林珊宇，朱桂寧*，賢小勇，韋小妹，黎柳鋒，李慈代，韋名壯， 韋愛娜，韋 藝，黃明金，韋橋現，廖仁昭

(1.廣西農業(yè)科學院植物保護研究所/廣西作物病蟲害生物學重點實驗室，廣西 南寧 530007；2.鳳山縣核桃科研開發(fā)中心，廣西 鳳山 547600；3.天峨縣林業(yè)局，廣西 天峨 547300；4.東蘭縣林業(yè)局，廣西 東蘭 547400；5.河池市核桃研究所，廣西 河池 547000；6.南丹縣核桃產業(yè)發(fā)展中心，廣西 南丹 547200)

【研究意義】核桃又稱胡桃，隸屬于胡桃科(Juglandaceae)，包括核桃屬(Juglans)和山核桃屬(Carya)等，為落葉喬木或稀灌木，與腰果、榛子和扁桃并稱為世界四大干果，已在世界各地廣泛種植。核桃具有抗旱和耐瘠特點，可適應多種土壤，在石縫等惡劣環(huán)境中也可良好生長，是一種重要的“木本糧油”生態(tài)樹種[1-5]。桂西北河池市的石漠化地區(qū)地處滇桂黔石漠化連片貧困區(qū)的核心區(qū)域，存在水土流失嚴重、土地生產力低下、群眾生活貧困及生態(tài)環(huán)境惡劣等問題，尋求科學合理的生態(tài)修復與經濟發(fā)展最佳結合模式，對解決石漠化問題、推動當地經濟發(fā)展及改善貧困農戶的生活水平十分重要[2，6]。經過十多年的培育和實踐，廣西的核桃產業(yè)不僅有效解決了大石地區(qū)石漠化綜合治理難題，還成為促進群眾脫貧增收的重要途徑，經濟、社會和生態(tài)綜合效益良好[1-2]。2017年，廣西核桃種植面積約21.33萬hm2，主要分布在河池市、百色市、賀州市和柳州市的21個縣(區(qū))。其中，河池市巴馬縣和鳳山縣的核桃種植面積最大，達16.00萬hm2，占廣西核桃種植總面積的70%以上；河池市2017年已可采收的核桃面積有4666.67 hm2，產值達1億元。因此，核桃已逐步成為河池市石漠化地區(qū)生態(tài)修復和實施精準扶貧的重要產業(yè)之一[5，7]。隨著廣西核桃種植面積的不斷擴大，其產業(yè)發(fā)展也面臨病蟲危害日趨嚴重的嚴峻問題。因此，開展廣西石漠化地區(qū)核桃病害發(fā)生情況調查，明確核桃病害的種類并鑒定其病原菌，對指導精準有效地防控核桃病害及促進廣西核桃產業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】據報道，侵染核桃的病害有20多種。曲文文等[8]調查發(fā)現，山東核桃的主要病害為炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)、褐色頂端壞死病(Alternariasp.，Pantoeaagglomerans)和潰瘍病(Fusariumsolani，Botryosphaeriaribis)等。趙玉美等[9]開展云南核桃病害調查，發(fā)現核桃枝干上的真菌有24屬28種，包含干腐病(B.dothidea、Macrophomamacrospora)、枝枯病(Melanconisjuglandis、Phomajuglandis等)和枯梢病(Phomopsisjuglandina、P.arnoldia、Selenophomasp.)等。張知曉等[10]研究表明，云南核桃果實的主要病害有炭疽病、果腐病[B.dothidea(無性態(tài)為Dothiorellagregaria)，Pestalosphaeriajuglandis(無性態(tài)為Pestalotiopsisdisseminata)]、枯果病(Fusicoccumsp.)和黑斑病(Xanthomonascampestrispv.Juglandis，P.agglomerans)，病原菌分屬于17屬17種。楊文淵等[11]研究顯示，西藏核桃的主要病害有枝枯病[Melanconiumjuglandis(無性態(tài)為M.juglandinum)]、細菌性黑斑病(X.campestrispv.Juglandis)、褐斑病[Gnomonialeptostyla(無性態(tài)為Marssoninajuglandis)]和腐爛病(Cytcosporajuglandicola)。任志勇等[12]研究報道，甘肅省隴南核桃的病害有細菌性黑斑病、褐斑病、炭疽病、灰斑病(Phyllostictajuglandis)、白粉病(Microsphaeraakebiae)、粉霉病(Microstromajuglandis)、膏藥病(Septobasidiumbogoriense)、潰瘍病、枝枯病、干腐病(Physalosporajuglandis)和腐爛病，病原有1種細菌和10種真菌。楊霞等[13]研究發(fā)現，貴州正安縣核桃的主要病害有黑斑病、炭疽病、膏藥病、潰瘍病和枝枯病。Zhu等[14]研究認為，引起廣西核桃葉斑病的是C.fioriniae。汪筱雪等[15]研究表明，廣西核桃病害有根腐病(F.solani)、胡桃楸擬莖點霉(P.juglandina)引起的枝枯病、莖點霉黑斑病(Phomasp.)和炭疽病。韋林[16]研究顯示，石漠化地區(qū)核桃病害以黑斑病、腐爛病和枯枝病等為主。梁鐘方[17]研究報道，石漠化地區(qū)核桃病害有白粉病、褐斑病、黑斑病和炭疽病。真菌的rDNA-ITS序列為中度保守區(qū)，其進化速率較快，已廣泛應用于真菌的分類鑒定[8，15，18]，通過測定分析病原菌的rDNA-ITS序列可區(qū)分傳統上真菌的有些特征受不同培養(yǎng)條件影響而存在的差異，以及產孢結構與孢子形態(tài)間的細微特征。【本研究切入點】廣西核桃種植區(qū)橫跨南亞熱帶和中亞熱帶，常年光照充足，氣候溫暖，雨量充沛，各種農林作物病蟲害發(fā)生頻繁，為害嚴重[7，19-20]。但目前鮮見針對廣西核桃病害進行調查和病原鑒定的系統性研究報道?！緮M解決的關鍵問題】在廣西河池市的鳳山縣、東蘭縣、巴馬縣、天峨縣、南丹縣、環(huán)江縣和金城江區(qū)等石漠化地區(qū)調查核桃病害的發(fā)生情況，分離其病原菌，并通過形態(tài)學特性觀察、結合部分病菌的rDNA-ITS序列測定分析，以及接種確定其致病性，鑒定主要病害的病原菌，以明確廣西石漠化地區(qū)核桃的主要病害種類，為其綜合防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病害標本采集 2018—2019年，分別在廣西河池市鳳山縣、東蘭縣、巴馬縣、天峨縣、南丹縣、環(huán)江縣和金城江區(qū)等石漠化地區(qū)的核桃主要種植區(qū)，采集當地主要種植的核桃品種娘青、三臺核桃、鳳優(yōu)1號、云南漾濞大泡、云新進而香玲及美國山核桃的病葉、病枝條、病果、病樹干和病根標本，分別裝入自封塑料袋中帶回實驗室，記錄病害發(fā)生情況、病害癥狀及特征，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基選擇 參考張知曉等[10]的方法，以PDA培養(yǎng)基為分離病原菌的培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，加入去離子水，定容至1000 mL后分裝，進行常規(guī)滅菌備用；分離真菌時，將PDA培養(yǎng)基溶化后冷卻至約50 ℃，加入氨芐青霉素使其最終濃度為50 μg/mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 病害標本切片制作及觀察鑒定 對采集的新鮮病害標本，如已有明顯病征，則先進行拍照和文字描述，然后取病征明顯的部位制作標本切片，于奧林巴斯BX53光學顯微鏡下觀察病原菌(子實體、菌絲、產孢梗和分生孢子等)的形態(tài)特征，記錄其在核桃組織上的位置、形狀和顏色，必要時測量孢子的大小，查閱相關文獻，進行種類鑒定；如病害標本病征尚不明顯，則將標本放入干凈培養(yǎng)皿中，置于室溫(25～28 ℃)下進行保濕培養(yǎng)，待標本出現明顯病征后再進行切片制作和病原菌觀察鑒定。

