抗壞血酸（1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL）為陽性對照，上述樣品的各個濃度設(shè)置3個平行組。

式中：A，A、A分別表示空白組（100 μL超純水+100 μL DPPH溶液）、多糖樣品組（100 μL多糖/L-抗壞血酸+100 μL DPPH溶液）、扣除本底對照組（100 μL多糖/ L-抗壞血酸+100 μL無水乙醇）在517 nm的測定值。

1.7.2 羥基自由基清除率參照邵佳等[19]的方法測定GCA、GCAP、PGCAP對羥基自由基的清除能力。精確吸取500 μL多糖溶液(0、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL)，依次向多糖溶液中添加500 μL硫酸亞鐵（6 mmol/L）、500 μL水楊酸（6 mmol/L）、100 μL雙氧水（6 mmol/L），充分搖勻，在37 ℃條件下反應(yīng)0.5 h，測定吸光度值。以不同濃度的L-抗壞血酸（1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL）為陽性對照，上述樣品的各個濃度設(shè)置3個平行組。

式中：A，A、A分別表示空白組（500 μL超純水+500 μL FeSO4+500 μL水楊酸+100 μL雙氧水）、多糖樣品組（500 μL多糖/L-抗壞血酸 + 500 μL FeSO4+500 μL水楊酸+100 μL雙氧水）、對照組（500 μL多糖/L-抗壞血酸 + 500 μL FeSO4+500 μL水楊酸+100 μL超純水）在510 nm的測定值。

1.7.3 超氧陰離子自由基清除率參照馬軍等[20]的方法測定GCA、GCAP、PGCAP對超氧陰離子的清除能力，吸取0.05 mmol/L的Tris-HCl溶液（pH=8.2）450 μL于各試管，再加入上述濃度的各多糖溶液100 μL，加入鄰苯三酚溶液（0.025 mol/L）40 μL，充分混勻，25 ℃條件下反應(yīng)5 min，測定吸光度值。以不同濃度的L-抗壞血酸（1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL）為陽性對照，上述樣品的各個濃度設(shè)置3個平行組。

式中：A，A、A分別表示空白組（100 L超純水+450 μL Tris-HCl+40 μL鄰苯三酚）、多糖樣品組（100 μL多糖/L-抗壞血酸+450 μL Tris-HCl+40 μL鄰苯三酚）、對照組（100 μL多糖/Vc +450 μL Tris-HCl+40 μL鹽酸）在320 nm的測定值。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗重復3次，采用one-way AVONA和Duncan進行顯著性檢驗(<0.05)，用OriginPro 9.0和GraphPad Prism 8.0.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學組成分析

表1 GCA、GCAP、PGCAP的化學組成

注：同一行中標有不同字母表示不同樣品中的同一化學成分含量有顯著性差異(<0.05)。

Note: Different letters marked in the same line indicate that the content of the chemical component in different samples has significant difference (<0.05).

3種脆江蘺多糖GCA、GCAP、PGCAP其化學組成測定結(jié)果見表1。由表1可知，GCA、PGCAP和GCAP的總糖含量分別為74.6%、63.8%、31.74%，其中，PGCAP的總糖含量明顯高于GCAP，說明PGCAP經(jīng)純化后，多糖純度得到極其顯著性提高（＜0.05）。據(jù)報道江蘺（）粗多糖經(jīng)過柱層析法純化后，其多糖含量由原來的52.65%提高至67.60%[21]。這3種脆江蘺多糖均含有糖醛酸，說明均是酸性多糖。PGCAP的蛋白含量僅為0.11%，表明在純化過程中蛋白幾乎被去除。另外，GCA中3,6-內(nèi)醚半乳糖含量為52.36%，約占其總糖含量的70.2%，這可能是其具有凝膠性的原因，而3,6-內(nèi)醚半乳糖分別僅占PGCAP和GCAP總糖含量的18.6%和24.7%[22]。

