劉在哲,葛磊,季延平,張雨桐,趙濤,亓玉昆,張玉嬌,王清海*

紅肉蘋(píng)果炭疽病病原鑒定及其生長(zhǎng)適應(yīng)性研究

劉在哲1,2,葛磊3,季延平2,張雨桐4,趙濤5,亓玉昆2,張玉嬌1,王清海2*

1. 濟(jì)南市林場(chǎng), 山東 濟(jì)南 250014 2. 山東省林業(yè)科學(xué)研究院, 山東 濟(jì)南 250014 3. 山東省林草種質(zhì)資源中心, 山東 濟(jì)南 250102 4. 福建師范大學(xué), 福建 福州 350108 5. 泰安市徂徠山林場(chǎng), 山東 泰安 271027

為明確紅肉蘋(píng)果的侵染病菌種類(lèi)及其生長(zhǎng)適宜條件，本文采用形態(tài)學(xué)、致病性以及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，并測(cè)定其培養(yǎng)基類(lèi)型、溫度、pH、光照適宜生長(zhǎng)條件。結(jié)果表明：暹羅炭疽菌（）為其侵染病菌；馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）、沙氏培養(yǎng)基（SDA），25 °C～30 °C,pH 8.0～10.0，持續(xù)光照或黑暗交替（12h:12h）等環(huán)境條件適宜菌絲生長(zhǎng)。

暹羅炭疽菌; 病原鑒定; 生物學(xué)

蘋(píng)果適應(yīng)性廣、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、耐貯存，是世界性水果之一。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2019年全球蘋(píng)果結(jié)果面積4,717,384 hm2，產(chǎn)量87,236,221 kg，中國(guó)蘋(píng)果結(jié)果面積2,041,197 hm2，產(chǎn)量42,426,578 kg，在種植面積和總產(chǎn)量方面位列世界第一。然而，就單位面積產(chǎn)量來(lái)看，世界蘋(píng)果主產(chǎn)國(guó)美國(guó)、法國(guó)、意大利的平均單位面積產(chǎn)量分別為420,468 hg/hm2、348,124 hg/hm2、418,853 hg/hm2，而中國(guó)僅為207,851 hg/hm2(http://www.fao.org/faostat/zh/#data/QC)，單位面積產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于美國(guó)、法國(guó)、意大利。其中，病蟲(chóng)害危害是重要的原因之一。

蘋(píng)果在生長(zhǎng)季節(jié)容易受到多種病害的侵染，嚴(yán)重影響蘋(píng)果的產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)，其中由炭疽菌屬（sp.）真菌引起的蘋(píng)果炭疽?。喔?、葉枯病）是全球范圍內(nèi)一類(lèi)最重要的真菌病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。炭疽菌屬真菌是全球分布的一類(lèi)重要的植物病原真菌，可以侵染多種谷類(lèi)作物、水果、蔬菜以及觀賞植物等寄主，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。由于其重要的科學(xué)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，炭疽菌屬真菌已經(jīng)成為全球第八類(lèi)重要的植物病原真菌[4]，對(duì)全球農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

目前已知可以侵染蘋(píng)果的炭疽菌屬真菌有(巴西、韓國(guó)、美國(guó))[5-8]、（韓國(guó)、巴西、美國(guó)、日本）[6-11]、（韓國(guó)、美國(guó)、比利時(shí)、法國(guó)、斯洛文尼亞）[6,8,12-14]、s.s.（韓國(guó)）[6]，（韓國(guó)、美國(guó)、日本）[6,8,10]、（巴西）[7]（巴西）[7]（巴西）[7](捷克、比利時(shí)、新西蘭、烏拉圭)[12,15-17]（巴西）[18]（美國(guó)）[8]（挪威）[19]（日本）[10]（美國(guó)）[20]sp. nov.（美國(guó)）[20]（比利時(shí)）[12]（比利時(shí)）[21]（比利時(shí)、英國(guó)、斯洛文尼亞）[12,14,21]（烏拉圭）[17]。

蘋(píng)果炭疽病是中國(guó)蘋(píng)果各產(chǎn)區(qū)的一種的重要植物病害。已有的報(bào)道表明，在中國(guó)引起蘋(píng)果炭疽病的炭疽菌主要有、、、、、、（中國(guó)）[22,23]。