1.2.2 病原菌分離培養(yǎng)和純化 采用組織分離法對病害標本進行病原菌分離。剪取新鮮病害標本病健交界處約5 mm×5 mm的組織塊，用75%酒精浸泡40～50 s進行表面消毒后取出，立即用ddH2O沖洗3次，置于滅菌吸水紙中吸去多余水分，晾干后將組織塊轉入PDA培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待組織上長出菌落后，切取菌落邊緣約5 mm×5 mm的菌絲塊轉入新的PDA培養(yǎng)基中進行病菌純化。如有分生孢子產生，則采用單孢分離法純化菌株。所得菌株均轉接到PDB培養(yǎng)基中，加入適量甘油后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 病原菌致病性測定 于室內對果實(青果)進行離體接種；于網室對葉片、枝條和根進行活體接種。操作步驟：先用75%酒精對健康核桃葉片、果實或枝條進行表面消毒，再用ddH2O沖洗3次，自然晾干；用滅菌接種針在核桃葉片、果實、枝條或根上待接種部位刺6個針孔，每個針孔距離約2 mm，待測病原菌預先在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5～7 d，接種時用滅菌打孔器從菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊，菌絲面朝下接種至核桃葉片、果實、枝條或根的傷口上，每種菌株接種重復3次，每次接種葉片、果實、枝條或根3張/個/條，同時設無傷口處理為對照。果實離體接種后放入保鮮盒中，蓋上蓋子置于室溫下保濕；葉片、枝條或根接種后，將滅菌脫脂棉用ddH2O蘸濕敷在接種好的菌絲塊上，然后套上保鮮袋保濕2 d，定期觀察發(fā)病情況，出現病征后，取發(fā)病組織再次分離病原菌，觀察再分離獲得菌株的形態(tài)特征是否與原來接種菌株相同。

