張鴨關，趙紅艷，徐 玲，李夢麗

(1.曲靖師范學院化學與環(huán)境科學學院，云南 曲靖 655011；2.保山學院高黎貢山生物資源研究所，云南 保山 678000；3.宣威市第十中學，云南 宣威 655400)

【研究意義】全世界每年大概有500萬人被癌癥奪去生命。在一系列致癌物中，目前最強的致癌物之一就是N-亞硝胺(NDMA)，它可以使人體和動物多種器官病變成惡性腫瘤，特別是肝癌、胃癌及食道癌，其致癌機理是亞硝胺形成的前驅體亞硝酸鹽和胺在人體和動物的胃液環(huán)境下，可迅速進行亞硝化反應生成亞硝胺化合物[1-2]。在一系列酶的作用下，亞硝胺產(chǎn)生可使核酸烷化的親電子烷基自由基，可使細胞遺傳突變從而顯示致癌性。因此，清除人體內(nèi)合成亞硝胺的前體物質亞硝酸鹽或阻斷亞硝胺在人體內(nèi)的合成是防癌抗癌的有效途徑[1-2]。【前人研究進展】許多天然活性成分如還原糖、谷胱甘肽、VC、VE、有機硫化物及茶多酚等都具有清除亞硝酸鹽、抑制N-亞硝胺合成的功效。這些天然活性成分廣泛存在于蔬菜、水果和藥用植物中。有研究表明，許多植物提取液都能有效抑制亞硝胺在人體內(nèi)合成，如吳茱萸、甘草、紅豆多肽、荸薺皮、杜仲、原花青素、簕菜茶、牡荊、銀杏葉、鵝絨藤、黃花菜等[2-11]。小黑藥(InulanervosaWall.)為傘形科草本植物，是一種藥食兼用的野生藥用植物資源，自身具有特異的辛香氣味，根、莖、葉皆可入味入藥，其根、莖葉可以像蔬菜一樣烹飪[12]。研究表明小黑藥含有豐富的香豆素、三萜類糖和皂苷、氨基酸、維生素C、維生素E等生理活性物質[13-14]。民間常用小黑藥治療肺結核、腎虛腰痛、頭暈等許多疾病，長期服用還可增強機體抵抗力[12]?！颈狙芯壳腥朦c】當前，如何清除人體內(nèi)合成亞硝胺的前體物質亞硝酸鹽或阻斷N-亞硝胺在人體內(nèi)合成，已成為國內(nèi)外研究學者普遍關注的問題。迄今為止，關于小黑藥對亞硝化反應的抑制作用或清除致癌的前體物亞硝酸鹽的研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】在體外模擬人體胃液的條件下，通過紫外分光光度法研究小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽的清除和亞硝胺的阻斷作用，探究提取時間、固液比、溫度和濃度對亞硝化反應的抑制作用的影響，并確定最佳提取條件，以期為篩選并開發(fā)安全、高效的亞硝化反應抑制劑和防癌抗癌天然功能食品，以及為小黑藥的進一步開發(fā)與利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小黑藥于2018年11月采自云南省沾益區(qū)，將采集到的小黑藥清洗干凈，將其莖葉與根分開，恒溫干燥箱中于105 ℃烘干，粉碎過40目篩后，置于干燥器中備用，于2019年5月開始試驗。

主要試劑：蒸餾水；去離子水；亞硝酸鈉(AR)；二甲胺溶液(AR)；碳酸鈉(AR)；無水乙醇(AR)；對氨基苯磺酸(AR)；α-萘胺(AR)；N-1一萘乙二胺鹽酸鹽(AR)；檸檬酸鈉(AR)，鹽酸(AR)；二甲胺(AR)。