近些年來(lái)，隨著人們對(duì)功能性水果的迫切需求，紅肉蘋(píng)果（）是新疆野蘋(píng)果的一種變種，原產(chǎn)于中國(guó)及哈薩克斯坦。由于其富含花青苷、綠原酸、原兒茶酸、根皮苷等多種保健功能物質(zhì)以及亮麗的外觀品質(zhì)，作為功能果品，美國(guó)、加拿大、日本、中國(guó)、新西蘭等多個(gè)國(guó)家的蘋(píng)果育種專(zhuān)家相繼開(kāi)展了相關(guān)的研究。截止目前，已有的3000余份紅肉蘋(píng)果資源或品種（系），均是新疆紅肉蘋(píng)果直接或間接的后代。2015年，山東省種植的紅肉蘋(píng)果，炭疽病發(fā)生嚴(yán)重，病果率達(dá)到50%以上，嚴(yán)重的園區(qū)甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重影響紅肉蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此完全有必要對(duì)紅肉蘋(píng)果炭疽病病原進(jìn)行系統(tǒng)研究，明確其生物特性，為紅肉蘋(píng)果炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感病紅肉蘋(píng)果果實(shí)，從山東省濟(jì)南市唐王鎮(zhèn)紅肉蘋(píng)果種植園采集。

1.2 方法

1.2.1 紅肉蘋(píng)果炭疽病病組織分離及分離菌單孢培養(yǎng) 采用組織分離法。樣品用70%乙醇表面消毒后，利用滅菌的解剖刀在果實(shí)病健交界處3～4 mm2的組織塊，先用1%次氯酸鈉浸泡1 min，然后再用70%乙醇溶液浸泡1 min，最后無(wú)菌水沖洗3次。置于PDA平板上，每個(gè)平皿放置5塊，28 ℃培養(yǎng)5 d，挑取單個(gè)菌落菌絲，轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上，28 ℃下培養(yǎng)7 d，采取孢子稀釋分離法獲取單菌落。將單菌落菌株培養(yǎng)后移于斜面試管中，4 ℃保存。所有菌種均保存于山東省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 分離菌致病性測(cè)定 采用離體接種法。品種為‘玖紅蘋(píng)果’。選擇無(wú)病無(wú)蟲(chóng)傷的蘋(píng)果果實(shí)、葉片，用自來(lái)水沖洗干凈，晾干后，用75%酒精表面消毒，備用。將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，在菌落邊緣用打孔器制作菌餅（φ = 5 mm），以空白PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，用無(wú)菌的接種針（φ = 0.5 mm）輕微刺傷果實(shí)、葉片，每片葉接種1片菌餅、每個(gè)果實(shí)接種3片菌餅，每個(gè)處理葉和果實(shí)各5片（個(gè)），試驗(yàn)重復(fù)2次。將處理后的果實(shí)、葉片置于滅菌的燒杯中，用保鮮膜密閉燒杯，保持一定濕度，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察。

1.2.3 病原鑒定

1.2.3.1形態(tài)特征觀察 （1）菌落形態(tài)觀察將分離獲得的紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌株在PDA培養(yǎng)基平板活化培養(yǎng)5 d，在菌落邊緣利用打孔器制作菌餅（φ = 5 mm），將菌餅置于PDA平板中央，每個(gè)平板置1塊菌餅，28 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培養(yǎng)5 d，觀察記錄菌落特征。

（2）菌株分生孢子、附著胞及產(chǎn)孢特征顯微觀察將分離獲得菌株接種到PDA平板上，28 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培養(yǎng)5 d，以無(wú)菌水為浮載劑，挑取培養(yǎng)基上的小粒點(diǎn)，用蓋玻片輕輕壓碎，在蓋玻片上滴香柏油，封住蓋玻片四周，室溫下放置24 h，利用Nikon50i顯微鏡（Nikon Eclipse 50i，日本）觀察分生孢子、附著胞、產(chǎn)孢梗以及產(chǎn)孢細(xì)胞形態(tài)，利用QImaging 照相系統(tǒng)（QImaging加拿大）拍照，利用cellSens軟件測(cè)量分生孢子、附著胞大小。