1.2.4 病原菌形態(tài)學鑒定 將經純化的病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察病原菌菌落的生長狀況(生長速度、形狀、大小和顏色等)，并在奧林巴斯BX53光學顯微鏡下觀察、描述病原菌菌絲和孢子等的特征，查閱相關文獻，進行病原菌種類鑒定。

1.2.5 病原菌rDNA-ITS序列測定 從PDA培養(yǎng)基上刮取生長約7 d的待測病原菌菌絲，參考Zhu等[21]的方法進行病原菌基因組DNA提取。利用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)進行病原菌的rDNA-ITS序列PCR擴增。PCR反應體系50 μL：DNA模板2 μL，2×EsTaqMasterMix 25 μL，引物ITS4(10 μmol/L)和 ITS5(10 μmol/L)各2 μL，ddH2O 19 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將合格的PCR擴增產物送至廣州擎科生物技術有限公司進行單向測序。測序獲得的結果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov網站上進行BLAST比對。根據ITS序列比對結果，結合形態(tài)特征進行病原菌鑒定，明確其分類地位。

2 結果與分析

2.1 廣西石漠化地區(qū)核桃病害種類調查結果

調查結果(表1)表明，廣西河池市鳳山縣、東蘭縣、巴馬縣、天峨縣、南丹縣、環(huán)江縣和金城江區(qū)等石漠化地區(qū)核桃的病害有：炭疽病(Anthracnose)、黑斑病(Blact spot)、枯枝病(Branch dieback)、潰瘍病(Canker)、根腐病(Root rot)和白粉病(Powdery mildew)。其中，核桃炭疽病發(fā)病普遍，危害嚴重，發(fā)病嚴重的果園大面積落果，葉片提早脫落，個別果園核桃絕收；黑斑病和枯枝病發(fā)生程度中等，在各縣(區(qū))主要核桃種植區(qū)均有發(fā)生，但危害程度較炭疽病輕；潰瘍病雖然在各縣(區(qū))都有發(fā)生，但僅在套種有玉米和桑樹的果園發(fā)生較多，其他果園僅零星發(fā)生；根腐病僅在天峨縣、金城江區(qū)、環(huán)江縣和鳳山縣的個別核桃種植區(qū)發(fā)生，且發(fā)病均較輕；白粉病僅在鳳山縣核桃果園發(fā)生。說明核桃炭疽病是廣西石漠化地區(qū)核桃的最主要病害，其次是黑斑病和枯枝病。

表1 廣西石漠化地區(qū)核桃病害調查結果

2.2 廣西石漠化地區(qū)核桃病害的癥狀和病原鑒定結果

2.2.1 核桃炭疽病 發(fā)病癥狀：核桃炭疽病可為害核桃的葉片、芽、嫩梢和果實。病菌侵入葉片后，初期形成圓形小斑，隨后病斑擴大，呈圓形或不規(guī)則形，在葉脈處則常呈長條形，有時可從葉片邊緣向內部發(fā)展呈焦枯狀；病斑褐色至黑色，有時在病斑邊緣有黃色暈圈，后期病斑可在中間呈灰白色并可形成穿孔，發(fā)病嚴重時可造成葉片大量脫落；果實上的病斑初期為褐色小斑，后擴大逐漸變成黑色，病斑圓形或近圓形，中央凹陷，發(fā)病嚴重的果實全果發(fā)黑腐爛，造成果實早落；芽和嫩梢染病，病斑黑褐色至黑色，呈不規(guī)則形或長條形，中央凹陷，芽和嫩梢逐漸從頂端向下回枯；葉片、果實和嫩梢上的病斑均可擴展連接成片，后期病斑上可產生小黑點，濕度大時小黑點上可溢出橘紅色分生孢子團(圖1-A、圖1-B和圖1-C)。