主要儀器：分析天平(美國奧豪斯公司生產(chǎn))；恒水浴溫震蕩器(常州國華電器有限公司生產(chǎn))；離心機(上海安亭科學儀器廠生產(chǎn))；紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司生產(chǎn))；循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司生產(chǎn))；數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司生產(chǎn))；暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠生產(chǎn))。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗 以乙醇為浸提劑，研究在不同條件下，小黑藥莖葉提取液亞硝酸鹽清除率的變化趨勢。試驗初始條件設置為浸提溫度25 ℃，浸提時間0.5 h，浸提劑濃度為25%，固液比為1∶10，單因素試驗的試驗水平設置見表1。

1.2.2 正交試驗 為系統(tǒng)考察小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽清除的最佳提取條件，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗設計選擇最優(yōu)條件，以浸提時間、浸提溫度、浸提劑濃度、固液比作為考察因素。以提取液對亞硝酸鹽清除率作為考察指標，選用L9(34) 正交試驗(表2)。

表1 單因素試驗水平設置

表2 正交實驗因素水平設置

1.2.3 優(yōu)化實驗 對正交實驗結果進行極差分析，從而確定理論最佳浸提工藝條件，再通過優(yōu)化實驗進一步驗證理論最佳浸提工藝條件是否與優(yōu)化實驗結果相一致，從而獲得小黑藥莖葉提取液的最佳浸提條件。

1.2.4 亞硝酸鹽清除率的測定原理 通過對亞硝酸鹽和氨基苯磺酸進行重氮化反應，然后用N-1萘乙二胺鹽酸鹽合成紅色化合物。在弱酸性的條件下，取小黑藥提取液2.0 mL于25 mL比色管中，加入pH 3.0的緩沖液12.5 mL及NaNO2溶液(100 mg/kg)2.5 mL，最后用蒸餾水定容至25 mL，在37 ℃條件下恒溫加熱2.0 h，用移液器移取1.0 mL樣液于小試管中，再往小試管中加入質量分數(shù)為0.4%對氨基苯磺酸溶液2.0 mL，以及質量分數(shù)為0.2%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液2.0 mL，搖勻后放置15 min，用紫外-可見分光光度計測定吸光度，測定波長為540 nm，用相應濃度相應用量的提取劑作對照試驗，清除率計算公式：

清除率(%)=(A0-Ax)/A0×100

(1)

其中，A0：空白對照實驗的吸光度；Ax：不同提取液時的吸光度。

1.2.5 N-亞硝胺合成阻斷率的測定 于體外模擬人體胃液的試驗條件，二甲胺與亞硝酸鈉在pH 3.0的緩沖液中，恒溫37 ℃條件下，會生成二甲基亞硝胺(NDMA)物質。

(CH3)2NH + NaNO2→ (CH3)2N-N=O + HCl + H2O

(2)

將二甲胺和亞硝酸鈉加入小黑藥莖葉提取液時，提取液中的活性物質首先與亞硝酸鈉作用，阻斷二甲胺和亞硝酸鹽反應生成亞硝胺。亞硝胺的含量越大，則表明提取液的阻斷率越小，反之則亦強。亞硝胺可以在紫外線下分解:

(3)

圖1 浸提時間對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.1 The effect of extraction time on the scavenging rate of sodium nitrite

對氨基苯磺酸和亞硝酸鹽進行重氮化反應，然后用N-1萘乙二胺鹽酸鹽合成紅色化合物。用分光光度法測定反應液中亞硝胺的含量，確定化合物的吸光度值。在25 mL的比色管中加入5.0 mL提取液，再加入12.5 mL的檸檬酸鈉緩沖液，1.25 mL NaNO2；1.25 mL二甲胺，蒸餾水定容。在37 ℃恒溫1 h，從有1.0 mL反應液體的小管，加入0.5 mL質量分數(shù)為5%的Na2CO3溶液，于紫外分析儀下照射15 min，紫外燈和小試管液面的距離為15 cm，取出后往小試管中加入1.5 mL質量分數(shù)0.1%的對氨基苯磺酸溶液，再加入1.5 mL質量分數(shù)為0.1%的α-萘胺，最后再加0.5 mL蒸餾水，靜置15 min，在525 nm使用分光光度計測量吸光度。同時進行了空白對照實驗。阻斷率的計算公式如下:

