唐鮮娥，何一多，陳穎，夏德堯，覃曉莉，趙方毓，王鳳杰，陳顯兵*

1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院病理科(湖北 恩施 445000)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)是由脊柱骨折或脫位引起的脊髓或馬尾神經(jīng)的損傷。我國(guó)SCI患者超過100萬，患病人數(shù)逐年遞增，感覺運(yùn)動(dòng)功能的完全或部分消失嚴(yán)重影響SCI患者的生活質(zhì)量和生存壽命[1]。目前臨床尚無特效藥，主要包括手術(shù)減壓和穩(wěn)定、神經(jīng)保護(hù)藥物等治療[2]。研究表明[3]SCI繼發(fā)性損傷時(shí)期的病理生理變化可促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，搶救損傷邊緣區(qū)域的神經(jīng)元對(duì)于神經(jīng)功能修復(fù)至關(guān)重要，神經(jīng)元凋亡成為SCI的重要發(fā)病機(jī)制之一。延齡草苷(Trillium Tschonoskii Maxim,TTM)具有抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、清除氧自由基等功效，可通過上調(diào)脊髓組織中的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體-α(CNTFR-α)對(duì)SCI起保護(hù)作用[4]。然而延齡草苷對(duì)過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株(PC12)細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用以及其潛在機(jī)制尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，觀察TTM是否對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，并初步探討TTM是否通過抑制凋亡從而減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，揭示TTM是否具有作為SCI治療的潛力。

1 材料與方法

1.1試劑TTM(CAS No.14144-6-0,Bellancom)訂購(gòu)于北京環(huán)球材料有限公司，高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)測(cè)定其純度大于98%，用二甲亞砜(DMSO)溶解TTM形成80 mmol/L的儲(chǔ)備溶液于-20°C保存，使用前將原液稀釋至所需濃度。MTT試劑盒、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio(索萊寶,中國(guó)北京)，Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3一抗購(gòu)自賽信通(上海)生物試劑有限公司，二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)大鼠PC12購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)武漢)。正常對(duì)照組的PC12細(xì)胞不做任何處理。H2O2損傷組以300 μmol/L H2O2處理細(xì)胞15 min，再換成普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，H2O2+TTM(6.25 μmol/L)、H2O2+TTM(12.50 μmol/L)組、H2O2+TTM(25.00 μmol/L)組分別用300 μmol/L H2O2預(yù)處理細(xì)胞15 min后，換成相應(yīng)濃度梯度的TTM處理細(xì)胞24 h。細(xì)胞培養(yǎng)基選用DMEM，加入10%滅活胎牛血清(FBS)、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(0.1 mg/mL)，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力將PC12細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)約為10 000個(gè)，加DMEM并于37℃孵育，使用不同濃度梯度的H2O2(0、50、100、200、300或400 μmol/L)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，MTT法測(cè)定細(xì)胞活力以確定最佳劑量的H2O2。24 h后在DMEM培養(yǎng)基中加入濃度梯度的TTM(0、6.25、12.50、25.00 μmol/L)并孵育24 h。每孔加入20 L 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后每孔加入DMSO充分溶解MTT結(jié)晶甲瓚。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo Scientific,Multiskan Go,Waltham,MA,USA)OD490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，通過對(duì)照孔測(cè)得的信號(hào)百分比表示細(xì)胞活力。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。凋亡早期的PC12細(xì)胞使用熒光素FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V)染色，使用PI染色觀察凋亡中晚期的細(xì)胞和死亡細(xì)胞。在細(xì)胞懸浮液(100 μL)中加入5 μL的Annexin-V，再加入5 μL的PI，4 ℃下避光反應(yīng)15 min后，細(xì)胞懸液中加入400 μL緩沖液，1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)(FACScalibur,Becton Dickinson,美國(guó)加利福尼亞州圣何塞)，以細(xì)胞總數(shù)的百分比表示凋亡細(xì)胞的比例。