病原菌分離及致病性測定：從各核桃主要種植區(qū)采集的炭疽病標本上分離獲得HT02、HT05、SHT1和SHT2共4株菌株，將其分別接種核桃葉片、果實、芽和嫩梢，均可引起炭疽病癥狀，再分離獲的菌株的形態(tài)特征與接種菌株一致。

病原菌的形態(tài)特征：將采回的核桃炭疽病標本在室溫下保濕3～5 d，病斑上即產生并溢出橘紅色分生孢子團。挑取分生孢子團在顯微鏡下觀察，可見分生孢子為單胞，無色，圓柱形或長橢圓形，大部分孢子兩端鈍圓，少數孢子的一端略尖，大小為(11.72±2.10)μm×(5.51±0.19)μm(圖1-F)。分離到的HT02、HT05、SHT1和SHT2菌株在28 ℃下PDA培養(yǎng)基上的菌落為圓形，菌絲放射狀，菌落初為白色，后從中央開始逐漸變成灰白色、淺灰色、灰綠色或墨綠色，菌絲密集，4個菌株的顏色變化略有不同。培養(yǎng)后期，在菌落上出現橘紅色分生孢子堆，呈點狀散布于菌絲上，分生孢子的形狀、大小與標本上的一致。未發(fā)現子囊孢子。

A～C：葉片癥狀；D～E：果實癥狀；F：病菌的分生孢子 A-C：Symptoms on leaves；D-E：Symptoms on fruits；F：Conidia圖1 核桃炭疽病的癥狀和病原菌形態(tài)特征Fig.1 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut anthracnose

A～B：自然發(fā)病癥狀；C：HT12菌株回接葉梗上的癥狀；D：病菌的分生孢子 A-B：Symptoms in field；C：Symptom on stalk inoculated by HT12；D：Conidia圖2 核桃黑斑病的癥狀和病原菌形態(tài)特征Fig.2 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut black spot

rDNA-ITS序列測定結果：對HT02、HT05、SHT1和SHT2菌株rDNA-ITS序列的PCR產物進行測序，獲得的序列與NCBI發(fā)表的GenBank進行BLAST比對(登錄號分別為MZ905367、MZ905368、MZ905365和MZ905366)，結果發(fā)現其與登錄號為KM044006.1、HM989909.1和MG832459.1等20多個膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)rDNA-ITS序列的相似度均在99%以上。根據HT02、HT05、SHT1和SHT2菌株的形態(tài)特征及BLAST比對結果，將分離菌株鑒定為膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)。

2.2.2 核桃黑斑病 發(fā)病癥狀：核桃黑斑病主要發(fā)生在青果期，危害果實的青皮，也可危害葉片和嫩枝梢，嚴重時可造成落果和枝梢回枯。果實開始發(fā)病時在青果皮上出現褐色斑點，逐漸擴大為近圓形或不規(guī)則形，病斑黑色，有時凹陷，果實由外果皮向內腐爛，發(fā)病嚴重的果實易脫落。葉片發(fā)病初期病斑為圓形黑色小點，逐漸擴大為3～5 mm的圓形或近圓形病斑，后期病斑可形成穿孔，嚴重時葉片提早脫落。嫩枝梢上的病斑為圓形或長橢圓形，黑褐色，梢凹陷，病斑環(huán)繞枝梢后，易造成枝梢干裂和回枯(圖 2-A和圖2-B)。

病原菌分離及致病性測定：從病處分離得到優(yōu)勢菌株HT12，將HT12菌株接種到核桃的葉片、果實和嫩枝梢上，均可引起黑斑病癥狀，再分離獲得菌株的形態(tài)特征與接種HT12菌株的形態(tài)特征一致，確定HT12為核桃黑斑病病原菌。

病原菌的形態(tài)特征：HT12菌株在28 ℃下PDA培養(yǎng)基上的菌落為圓形，邊緣整齊，初為淺褐色，后變成褐色、深褐色；病菌的分生孢子黃褐色，倒棍棒狀，有喙，具有橫、縱分隔膜，主橫隔膜數為1～6個，縱隔膜數為0～3個，孢子大小為(22.32±5.41)μm×(6.91±1.33)μm(圖2-D)。因此，將HT12鑒定為鏈格孢菌(Alternariasp.)。