阻斷率(%)=(A0-Ax)/A0×100

(4)

其中，A0:未加樣液時的吸光度值(以試劑空白溶液為參比溶液);Ax:加入樣液后的吸光度值(以同濃度樣液為參比溶液)。

2 結果與分析

2.1 提取條件的單因素試驗

2.1.1 浸提時間對亞硝酸鹽清除率的影響 由圖1可知，不同浸提時間小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽的清除率不同。隨著浸提時間的增加，小黑藥浸提液對亞硝酸鹽清除率坡度增加，在反應時間為0.5 h時，清除率僅為59.35%，當提取時間達到3.5 h時，清除率達到最大，達66.33%，隨后繼續(xù)增加時間，清除率又有降低的趨勢。這可能是由于隨著時間的延長，小黑藥莖葉中的某些活性成分可能失去生理活性，使亞硝酸鹽清除率下降。因此，初步確定正交試驗小黑藥莖葉浸提時間為3.0、3.5、4.0 h。

2.1.2 浸提溫度對亞硝酸鹽清除率的影響 由圖2可知，不同浸提溫度下，小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽的清除率不同。隨著提取溫度的升高，小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽清除率呈先增加后降低趨勢，當浸提溫度為25 ℃時，亞硝酸鹽清除率46.19%，當控制水浴溫度為65 ℃時，清除率達到最大為56.78%，隨后有降低的趨勢。這可能是因為隨著提取溫度的升高，反應物分子之間運動更加劇烈，分子之間的碰撞機率迅速增加。但是由于溫度太高，小黑藥活性成分可能會被分解，降低亞硝酸鹽的清除能力。所以，初步確定正交試驗小黑藥莖液提取溫度為55、65、75 ℃。

圖2 浸提溫度對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.2 The effect of temperature on the scavenging rate of sodium nitrite

圖3 浸提劑濃度對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.3 The effect of concentration of extractant on the scavenging rate of sodium nitrite

2.1.3 浸提劑濃度對亞硝酸鹽清除率的影響 由圖3可知，浸提劑濃度不同，小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽的清除率不同。隨著浸提劑的濃度的增加，小黑藥提取液對亞硝酸鹽的清除率呈先增加后降低趨勢。當提取劑濃度為25%時，小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽的清除率為48.26%，當提取劑濃度增加到35%時，清除率達到最大值50.20%，隨著提取劑濃度的進一步升高小黑藥提取液對亞硝酸鹽的清除率持續(xù)降低。因此，初步確定正交試驗小黑藥葉莖提取濃度為25%、35%、45%。

圖4 固液比對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.4 The effect of solid-liquid rate on the scavenging rate of sodium nitrite

2.1.4 固液比對亞硝酸鹽清除率的影響 由圖4可知，固液比不同，小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽的清除率不同。隨著固液比的上升，小黑藥提取液對亞硝酸鹽的清除率呈先增加后降低趨勢。當固液比為1∶10時，小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽的清除率為25.95%，當提取液的固液比增大到1∶20時，清除率達到最大值，為38.04%。隨后隨著固液比的提高，小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽的清除率持續(xù)降低。因此，初步確定正交試驗小黑藥莖葉提取固液比為1∶15、1∶20、1∶25。

2.2 L9(34)正交試驗

由表3可知，考察指標為亞硝酸鈉清除率的時候，小黑藥莖葉的最佳提取因素組合為C2B2A2D1，即用25%的乙醇水溶液，在固液比為1∶20、溫度為65 ℃、提取時間為3.0 h的條件所得的小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鈉的清除效果表現(xiàn)最好。通過極差分析，各因素對實驗結果的影響順序為：溫度﹥固液比﹥時間﹥提取劑濃度，即提取溫度對小黑藥莖葉提取液的亞硝酸鹽清除率影響最大，而提取劑提取濃度影響最小。