1.5蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡分析PC12細(xì)胞處理后棄去培養(yǎng)基，用蛋白質(zhì)提取試劑盒(Beyotime,中國(guó)上海)提取蛋白質(zhì)，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃變性5 min。提取蛋白定量后按照30 μg蛋白量上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(8%分離膠、5%濃縮膠)，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，用5%封閉液(脫脂奶粉5 g+TBST100 mL)在室溫封閉1 h。加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光(ECL)顯色后利用AlphaView SA軟件中的Analysis Tools-Multiplex Band Anaysisregion、選取測(cè)定的蛋白條帶，使用軟件ImageJ進(jìn)行半定量分析。內(nèi)參為β-actin。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力及凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)與正常對(duì)照組比較，H2O2的濃度為300 μmol/L時(shí)PC12細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，而濃度為50 μmol/L時(shí)PC12細(xì)胞未出現(xiàn)明顯損傷(圖1A)。相較于正常對(duì)照組，H2O2損傷組凋亡細(xì)胞的百分比顯著增高(P<0.01，圖1B)，H2O2損傷組晚期凋亡細(xì)胞比例與正常對(duì)照組相比，從4.34%上升到6.06%。Western blot結(jié)果顯示，H2O2損傷組Bcl-2的表達(dá)水平降低(P<0.01)，Bax和Cleaved-caspase3的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05；P<0.01)(圖1C)。

注：A. MTT測(cè)定細(xì)胞活力；B.流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)試凋亡細(xì)胞的百分比；C.蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；與正常對(duì)照組比較，*:P<0.05，**:P<0.01。圖1 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力降低及細(xì)胞凋亡增強(qiáng)

2.2 TTM對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力及凋亡相關(guān)蛋白的影響如圖2A所示，相較于H2O2處理組，TTM濃度為12.50 μmol/L時(shí)能夠顯著提高細(xì)胞活力(P<0.01)，且凋亡細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.01)(圖2B)，H2O2+TTM(12.50 μmol/L)組晚期凋亡細(xì)胞比例與H2O2處理組相比，從17.2%下降到5.13%。Western blot結(jié)果顯示，H2O2+TTM(12.50 μmol/L)組Bcl-2的顯著升高(P<0.01)，Bax和C-caspase-3的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01；P<0.05)(圖2C)。

注：A. MTT測(cè)定細(xì)胞活力；B.流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)試凋亡細(xì)胞的百分比；C.蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；與正常對(duì)照組比較，*:P<0.05，**:P<0.01；與H2O2損傷組比較，#:P<0.05,##:P<0.01。圖2 TTM抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡

3 討論

臨床上SCI主要表現(xiàn)為損傷平面以下部位的運(yùn)動(dòng)和感覺功能障礙。在全球范圍內(nèi)SCI的發(fā)病率、致殘率呈逐年增高趨勢(shì)，為社會(huì)、家庭帶來巨大負(fù)擔(dān)。發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，而TTM可逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞凋亡，TTM對(duì)損傷PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制尚不清楚。

急性SCI機(jī)制復(fù)雜，由瞬間機(jī)械力導(dǎo)致的原發(fā)性損傷可引起神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能發(fā)生不可逆損傷，而于原發(fā)性損傷之后發(fā)生的繼發(fā)性損傷對(duì)人體具有更大的危害性[1]，凋亡在急性SCI中起著重要作用，氧化應(yīng)激可能通過引起脂質(zhì)過氧化、改變蛋白和DNA氧化/氧化還原的狀態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5]。其他所涉及的機(jī)制包括脂質(zhì)過氧化、自由基損傷、氨基酸毒性作用、血管痙攣、鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞水腫、電解質(zhì)失調(diào)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞調(diào)亡，以及損傷后基因表達(dá)的改變等。本研究中使用300 μmol/L H2O2作用PC12細(xì)胞可顯著降低其細(xì)胞活力，提高凋亡中晚期凋亡細(xì)胞的百分，因此本次實(shí)驗(yàn)中H2O2作用于PC12細(xì)胞的最終濃度為300 μmol/L，H2O2可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。