2.2.3 核桃枯枝病 發(fā)病癥狀：核桃枯枝病主要為害小枝，尤其是1年生的嫩枝梢，導致枝梢枯死。發(fā)病初期，頂梢幼嫩枝條的受害部位如芽、葉片和莖部出現水浸狀褪綠病斑，后病斑擴大呈淺褐色至黑褐色，向枝端擴展，后期病部失水凹陷，變?yōu)槊黠@的深褐色至黑色病斑，最后病部干縮，枝條枯死，枝條上的葉片逐漸變黃脫落，有時病死枯枝上密生紅褐色至黑色的子實體，直徑0.2～0.3 mm，為病原菌的分生孢子器(圖3-A、圖3-B和圖3-C)。

病原菌分離及致病性測定：從核桃枯枝病的發(fā)病部位進行組織分離，得到3株優(yōu)勢菌株：HT03、HT04和HT10。將HT03、HT04和HT10菌株接種到核桃的枝條上均可引起枝枯病癥狀。其中，HT03和HT10菌株有傷口和無傷口接種均可引起發(fā)病，而HT04菌株僅有傷口接種引起發(fā)病。從發(fā)病部位再分離得到的菌株分別與接種的HT03、HT04和HT10菌株的形態(tài)特征一致。因此，確定HT03、HT04和HT10菌株均為核桃枯枝病病原菌。

病原菌的形態(tài)特征：HT03菌株在28 ℃下PDA培養(yǎng)基上的菌落為圓形，初為白色，較稀疏，生長約3 d可長出茂密的毛氈狀白色氣生菌絲，菌落較厚，長滿平板時菌落可形成3～4個明顯的同心輪紋，后期菌落顏色變?yōu)闇\褐色，有黑色、堅硬的顆粒狀物(直徑1～2 mm)埋生其中，為病菌的分生孢子器，菌落背面灰白色(圖3-F)；病菌有兩種不同形態(tài)的分生孢子，其中，α型分生孢子單孢、無色，紡錘形或長橢圓形，大小為(8.95±3.45)μm×(3.15±0.10)μm，β型分生孢子單孢、無色，線狀，直或一端稍彎，大小為(25.80±8.20)μm×(25.80×1.00)μm。HT04菌株在28 ℃下PDA培養(yǎng)基上的菌落初為白色，菌絲呈絲絨狀，氣生菌絲不發(fā)達，后菌落逐漸變?yōu)榉奂t色、玫瑰色，有3圈黃白色與玫瑰色相交替的同心輪紋，菌落背面產生玫瑰色色素，具與正面相同的同心輪紋；培養(yǎng)3 d后于菌落表面出現粉狀物，為病菌的小型分生孢子，培養(yǎng)5～6 d時于菌落表面長出數個黃色油狀的黏質團，為病菌的大型分生孢子堆；病菌的小型分生孢子卵形或橢圓形，鏈狀著生，無隔膜，大小為(6.41±0.38)μm×(3.08±0.49)μm，大型分生孢子呈長鐮刀形，聚生，6～8隔，孢子尖端及足細胞彎曲，大小為(60.93±3.15)μm×(5.73±0.74)μm(圖3-H)。根據HT04菌株分生孢子的形狀，初步判定其為鐮刀菌屬真菌。HT10菌株在28 ℃下PDA培養(yǎng)基上生長較快，菌落初為白色，菌絲棉絮狀或絨毛狀，氣生菌絲茂盛，后菌落逐漸變?yōu)樽霞t色，菌落中央產生淺駝色至黃褐色菌絲，菌落背面有紫紅色色素產生(圖3-I)；病原菌缺乏小型分生孢子，大型分生孢子呈鐮刀形或紡錘形，有1～3個隔，多數為3個隔，大小為(30.85±11.55)μm×(4.85±0.35)μm，頂細胞錐形，逐漸變窄，略彎曲，有時呈黃褐色(圖2-J)。根據HT10菌株的分生孢子形狀，初步判定其為鐮刀菌屬真菌。