1.2.3.2菌株DNA提取及保守基因序列的擴(kuò)增與測(cè)序分析DNA提取采用改進(jìn)的CTAB法[24]。選擇的目的基因分別為核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）、肌動(dòng)蛋白基因（）、幾丁質(zhì)合成酶A基因（）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（）、β-微管蛋白基因（）和鈣調(diào)蛋白基因（）進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序。試驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1，反應(yīng)體系：25 μL，包括Taq酶mix 12.5 μL，上游引物下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA模板2 μL。PCR產(chǎn)物由上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

將各個(gè)菌株的ITS、、、、和基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，基因編號(hào)見(jiàn)表2。將獲得的各個(gè)序列在Q-bank（www.q-bank.eu）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。選取44株菌株，其中（MAFF 305972）作為外圍菌株。利用MEGA 7.0中的Clustal W對(duì)各基因序列進(jìn)行比對(duì)，將校正后的各基因利用Fasta alignment joiner軟件（http://users-birc.au.dk/biopv/php/fabox/alignment_joiner.php#）以首尾相連的方法合并（--1--ITS--），利用MEGA7.0軟件采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以自展法（Bootstrap）進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán)1000次。

1.2.4 紅肉蘋(píng)果炭疽病菌生長(zhǎng)適應(yīng)性測(cè)定分別設(shè)置不同培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基、PMA培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基CMA、PSA培養(yǎng)基、燕麥片培養(yǎng)基OA、沙氏培養(yǎng)基SDA和馬丁氏培養(yǎng)基Martin）、不同溫度（5 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、不同pH（5、6、7、8、9、10）、不同光照條件（12 h日光燈交替照射、日光燈24 h持續(xù)照射、連續(xù)黑暗）等處理，接種生長(zhǎng)一致的紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌餅（φ = 9 mm），28 ℃培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)試驗(yàn)處理重復(fù)3次，平行測(cè)定4次。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物及反應(yīng)程序

表2 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的參考菌株序列

粗體表示的是模式菌株，*表示的是研究菌株 Ex-type strains or authentic cultures are in bold. * Strains collected in this study

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析利用Spss 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，差異顯著性分析采用Duncan多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅肉蘋(píng)果炭疽病癥狀

主要危害果實(shí)，發(fā)病初期，病斑圓形、淺褐色、邊緣清晰，斑點(diǎn)周?chē)袝r(shí)會(huì)有紅色圓圈。后病斑逐漸擴(kuò)大，病斑中央凹陷，產(chǎn)生輪紋狀排列的黑色小粒點(diǎn)（分生孢子盤(pán)），在分生孢子盤(pán)上產(chǎn)生粉紅色或橘紅色粘性物質(zhì)（分生孢子）。病害后期，病斑擴(kuò)大至半個(gè)果面（圖1），造成果實(shí)早落，或在掛在樹(shù)枝上成為僵果。

圖1 紅肉蘋(píng)果炭疽病田間癥狀

2.2 分離菌株致病性

接種分離菌菌餅的果實(shí)和葉片，5 d后均表現(xiàn)出炭疽病癥狀（圖2），發(fā)病率為100％，對(duì)照未表現(xiàn)出癥狀。果實(shí)上病斑圓形或近圓形，中央凹陷，黑色小粒點(diǎn)輪紋狀排列，產(chǎn)生橘紅色粘質(zhì)孢子堆（圖2a）。葉片上病斑擴(kuò)展受葉脈限制，病部有小黑點(diǎn)產(chǎn)生，溢出橘紅色粘質(zhì)孢子堆（圖2b）。癥狀均與田間紅肉蘋(píng)果植株發(fā)病癥狀一致，并且從接種的果實(shí)、葉片的病斑上分離到的菌株與原來(lái)接種菌株形態(tài)特征一致。表明，分離到的菌株為紅肉蘋(píng)果炭疽病的病原菌。

圖2 致病性試驗(yàn)

(a)果實(shí)接種后病斑 Necrotic lesion on red-fleshed apple fruits; (b) 葉片接種后病斑 Necrotic lesion on red-fleshed apple leaves