2.2 紅外光譜分析

由圖1可知，在3432、2922 cm-1處的信號峰分配給O-H、C-H的伸縮振動信號，均為典型的多糖信號峰[23]。在1638 cm-1處的吸收峰歸屬于C=O的伸縮振動，表明GCA、GCAP、PGCAP糖醛酸含量存在差異[24]。在1256 cm-1處為S=O伸縮振動峰，反映GCA、GCAP、PGCAP中硫酸基含量情況。在1145 cm-1、1073 cm-1和1034 cm-1處出現(xiàn)3個吸收峰，證明存在吡喃糖環(huán)，其中1145 cm-1處的信號峰為半乳糖吸收峰，在1073 cm-1處的信號峰歸屬為吡喃糖糖環(huán)上C-O-C的非對稱吸收峰[25]。

圖1 GCA、GCAP、PGCAP紅外光譜圖

2.3 分子量分析

由圖2和表2可知，GCA和PGCAP分子量較接近，其重均分子量分別為2.076×104、4.347×104Da。GCA和PGCAP的HPLC色譜圖只出現(xiàn)一個峰，表示有較高的純度。Mw/Mn表示分散度，比值越大，反映均一性越差，因此，PGCAP具有較高均一性，表明柱層析法純化效果優(yōu)良。GCAP出現(xiàn)多個洗脫峰，說明均一性較差，其分子量主要分布在5.392×105Da，略低于GCA和PGCAP分子量。

圖2 GCA、GCAP、PGCAP的HPLC圖

Fig.2 HPLC of GCA, GCAP and PGCAP

表2 GCA、GCAP、PGCAP分子量

2.4 單糖組成分析

通過與單糖標品對比，采用離子色譜法測得GCA、GCAP、PGCAP的單糖組成。GCA由4種單糖組成，主要含有半乳糖組成，且存在少量葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，表明其是一種酸性多糖。GCAP、PGCAP由6種單糖組成，除含半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸外，還檢測出少量的木糖和甘露糖。

圖3 GCA、GCAP、PGCAP的離子色譜圖

Fig.3 Ion chromatograms of GCA, GCAP and PGCAP

表3 GCA、GCAP、PGCAP的單糖組成

注：“—”表示未測出。

Note: "-" means no measurement.

2.5 抗氧化活性分析

2.5.1 DPPH清除率如圖4所示，在1 mg/mL～3 mg/mL范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增大，GCA、GCAP的DPPH自由基清除活力逐漸提高，在3 mg/mL時其抗氧化能力達到最大，之后隨著多糖濃度逐漸增大，其DPPH自由基清除率趨于平衡，而PGCAP在1 mg/mL時即達到最大值。

圖4 GCA、GCAP、PGCAP對DPPH自由基的清除能力

2.5.2 ·OH清除率如圖5所示，隨著多糖濃度的增大，GCA、GCAP、PGCAP的·OH清除能力逐漸增強，其中，GCA在3.5 mg/mL時·OH清除率達到最大值56%?？傮w上，三種多糖的羥基自由基清除能力強弱順序為Vc＞GCA＞GCAP＞PGCAP。

圖5 GCA、GCAP、PGCAP對羥基自由基的清除能力

2.5.3 O2-·清除率如圖6所示，PGCAP的O2-·清除效果遠強于GCA、GCAP，在1.5 mg/mL時其O2-·清除活力基本達到最大值52%。GCA的超氧化陰離子清除能力在最大測定濃度（3.5 mg/mL）時達到最大，清除率為35%，低于GCAP的超氧化陰離子清除能力。總體上3種多糖的羥基自由基清除能力強弱順序為Vc＞PGCAP＞GCAP＞GCA。

圖6 GCA、GCAP、PGCAP對超氧陰離子自由基的清除能力

3 討論

脆江蘺是我國沿海地區(qū)常見的一種紅藻，瓊脂是其重要的生物活性成分。瓊脂主要由瓊脂糖與硫瓊脂組成。本文采用離心法將GCA和GCAP分離開來，并對GCAP進一步分離純化得到PGCAP。史晨杉等[26]發(fā)現(xiàn)瓊脂糖與硫瓊脂的差異主要是3,6-內(nèi)醚半乳糖含量不同?；瘜W組成分析表明GCA的3,6-內(nèi)醚半乳糖的含量高達52.36%，明顯高于GCAP和PGCAP。3種多糖的酸性多糖主要為半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，GCA總糖醛酸含量較GCAP、PGCAP高。中性多糖均以半乳糖為主要成分。GCAP、PGCAP分子量分別為5.392×105、4.347×104Da，與盧佳芳[27]提取的龍須菜瓊脂糖分子量大小大體吻合。