A～C：自然發(fā)病癥狀；D：HT04菌株回接嫩梢的癥狀；E：HT10菌株回接葉梗的癥狀；F：HT03菌株的菌落；G：HT04菌株的菌落；H：HT04菌株的分生孢子；I：HT10菌株的菌落；J：HT10菌株的分生孢子 A-C：Symptoms in field；D：Symptom on twig inoculated by HT04；E：Symptom on stalk inoculated by HT10；F：Colony of HT03；G：Colony of HT04；H：Conidia of HT04；I：Colony of HT10；J：Conidia of HT10圖3 核桃枯枝病的癥狀和病原菌形態(tài)特征Fig.3 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut branch dieback

rDNA-ITS序列測定結果：對HT03、HT04和HT10菌株rDNA-ITS序列的PCR產物進行測序，獲得的序列與NCBI發(fā)表的GenBank進行BLAST比對(登錄號分別為MZ905165、MZ882156和MZ905171)，結果發(fā)現，HT03菌株的rDNA-ITS序列與登錄號為KU837233.1的胡桃楸擬莖點霉(Phomopsisjuglandina)、登錄號為MW228357.1、MN636327.1和MK398676.1等20多個間座殼屬(Diaporthesp.，擬莖點霉的有性態(tài))的同源序列相似度在99%以上；HT04菌株的rDNA-ITS序列與登錄號為KM231809.1、HM054147.1和MH864595.1等10多個多隔鐮刀菌(Fusariumdecemcellulare)的同源序列相似度在98%以上；HT10菌株的rDNA-ITS序列與登錄號為MT228970.1、KP003943.1和MK079937.1等20多個禾谷鐮刀菌(F.graminearum)同源序列的相似度在99%以上。根據形態(tài)特征和rDNA-ITS序列測定結果，將HT03菌株鑒定為胡桃楸擬莖點霉(P.juglandina)，HT04菌株鑒定為多隔鐮刀菌(F.decemcellulare)，HT10菌株鑒定為禾谷鐮刀菌(F.graminearum)。

2.2.4 核桃潰瘍病 發(fā)病癥狀：核桃潰瘍病主要為害核桃樹干及主側枝基部，通常發(fā)生在基部至基部以上1.0 m處。發(fā)病初期在樹皮表面出現紅褐色至紫褐色的近圓形病斑，病斑逐漸擴展呈不規(guī)則的長條形，濕度大時病斑可形成水泡，水泡破裂后有褐色粘液滲出，病斑下部及周圍呈水漬狀，病斑失水后干枯，中央為黑褐色，四周為淺褐色，病健交界處不明顯；后期病斑上散生很多小黑點，為病菌的分生孢子器；切開樹皮，可見發(fā)病部位呈褐色至黑褐色壞死，病健交界處明顯；嚴重發(fā)病的樹干，病斑相連可造成樹皮大面積潰爛、開裂，病斑環(huán)繞樹干，導致整個側枝甚至全株枯萎(圖4-A、圖4-B、圖4-C)。

病原菌分離及致病性測定：從發(fā)病部位分離到1株優(yōu)勢菌株HT21。將HT21菌株接種到核桃苗枝條基部可引起潰瘍病癥狀，再分離獲得菌株的形態(tài)特征與接種菌株一致，因此，確定HT21菌株為核桃潰瘍病病原菌。

病原菌的形態(tài)特征：HT21菌株在28 ℃下PDA培養(yǎng)基上生長較快，3～4 d可布滿整個培養(yǎng)基平板，菌落初為白色，后逐漸變黑色，氣生菌絲發(fā)達，通常生成菌絲束(圖4-D)；分生孢子無色，單胞，透明，梭形或近長橢圓形，兩端梢尖或鈍圓，內有油球狀物，孢子大小為 (22.15±5.13)μm×(6.62±0.49)μm，與群生小穴殼(Dothiorellagregaria，無性態(tài))的形狀相似(圖4-E)。

A～C：癥狀；D：HT21菌株的菌落；E：HT21菌株的分生孢子 A-C：Symptoms；D：Colony of HT21；E：Conidia of HT21圖4 核桃潰瘍病的癥狀和病原菌形態(tài)特征Fig.4 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut canker

rDNA-ITS序列測定結果：對HT21菌株rDNA-ITS序列的PCR產物進行測序，獲得的序列與NCBI發(fā)表的GenBank進行BLAST比對(登錄號為MZ906610)，結果表明，HT21菌株的rDNA-ITS序列與登錄號為LC317472.1、KC492477.1和KC492466.1等30多個葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)ITS序列的相似度在99%以上 。根據病菌的形態(tài)特征、BLAST比對結果，參考趙玉美等[9]、Chen等[22]的描述，將核桃潰瘍病病原菌HT21菌株鑒定為葡萄座腔菌(B.dothidea，有性態(tài))，其無性態(tài)為群生小穴殼(D.gregaria)。