2.3 紅肉蘋(píng)果炭疽病菌形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上最初為白色，隨后在接種點(diǎn)附近產(chǎn)生分生孢子盤(pán)及橘紅色分生孢子堆。氣生菌絲白色，棉絮狀，濃密（圖3a）。分生孢子盤(pán)黑色或者褐色，圓形或不規(guī)則圖形，無(wú)剛毛。分生孢子梗透明、有隔膜、無(wú)分枝（圖3b）。分生孢子為單細(xì)胞、無(wú)色、光滑、圓柱形或橢圓形（圖3d），大小為16.7±1.5×6.1±0.9 μm，=50，長(zhǎng)寬比為2.9。附著胞側(cè)生或頂生，卵圓形或橢圓形（圖3c），大小為9.2±1.6×8.0±1.8 μm (=20)。菌株形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀符合復(fù)合種的特征描述。

圖3 紅肉蘋(píng)果炭疽病菌形態(tài)特征

(a) 菌落形態(tài)，(b) 分生孢子盤(pán)，分生孢子梗，產(chǎn)孢細(xì)胞，(c) 附著胞，(d) 分生孢子

(a) Cultural characters. (b) Acervulus, conidiophores, and conidiogenous cell. (c) Appressoria. (d) Conidia Bars=50 μm

2.4 紅肉蘋(píng)果炭疽病菌多基因序列分析

將獲得的11株菌株（JNTW11、JNTW12、JNTW13、JNTW14、JNTW15、JNTW2、JNTW22、JNTW33、JNTW43、JNTW53、JNTW63）與44株對(duì)比菌株的ITS、、、、、的基因序列，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。所有模式菌株以粗體表示，自展率標(biāo)于節(jié)點(diǎn)處，標(biāo)尺指示為0.02步變化。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)最高對(duì)數(shù)似然值為-8852.79。本試驗(yàn)獲得的11株菌株與聚在一個(gè)分支上，自展率為93%，結(jié)合分離菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀，本試驗(yàn)獲得菌株為。

2.5 紅肉蘋(píng)果炭疽病菌的生長(zhǎng)適應(yīng)性

2.5.1 不同培養(yǎng)基對(duì)紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響由圖5可以看出，培養(yǎng)基不同，紅肉蘋(píng)果炭疽病菌（菌株JNTW33、JNTW11、JNTW2）菌絲生長(zhǎng)狀況不同。菌株JNTW11在SDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，菌絲生長(zhǎng)速率為1.67 ± 0.84 cm/d，在<0.01水平上具有顯著性差異。CMA培養(yǎng)基不適宜菌株JNTW11生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速率僅為0.99 ± 0.09 cm/d。菌株JNTW33和JNTW2最適的培養(yǎng)基為PSA、SDA培養(yǎng)基，在CMA、Martin及OA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差。

圖4 利用最大似然法基于紅肉蘋(píng)果炭疽病菌ITS、GAPDH、ACT、CHS-1、TUB2和CAL的基因數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5.2 溫度對(duì)紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響圖6結(jié)果表明，紅肉蘋(píng)果炭疽病菌在溫度低于5 ℃或高于35 ℃的環(huán)境中受到抑制，生長(zhǎng)緩慢。適宜菌株生長(zhǎng)的溫度為30 ℃。

圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖6 不同溫度對(duì)紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5.3 pH對(duì)紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響適宜紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的pH值范圍較廣，在pH 5.0 - 10的范圍內(nèi)菌絲均能正常生長(zhǎng)。不同菌株對(duì)酸堿度的適應(yīng)性不同，在pH 5.0 - 10之間，pH值對(duì)菌株JNTW33、JNTW2菌絲生長(zhǎng)無(wú)顯著性影響；而對(duì)JNTW11菌株菌絲生長(zhǎng)具有顯著性影響，生長(zhǎng)速度在0.01水平上具有顯著性差異（圖7）。

2.5.4 光照條件對(duì)紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響圖8結(jié)果表明，光照對(duì)3株紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)速度的影響趨勢(shì)一致。與持續(xù)黑暗相比，持續(xù)光照或12 h交替照射條件下更適宜3株菌株生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速度在< 0.01水平上具有顯著性差異。

圖7 不同pH對(duì)紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖8 光照對(duì)紅肉蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