凋亡與包括SCI在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，而抑制神經(jīng)元凋亡在SCI治療中擁有較廣泛的前景[6-9]。Bcl-2蛋白家族控制的內(nèi)在細(xì)胞死亡通路是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的主要方式之一[10]，包括抗凋亡成員Bcl-2、Bcl-X(L)和促凋亡成員Bax、Bak、Bad，通過激活調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3，從而進(jìn)行大規(guī)模蛋白水解導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。本研究表明，H2O2作用于PC12細(xì)胞后其細(xì)胞凋亡百分比顯著增高，促凋亡蛋白Bax與Cleaved-caspase3表達(dá)水平上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2低表達(dá)，提示H2O2誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞凋亡。過去的研究顯示[12]，在SCI大鼠損傷脊髓組織中，神經(jīng)元的凋亡水平顯著升高，由Nrf2/ARE通路介導(dǎo)的體內(nèi)氧化應(yīng)激參與了SCI大鼠神經(jīng)元的損傷。以上研究結(jié)果提示，凋亡參與了SCI發(fā)生發(fā)展，通過調(diào)控凋亡的水平有機(jī)會(huì)搶救損傷邊緣的神經(jīng)元，從而改善SCI患者的預(yù)后。

頭頂一顆珠(TTM)又名延齡草，主要化學(xué)成分以皂苷為主包括甾體皂苷、黃酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷，具有免疫調(diào)節(jié)、清除氧自由基DPPH、抑制脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，改善心功能和降壓、抗衰老等功效。本研究中，H2O2可誘導(dǎo)PC12凋亡，而TTM可顯著提高H2O2作用后的PC12細(xì)胞活力，降低凋亡細(xì)胞百分比。另外，從蛋白水平上證實(shí)了TTM可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，下調(diào)促凋亡蛋白Bax以及C-caspase-3，然而TTM通過抗凋亡改善神經(jīng)元損傷的具體機(jī)制尚不十分清楚。有研究顯示，TTM可以提高抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)、改善SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。提取液還可通過提高損傷心肌中的SOD、GPx活性和降低MDA含量，抑制糖尿病大鼠心肌損傷中的心肌細(xì)胞凋亡[13]。另外TTM在上調(diào)脊髓組織中CNTF和其受體表達(dá)的同時(shí)，還顯著降低損傷脊髓組織中的SOD及ROS的產(chǎn)生，抑制凋亡，通過Nrf2/ARE途徑抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)損傷脊髓中的神經(jīng)元細(xì)胞[12]，TTM在遭受SCI的大鼠中具有神經(jīng)保護(hù)功效[14]。有研究顯示[4,14-15]TTM對(duì)SCI大鼠的保護(hù)作用與nBax和caspase-3表達(dá)的降低有關(guān)。以上結(jié)果說明，TTM能夠抑制H2O2誘導(dǎo)PC12胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，減輕H2O2毒性，這可能與觀察到的Bcl-2表達(dá)上調(diào)和裂解的caspase-3上調(diào)相關(guān)，分析其原因可能是由于SCI發(fā)生后，導(dǎo)致PC12細(xì)胞內(nèi)ROS積聚、MDA的產(chǎn)生，降低SOD、GSH-Px活力，胞質(zhì)中Nrf2與Keap1所形成復(fù)合體被破壞，Nrf2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)與ARE序列結(jié)合，促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)氧化應(yīng)激活化Nrf2/ARE通路，Bcl-2蛋白家族控制的內(nèi)在細(xì)胞死亡通路。TTM對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這一保護(hù)作用可能通過抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。

通過本研究驗(yàn)證了TTM對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷起保護(hù)作用，TTM有望成為SCI的潛在治療藥物，為尋找SCI的潛在治療靶點(diǎn)提供了依據(jù)，然而TTM抑制凋亡保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞損傷的具體分子通路及藥物作用靶點(diǎn)尚待進(jìn)一步研究。