多糖作為一種天然抗氧化劑，具有良好的生物安全性，是當前抗氧化劑開發(fā)與研究的熱點。研究表明，酸性基團（硫酸基、糖醛酸等），有提供氫離子能力，能弱化多糖氫鍵作用力，吸附自由基，從而發(fā)揮抗氧化作用[28,29]。1～3.5 mg/mL內(nèi)，GCA、GCAP、PGCAP最大清除率均在35%左右，這可能與其酸性基團的含量有關(guān)。REN等[30]發(fā)現(xiàn)低分子量多糖表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。GCA、PGCAP的·OH清除率高于GCAP，且GCA略高PGCAP，這可能由于其分子量大小和3,6-內(nèi)醚半乳糖含量有關(guān)[31]。DI等[9]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過柱層析法純化的多糖其抗氧化能力強于粗多糖。PGCAP表現(xiàn)出最高的O2-·清除能力，這可能與其經(jīng)過陰離子交換柱和葡聚糖凝膠柱兩次柱層析純化后分子量、電荷密度相對均一有關(guān)。

4 結(jié)論

本文從脆江蘺中分離得到3種多糖組分GCA、GCAP、PGCAP，并對其進行理化性質(zhì)分析和抗氧化活性評估?？寡趸Y(jié)果表明，3種的抗氧化能力整體上表現(xiàn)為：PGCAP＞GCA＞GCAP。上述結(jié)果可能是由于其酸性基團、3,6-內(nèi)醚半乳糖、分子量分布等差異而致。多糖的抗氧化能力由多種因素共同決定，關(guān)于其抗氧化能力仍需進一步探索。在測定濃度范圍內(nèi)，PGCAP的羥基自由基和超氧陰離子的最大清除率分別45%、52%。這為脆江蘺進一步開發(fā)為抗氧化功能基料、實現(xiàn)加工增值奠定了實驗基礎(chǔ)，為多糖抗氧化機制的研究提供理論支撐。

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Physicochemical Analysis and Their Antioxidant Evaluation of Polysaccharidesfrom

LI Fei-fei1, LIU Ke-hai1,2*

1.201306,2.201306,

as starting material,agarose (GCA) andagaropectin (GCAP) were obtained fromby hot water extraction. Then, GCAP was further purified by methods of trichloroacetic acid deproteinization, dialysis and column chromatography (DEAE-Cellulose and Sephadex chromatographic columns) to obtain purifiedagaropectin (PGCAP). The chemical composition, Fourier infrared, molecular weight, monosaccharide composition and antioxidant activity of GCA, GCAP and PGCAP were determined. The results showed that the three polysaccharides all contain about 10% uronic acid, and the protein content of PGCAP was only 0.11%, while the content of 3,6-anhydrogalactose of GCA was about 52%. The molecular weights of GCA, GCAP and PGCAP were 2.076×104Da, 5.392×105and 4.347×104Da, respectively. GCA, GCAP and PGCAP were mainly composed of galactose, glucose, glucuronic acid and galacturonic acid, but proportions of their were slightly different. At concentrations of 1-3.5 mg/mL, three polysaccharides showed certain DPPH scavenging activity, the scavenging rate of superoxide free radical (O2-·) in PGCAP was the strongest (52%), while the scavenging rate of hydroxyl free radical (·OH) in GCA was the strongest (56%). Overall, the antioxidant capacity of PGCAP was stronger than that of GCA and GCAP, and GCAP was the weakest. This study provides theoretical support for promoting the comprehensive utilization and high-value development of.

; polysaccharides; physicochemical analysis; antioxidation

TS254.1

A

1000-2324(2021)05-0746-07

2021-11-19

2021-11-24

國家自然科學基金資助項目(81572989);上海市科委工程中心建設(shè)項目(18430721100)

通訊作者:Author for correspondence.E-mail:khliu@shou.edu.cn

李飛飛(1993-),女,碩士研究生,研究方向:功能性食品的開發(fā)與利用. E-mail:17865515152@163.com