紅肉蘋(píng)果富含有機(jī)酸、蘋(píng)果酸、多酚類(lèi)物質(zhì)（綠原酸、原兒茶酸、花青苷、根皮苷等）、三萜類(lèi)物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠有效防止人體細(xì)胞、組織或器官因氧化應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致的氧化損傷，具有多種保健功能，因而具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。紅肉蘋(píng)果正處于選育、引種階段，尚未大面積種植，但在一些種質(zhì)園，紅肉蘋(píng)果炭疽病發(fā)生較重，嚴(yán)重影響紅肉蘋(píng)果的推廣利用。為有效控制炭疽病的危害，明確病原種類(lèi)是十分必要的。

炭疽菌屬真菌1790年首次發(fā)現(xiàn)，直到1831年Corda才首次建立炭疽菌屬。炭疽菌屬真菌具有豐富的種群多樣性，其形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、致病力以及遺傳變異較大，有些近似種之間差異微小，而且有時(shí)會(huì)有多種炭疽菌同時(shí)存在同一寄主的現(xiàn)象。所以?xún)H僅根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、寄主范圍以及ITS序列進(jìn)行鑒定，結(jié)果可能并不準(zhǔn)確。隨著形態(tài)學(xué)、致病性以及多基因的系統(tǒng)分析等綜合方法的應(yīng)用，一些炭疽菌新種不斷被發(fā)現(xiàn)，一些原來(lái)的種被廢棄。本研究利用形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS、、、、和等多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了引起紅肉蘋(píng)果炭疽病的病原菌為暹羅炭疽菌（）。

目前，蘋(píng)果屬下已接受的種62個(gè)。已有的文獻(xiàn)報(bào)道炭疽菌危害的有，，，和。危害的炭疽菌有,,,,,,,,,,,[9,12,16,21]；危害的炭疽菌有，,,,,,[12,17,25,26]；危害的炭疽菌有[27]；危害的炭疽菌有s.l.[28]；危害的炭疽菌有，[29]。本文是首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道侵染危害。

暹羅炭疽菌在泰國(guó)咖啡上首次發(fā)現(xiàn)，引起咖啡炭疽病[30]。暹羅炭疽菌寄主和分布范圍比較廣，在非洲、美洲、大洋洲、亞洲均有分布[31-34]。最新的研究報(bào)道，暹羅炭疽菌可以侵染危害番木瓜、圓形薯蕷、subsp.、草莓、杧果、刺果番荔枝、葡萄、桃、越桔、聚果榕、臺(tái)灣青棗、柑橘、油茶、黃麻、樟樹(shù)、蜘蛛蘭、蘭科植物、楊桃、毛白楊、草珊瑚、核桃、油桐、香港四照花、德保蘇鐵、金茶花、滴水觀音、茉莉花、椰子、黛粉葉、桂花、番石榴、紫荊花、洋蔥、印楝、石榴、紅蟬花、菠蘿蜜、枇杷、無(wú)花果、薄荷、鱷梨、胡椒、開(kāi)心果、迷迭香、可可等多種植物。本研究首次發(fā)現(xiàn)暹羅炭疽菌侵染紅肉蘋(píng)果引起炭疽病，紅肉蘋(píng)果是其新寄主。目前，對(duì)暹羅炭疽菌的研究?jī)H限于種名的鑒定，有關(guān)生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、流行學(xué)、種群遺傳結(jié)構(gòu)和有效的防治措施有待進(jìn)一步研究。

弄清紅肉蘋(píng)果炭疽病菌的生物學(xué)特性是研究該病的重要基礎(chǔ)。本試驗(yàn)選取了3個(gè)代表性菌株（JNTW11、JNTW2以及JNTW33）進(jìn)行了生長(zhǎng)適應(yīng)性研究。在不同培養(yǎng)基上3株菌生長(zhǎng)速率略有不同。適宜的培養(yǎng)基為SDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基，適宜的溫度為25～30 ℃。菌株在pH 5.0～10.0范圍內(nèi)能夠正常生長(zhǎng)，適應(yīng)的pH值范圍較廣。不同菌株對(duì)酸堿度的適應(yīng)性不同，JNTW33和JNTW2菌株在pH 5.0～10.0之間菌絲生長(zhǎng)速率在0.01水平上無(wú)顯著性差異，pH值對(duì)JNTW11菌株的菌絲生長(zhǎng)影響較大，不同pH值下的菌落直徑在<0.01水平上具有顯著性差異，其中弱堿性環(huán)境更適宜菌絲生長(zhǎng)。光照條件對(duì)3株菌株菌絲生長(zhǎng)速率的影響具有一致性，黑暗條件不利于菌絲生長(zhǎng)。病害的發(fā)生程度與菌株生物學(xué)特性密切相關(guān)。光照有利于菌絲生長(zhǎng)，是否有更利于發(fā)病，還需要林間進(jìn)一步調(diào)查研究。本研究結(jié)果明確了紅肉蘋(píng)果炭疽病的病原種類(lèi)，弄清了其生長(zhǎng)適應(yīng)性，研究結(jié)果為預(yù)測(cè)病害發(fā)生和有效控制提供了基礎(chǔ)的理論依據(jù)。