2.2.5 核桃根腐病 發(fā)病癥狀：核桃根腐病為害核桃根部，造成根部腐爛。發(fā)病初期，病株的葉片出現類似缺水的癥狀，中期葉片退綠、黃化、卷曲、萎蔫，枝條不發(fā)芽，植株生長不良，最后整個植株枯死。發(fā)病早期挖開植株根部，可見部分側根發(fā)黑腐爛，植株地上同一側的相應部位枝葉長勢弱，發(fā)病嚴重的植株，整個根系發(fā)黑腐爛?？v剖發(fā)病植株根莖部，可見木質部有褐變癥狀(圖5-A、圖5-B和圖5-C)。

病原菌分離及致病性測定：從病部分離得到2株優(yōu)勢菌株HT23和HT26。將這2株菌株接種核桃小苗的根部，可引起核桃小苗根腐，小苗枯死；再分離可獲得同樣的菌株，因此，確定HT23和HT26菌株為核桃根腐病的病原菌。

病原菌的形態(tài)特征：HT23菌株在28 ℃下PDA培養(yǎng)基上的菌落圓形，菌絲初期白色，后黃褐色，氣生菌絲少；病原菌有大、小兩種分生孢子，其中，小型分生孢子為卵形，多數無隔，少數1個隔，大小為(9.87±2.23)μm×(6.82±1.03)μm，大型分生孢子為鐮刀形，具1～3個分隔，大小為(32.08±6.04)μm×(4.55±0.98)μm。HT26菌株在28 ℃下PDA培養(yǎng)基上的菌落圓形，菌絲初期呈白色，棉絮狀，后呈淡青蓮色(圖5-D)；病原菌有大、小兩種分生孢子，其中，小型分生孢子數量多，長橢圓形或卵形，多數無隔，少數1個隔，大小為(6.10±1.01)μm×(2.96±0.46)μm，而大型分生孢子數量很少，鐮刀形，具2～3個分隔，多數3個分隔，大小為(24.34±3.56)μm×(3.12±0.25)μm(圖5-E)。

rDNA-ITS序列測定結果：對HT23和HT26菌株rDNA-ITS序列的PCR產物進行測序，獲得的序列與NCBI發(fā)表的GenBank進行BLAST比對(登錄號分別為MZ905375和MZ905374)，結果表明，HT23菌株的rDNA-ITS序列與腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)(登錄號分別為MT107069.1、KP326582.1和MG489960.1)ITS序列的相似度在99%以上；HT26菌株的rDNA-ITS序列與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)(登錄號分別為MK590412.1、MK966308.1、MK910069.1)ITS序列的相似度在99%以上。根據病菌的形態(tài)特征和BLAST比對結果，參考相關文獻，將HT23菌株鑒定為腐皮鐮刀菌(F.solani)，將HT26菌株鑒定為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。

2.2.6 核桃白粉病 發(fā)病癥狀：核桃白粉病主要為害核桃葉片。受害葉片正面出現邊緣不清晰的退綠黃斑，葉片背面覆蓋一層明顯的白粉層，此為病菌的分生孢子、分生孢子梗和菌絲；在秋季，白粉層上產生黃白色至黑褐色的小顆粒狀閉囊殼，屬病原菌的有性階段(圖6-A和圖6-B)。

A～C：癥狀；D：HT26的菌落；E：HT26的大、小分生孢子 A-C：Symptoms；D：Colony of HT26；E：Conidia of HT26圖5 核桃根腐病的癥狀和病原菌形態(tài)特征Fig.5 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut root rot

A～B：葉片背面/正面癥狀；C～D：病原菌的分生孢子 A-B：Symptom on the abaxial/adaxial surface of leaf；C-D：Conidia of pathogens圖6 核桃白粉病的病葉和病原菌形態(tài)特征Fig.6 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut powdery mildew

病原菌的形態(tài)特征：病原菌的分生孢子梗從病斑上外生的菌絲垂直向上生長，單條，微彎曲，無色，內具0～3個隔，頂端單個著生分生孢子；分生孢子呈瓜子形，無色，單胞，表面粗糙，頂部具明顯的乳突，大小為(9.80±1.75)μm×(4.58±0.52)μm(圖6-C和圖6-D)；閉囊殼球形，黑褐色，附屬絲呈球針狀。根據病害的癥狀和病菌的形態(tài)特征，將核桃白粉病的病原鑒定為胡桃球針殼(Phyllactiniajuglandis)，無性態(tài)為擬卵孢屬(Ovulariopsis)。