表3 正交試驗結果

2.3 優(yōu)化實驗

以正交實驗得出的理論最佳提取因素組合C2B2A2D1為提取條件，進行小黑藥莖葉提取液的提取，進而考察小黑藥提取液清除亞硝酸鹽實際效果，結果表明，在理論最佳提取條件下，小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鹽的清除率為68.26%，其大于正交試驗中的所有清除率。因此，小黑藥莖葉提取液最佳提取條件為C2B2A2D1，即提取時間為3.0 h，固液比為1∶20，溫度為65 ℃，提取劑濃度為25%時最佳。

2.4 不同用量的小黑藥提取液對阻斷亞硝胺(NDMA)生成的影響

在最佳浸提條件(C2B2A2D1) 下獲得的浸提液，研究不同用量的小黑藥莖葉提取液對阻斷亞硝胺生成的影響，結果如圖5所示。由圖5所知，不同用量的小黑藥莖葉提取液對NDMA阻斷率的影響不同，隨著小黑藥莖葉提取液用量的增多，對亞硝胺(NDMA)的阻斷率呈先增加后降低再趨于穩(wěn)定的趨勢。當浸提液用量為2.0 mL時對亞硝胺(NDMA)的阻斷率達到峰值，此時小黑藥莖葉提取液對亞硝胺的阻斷率為85.22%。

由圖5所知，不同用量的小黑藥莖葉提取液對NDMA阻斷率的影響不同，隨著小黑藥莖葉提取液用量的增多，對亞硝胺(NDMA)的阻斷率呈先增加后降低再趨于穩(wěn)定的趨勢。當浸提液用量為2.0 mL時對亞硝胺(NDMA)的阻斷率達到峰值，此時小黑藥莖葉提取液對亞硝胺的阻斷率為85.22%。

3 討 論

許多天然源植物提取物對亞硝酸鹽的清除與亞硝胺合成的阻斷都具有一定的效果。本試驗也表明，模擬人體胃液條件下，小黑藥莖葉乙醇提取液對亞硝酸鹽的清除效果較好，可有效阻斷亞硝胺的合成。在單因素試驗研究中發(fā)現(xiàn)，小黑藥莖葉粗提取液隨著乙醇濃度的升高對亞硝酸鹽清除率呈先升高后降低趨勢，且乙醇濃度為35%時清除率最大。究其原因可能是乙醇滲透能力強，低濃度乙醇進入細胞后使得細胞膜的通透性增加，從而導致胞內(nèi)物質浸出，而當乙醇濃度過高時，細胞表面的蛋白質變性凝固，導致細胞膜的通透性降低，使得胞內(nèi)物質浸出率下降。因此，只有當乙醇與水以一定比例混合時，才能達到最高的提取率。本研究表明，當乙醇濃度為35% 時，萃取的活性成分含量最高，對亞硝酸鹽的清除效果最佳。

圖5 不同用量的小黑藥莖葉提取液的NDMA阻斷率Fig.5 Capabilities of disconnecting NDMA by Inula nervosa wall extracts(under C2B2A2D1 condition)

4 結 論

(1)在體外模擬胃液，即 pH為 3.0，37 ℃的條件下，小黑藥莖葉提取液可有效清除亞硝酸鹽及阻斷NDMA的生成。通過L9(34)正交實驗，經(jīng)極差分析以及優(yōu)化實驗，最終獲得對小黑藥莖葉中活性成分的最佳浸提條件是：浸提劑濃度為25%，固液比為1∶20、溫度為65 ℃，提取時間為3.0 h。此條件所得的小黑藥莖葉提取液對亞硝酸鈉的清除效果最好，為68.25%；當提取液用量為2.0 mL時，對亞硝胺(NDMA)的最大阻斷率達到最大值，為85.22%。

(2)小黑藥作為藥食兩用的野生藥用植物資源，廣泛分布于云南、貴州、廣西等地，人們更多時候是利用其根，而莖葉往往作為廢棄資源丟棄，給小黑藥的利用造成了極大的浪費。試驗表明小黑藥莖葉提取液可有效阻斷NDMA 的合成和清除亞硝酸鹽，本研究為小黑藥作為防癌抗癌功能食品以及進一步開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。