[1] Cannon PF, Damm U, Johnston PR,.-current status and future directions [J]. Stud Mycol, 2012,73:181-213

[2] Damm U, Baroncelli R, Cai L,.: species, ecology and interactions [J]. IMA fungus, 2010,1(2):161-165

[3] Honger JO, Offei SK, Oduro KA,. Identification and molecular characterisation ofspecies from avocado, citrus and pawpaw in Ghana [J]. S Afr J Plant Soil, 2016,33(3):177-185

[4] Dean R, Van Kan JA, Pretorius ZA,. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology [J]. Mol Plant Pathol, 2012,13(4):414-430

[5] Velho A, Stadnik MJ, Casanova L,. First report ofcausing apple bitter rot in southern Brazil [J]. Plant Dis, 2014,98(4):567

[6] Kim CH, Hassan O, Chang T. Diversity, pathogenicity, and fungicide sensitivity ofspecies associated with apple anthracnose in South Korea [J]. Plant Dis, 2020,104(11):2866-2874

[7] Moreira RR, Peres NA, May De Mio LL.andspecies complexes associated with apple in Brazil [J]. Plant Dis, 2019,103(2):268-275

[8] Munir M, Amsden B, Dixon E,. Characterization ofspecies causing bitter rot of apple in Kentucky orchards [J]. Plant Dis, 2016,100(11):2194-2203

[9] Kim C, Hassan O, Lee D,. First report of anthracnose of apple caused byin Korea [J]. Plant Dis, 2018,102(12):2653

[10] Yokosawa S, Eguchi N, Kondo K-i,. Phylogenetic relationship and fungicide sensitivity of members of thespecies complex from apple [J]. J. Gen. Plant Pathol, 2017,83(5):291-298

[11] Fu DD, Wang W, Qin RF,., first record of bitter rot of apple in China [J]. Mycotaxon, 2014,126(1):23-30

[12] Grammen A, Wenneker M, Van Campenhout J,. Identification and pathogenicity assessment ofisolates causing bitter rot of apple fruit in Belgium [J]. Eur. J. Plant Pathol, 2019,153(1):47-63

[13] Nodet P, Baroncelli R, Faugère D,. First report of apple bitter rot caused byin Brittany, France [J]. Plant Dis, 2016,100(7):1497

[14] Munda A. First report ofandcausing apple bitter rot in Slovenia [J]. Plant Dis, 2014,98(9):1282

[15] Víchová J, Staňková B, Pokorny R. First report ofon tomato and apple fruits in the Czech Republic [J]. Plant Dis, 2012,96(5):769

[16] Everett K, Pushparajah I, Timudo O,. Infection criteria, inoculum sources and splash dispersal pattern ofcausing bitter rot of apple in New Zealand [J]. Eur. J. Plant Pathol, 2018,152(2):367-383

[17] Alaniz S, Hernandez L, Damasco D,. First report ofandcausing bitter rot of apple in Uruguay [J]. Plant Dis, 2012,96(3):458

[18] Velho A, Stadnik M, Casanova L,. First report ofcausing Glomerella leaf spot on apple in Santa Catarina State, Brazil [J]. Plant Dis, 2014,98(1):157

[19] Stensvand A, B?rve J. Sources of inoculum forin cherry and apple [J]. IOBC/WPRS Bulletin, 2010,54:65-67

[20] Khodadadi F, González JB, Martin PL,. Identification and characterization ofspecies causing apple bitter rot in New York and description ofsp. Nov [J]. Sci. Rep, 2020,10(1):1-19