3 討 論

汪筱雪等[15]鑒定發(fā)現，廣西西北部核桃病害主要有腐皮鐮刀菌引起的根腐病、胡桃楸擬莖點霉引起的枝枯病、莖點霉引起的黑斑病和膠孢炭疽菌引起的炭疽病4種。而本研究調查和鑒定結果表明，廣西石漠化地區(qū)核桃主要病害有6種，其中，除未分離到莖點霉黑斑病外，另外3種與汪筱雪等[15]鑒定發(fā)現的病害相同；還鑒定到鏈格孢菌引起的黑斑病、多隔鐮刀菌和禾谷鐮刀菌引起的枝枯病、葡萄座腔菌引起的潰瘍病、尖孢鐮刀菌引起的根腐病及胡桃球針殼引起的白粉病。可見，廣西石漠化地區(qū)的核桃病害種類較多，一些病害如枝枯病和根腐病還存在多種病原菌混合侵染現象。

本研究分離到的核桃枝枯病病原菌除胡桃楸擬莖點霉外，還首次分離到多隔鐮刀菌和禾谷鐮刀菌，而國內報道引起核桃枝枯病的病原菌還有矩圓黑盤孢菌(Melanconiumoblongum)、辣椒擬莖點霉(P.capsici)和新殼梭抱(Neofusicoccumparvum)等[23-25]，說明在廣西石漠化地區(qū)特定的地形、地域和氣候環(huán)境等條件下，引起枝枯病的病原菌與其他地方存在一定差異。本研究觀察發(fā)現，腐皮鐮刀菌根腐病主要發(fā)生在排水不良、核桃植株易受水淹的核桃園，而尖孢鐮刀菌根腐病在排水良好的核桃果園中也有發(fā)生；從核桃根腐病病根中分離到腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌2種病原菌，與汪筱雪等[15]對廣西金城江區(qū)、鳳山縣和樂業(yè)縣及胡云飛和郭新峰[26]對安徽省寧國市及宋嘉偉[27]對杭州市臨安山核桃的研究結果一致，說明腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌也是引起廣西石漠化地區(qū)核桃根腐病的病原菌之一。已有報道表明，引起核桃白粉病的病原菌有核桃叉絲殼菌(Microsphaerajuglandis或M.yamadai)和胡桃球針殼[28-29]，但曲文文等[8]、楊克強等[29]報道引起核桃白粉的病菌僅有核桃叉絲殼1種，而本研究鏡檢發(fā)現，引起廣西鳳山縣核桃白粉病的病原菌為胡桃球針殼，無性態(tài)為擬卵孢屬，與曲文文等[8]、楊克強等[29]的研究結果不一致，說明廣西石漠化地區(qū)核桃白粉病的病原菌與其他地區(qū)存在一定差異。張知曉等[10]、汪筱雪等[15]、Fernandes等[30]、肖波等[31]研究認為，核桃黑斑病是多種病菌復合侵染的結果，其病原菌有核桃黃單胞桿菌(Xanthomonascampestrispv.Juglandis)、莖點霉、成團泛菌(Pantoeaagglomerrans)和鏈格孢菌，但本研究僅分離到核桃黑斑病的1種病原菌，即鏈格孢菌，可能與開展研究的地域及病害采集時間不同有關。

本研究觀察還發(fā)現，不同核桃品種對不同病害的抗感性差異較明顯，如娘青、三臺核桃和鳳優(yōu)1號較抗炭疽病，而云新和香玲高感炭疽病。后續(xù)應進行石漠化地區(qū)核桃品種抗病性評價，為廣西石漠化地區(qū)合理引種優(yōu)良核桃品種提供科學依據。

4 結 論

廣西石漠化地區(qū)核桃主要病害有膠孢炭疽菌引起的炭疽病，鏈格孢菌引起的黑斑病，胡桃楸擬莖點霉、多隔鐮刀菌和禾谷鐮刀菌引起的枝枯病，葡萄座腔菌引起的潰瘍病，腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌引起的根腐病，胡桃球針殼引起的白粉病。其中，多隔鐮刀菌與禾谷鐮刀菌引起的核桃枝枯病為首次發(fā)現。在這些病害中，發(fā)生最嚴重的是炭疽病，其次是黑斑病和枯枝病，生產上需進行重點防控；其他病害總體上發(fā)生較輕，但在局部地區(qū)發(fā)生嚴重時也需進行防控。

致 謝：鳳山縣核桃科研開發(fā)中心張清毅、蘇方貴、梁鐘方和羅琛，河池市核桃研究所謝代祖和韋林，天峨縣林業(yè)局劉玲和羅智輝，南丹縣核桃產業(yè)發(fā)展中心劉順和和黃敏，東蘭縣林業(yè)局韋錦山和韋蘭，廣西農業(yè)科學院植物保護研究所廖世純、王鳳英和覃武參加了部分調查工作，在此一并致謝!