[21] Baroncelli R, Sreenivasaprasad S, Thon MR,. First report of apple bitter rot caused byin the United Kingdom [J]. Plant Dis, 2014,98(7):1000

[22] Wang N, Xu J, Zhao X,. First report of Glomerella leaf spot of apple caused by[J]. Plant Dis, 2020,104(10):2734

[23] 符丹丹.中國(guó)蘋(píng)果炭疽病病原菌的遺傳多樣性[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2014:66-87

[24] Wang QH, Fan K, Li DW,. Identification, virulence and fungicide sensitivity ofs.s. responsible for walnut anthracnose disease in China [J]. Plant Dis, 2020,104:1358-1368

[25] Nodet P, Chalopin M, Crete X,. First report ofcausing apple bitter rot in Europe [J]. Plant Dis, 2019,103(7):1767-1768

[26] Pavlovi? ?, Santander R, Meredith C,. First report ofcausing bitter rot on Asian pear () and common pear () in New York, USA [J]. Plant Dis, 2019,103(5):1032

[27] Cheon W, Kim Y, Jeon Y. First report of anthracnose caused byonin Korea [J]. Plant Dis, 2012,96(5):766

[28] Choi O, Seo J, Kwon JH,Anthracnose caused byon sweet crabapple in Korea [J]. Plant Pathol J, 2011,27(4):396

[29] Damm U, Cannon PF, Woudenberg JHC,. Thespecies complex [J]. Stud Mycol, 2012,73:37-113

[30] Prihastuti H, Cai L, Chen H,. Characterization ofspecies associated with coffee berries in northern Thailand [J]. Fungal Divers, 2009,39(1):89-109

[31] Larrán S, Bahima JV, Dal Bello G, Franco E,.causing anthracnose insubsp.in Argentina [J]. Australas. Plant Dis. Notes, 2015,10(1):1-2

[32] Hu MJ, Grabke A, Schnabel G. Investigation of thespecies complex causing peach anthracnose in South Carolina [J]. Plant Dis, 2015,99(6):797-805

[33] Wang QH, Fan K, Li DW,. Walnut anthracnose caused byin China [J]. Australas Plant Pathol, 2017,46(6):585-595

[34] Prasannath K, Galea V, Akinsanmi O. Characterisation of leaf spots caused byandin macadamia in Australia [J]. Eur. J. Plant Pathol, 2020,156(4):1219-1225

Identification and Characterization offrom Anthracnose Disease of Red-fleshed Apple and Adapation

LIU Zai-zhe1,2, GE Lei3, JI Yan-ping2, ZHANG Yu-tong4, ZHAO Tao5, QI Yu-kun2, ZHANG Yu-jiao1, WANG Qing-hai2*

1.250014,2.250014,3.250102,4.350108,5.271027,

Red-fleshed apple anthracnose is a disastrous disease caused bysp. occurred in red-fleshed apple orchards and germplasm gardens, and result in yield losses. So far, the pathogen and its characterization was largely unknown. It is necessary to identify accurately and characterize the pathogen responsible for red-fleshed apple in order to provide further information on effective means of controlling the disease. To verify the etiology of anthracnose on red-fleshed apple using multilocus phylogenetic analyses and morphological characteristics. To determine the effect of culture medium, temperature, pH, and light condition on hyphal growth rate using growth rate method. The results showed that 11 similar single-sporeisolates were obtained from the diseased fruits, and all single-spore isolates could cause the similar anthracnose symptoms. The pathogen of red-fleshed apple anthracnose was identified asbased on six-gene phylogenetic analyses (ribosomal DNA-ITS,,,,, and) and morphological as well as cultural characters.JNTW11, JNTW02, and JNTW33 isolates preferred PSA and SDA culture medium. The optimum condition for growth was 25°C to 30°C, pH value 8.0-10.0, and continuous light or alternate light condition. This is the first report ofas a causal agent of anthracnose of red-fleshed apple, andwas the new host plant toin the world.

pathogen identification; biology

S436.65

A

1000-2324(2021)05-0713-10

2021-10-09

2021-10-12

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題;山東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2019LY003-4)

劉在哲(1969-),男,高級(jí)工程師,主要從事林木病理學(xué)研究. E-mail:liuzaizhe1969@126.com

通訊作者:Author for correspondence.E-mail:wqhhai@126.com