陳春林，田易萍，鄧少春，徐丕忠，仝佳音，尚衛(wèi)瓊

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南 勐海 666201；2.云南省茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新與配套栽培技術(shù)工程研究中心，云南 勐海 666201；3.云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐海 666201)

【研究意義】誘變是一種常規(guī)的農(nóng)作育種方法，包括化學(xué)誘變和物理誘變。誘變具有應(yīng)用方便、誘變后代穩(wěn)定、特異性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物育種領(lǐng)域，目前對(duì)農(nóng)作物誘變后代的多世代篩選、鑒定技術(shù)日益成熟，已經(jīng)培育出具有生產(chǎn)利用價(jià)值的農(nóng)作物新品種，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[1-4]?！白暇辍睂僭颇洗笕~種變種，因其葉、莖、花萼、花梗、茶湯均呈紫色而得名?！白暇辍钡幕ㄇ嗨睾枯^高，達(dá)到29.14 mg/kg，花青素含量遠(yuǎn)高于其他茶樹品種且茶氨酸和兒茶素總量差異也很大[5-9]。大量研究表明，紫娟茶具有降壓、保護(hù)肝臟、提高記憶力、影響脂類代謝及抗氧化等功效。因此，“紫娟”誘變后代的花青素含量具有較高的分析價(jià)值[10-11]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】李謹(jǐn)?shù)萚12]以仙客來干種子為試材，利用“神州八號(hào)”飛船進(jìn)行太空誘變處理，結(jié)果顯示太空誘變對(duì)仙客來植株在花色和花形上與對(duì)照相比表現(xiàn)出明顯的表觀性狀差異，所有的突變株DNA均發(fā)生了變化；姜振峰等[13]用0.04%的化學(xué)誘變劑疊氮化鈉處理大豆，結(jié)果顯示誘變后代有矮化或晚熟現(xiàn)象，植株性狀特征發(fā)生了明顯的變化。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，微衛(wèi)星標(biāo)記在作物遺傳多樣性研究上被廣泛應(yīng)用，謝淑芹等[14]通過NaN3誘變小麥后再利用SSR分析，結(jié)果表明利用NaN3處理種子出苗率高，后代性狀變異類型豐富，變異率高；孔佑涵等[15]人探索NaN3處理柑橘腋芽的誘變效應(yīng)中采用SRAP分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一些新梢變異葉片的基因組DNA發(fā)生了變化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于陳林波等[16-17]前期對(duì)“紫娟”的芽、第二葉、開面葉、成熟葉轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序所得的242 757條Unigene，在確定的44對(duì)EST-SSR引物為數(shù)據(jù)的研究基礎(chǔ)上開展研究，一是通過觀測(cè)“紫娟”誘變后代的植物學(xué)性狀，明確誘變后代的表型特征；二是分析誘變后代的主要生化組分差異，明確誘變后的生化成分變化；三是利用EST-SSR分析誘變后代的多態(tài)性。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過上述研究，從形態(tài)特征、生化組分和分子水平上探討太空和NaN3誘變對(duì)“紫娟”的誘變效果，為將來利用太空和NaN3誘變茶樹育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2020年6月11日在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)基地采集“紫娟”及后代材料的幼嫩葉片及新梢一芽二葉，按相對(duì)穩(wěn)定的工藝技術(shù)制備蒸青樣，并保存于-80 ℃的冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 植物學(xué)性狀觀測(cè) 參照茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，觀測(cè)“紫娟”及其誘變后代植物學(xué)性狀，重點(diǎn)比較葉色、葉片大小、芽葉色澤、一芽三葉百芽重等。

1.2.2 內(nèi)含成分測(cè)定 花青素測(cè)定方法采用分光光度計(jì)法，按照FB/LH 003—2010標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析；水浸出物測(cè)定方法采用分光光度計(jì)法，按照GB/T8305—2013標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析；茶多酚測(cè)定方法采用分光光度計(jì)法，按照GB/T 8313—2018標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析；游離氨基酸測(cè)定方法采用分光光度計(jì)法，按照GB/T 8314—2013標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析；咖啡堿測(cè)定方法采用分光光度計(jì)法，按照GB/T 8312—2013標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)合成 合成引物基本信息見表1。

表1 合成引物基本信息

續(xù)表1 Continued table 1

1.2.4 DNA提取 取100 mg幼嫩葉片加入液氮充分研磨，利用CTAB的方法提取DNA，取2 μL DNA用于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取2 μL DNA用于NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)濃度。

1.2.5 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系10×Buffer I：1.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL，5 μmol/L F/R 0.8 μL，DNA 1.0 μL，ddH2O 15 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，72 ℃30 min，循環(huán)35次。

1.2.6 電泳檢測(cè) 96孔板中每孔加入分子量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9 μL，PCR產(chǎn)物1.0 μL；95 ℃變性3 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到分析軟件genemapper ID 3.2中進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 “紫娟”誘變后代的植物學(xué)性狀

“紫娟”茶的主要特點(diǎn)為紫芽、紫葉、紫莖，從表2可知，有15份材料芽葉色澤與“紫娟”相近，且除ZJ-05、ZJ-06、ZJ-19以外，其余都花青甙顯色，春季一芽三葉百芽重除ZJ-17，夏茶中除ZJ-01、ZJ-02、ZJ-03、ZJ-04外其余均超過“紫娟”；春季一芽二葉百芽重、一芽一葉百芽重均超過“紫娟”，夏茶中一芽二葉百芽重除了ZJ-02、ZJ-03、ZJ-04、ZJ-06和ZJ-17以外，其余均已超過“紫娟”，一芽一葉百芽重比“紫娟”低的有ZJ-02、ZJ-03、ZJ-09、ZJ-17、ZJ-19共5份材料；單芽百芽重中春季有2份材料與“紫娟”相當(dāng)，分別為ZJ-17、ZJ-19，其余的比“紫娟”要高，夏茶有6份材料比“紫娟”低，分別為ZJ-02、ZJ-03、ZJ-07、ZJ-09、ZJ-16、ZJ-17。

表2 “紫娟”及其誘變后代的新梢性狀

由表3可知，各材料成熟葉片的葉形只有ZJ-10和ZJ-11與“紫娟”相同，為披針形，其余的為橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，葉面積最大的為ZJ-01，達(dá)到37.01 cm2，ZJ-03和ZJ-04為小葉，其余的為中葉；葉色與“紫娟”相同的有9份材料，都為紫綠色。

表3 “紫娟”及其誘變后代的葉片性狀

續(xù)表3 Continued table 3

由表4可知，20份材料中花柱的長(zhǎng)度、開裂數(shù)與“紫娟”基本一致，在裂位上，ZJ-02和ZJ-08為中裂，其余的為淺裂。

2.2 “紫娟”誘變后代的生化成分分析

由表5可知，春季花青素含量超過10%的有3份，其中ZJ-12花青素超過“紫娟”；春季水浸出物含量最低的為ZJ-01，最高的的為ZJ-15，超過“紫娟”的共有9份材料；茶多酚含量超過“紫娟”的有10份材料，最高的為ZJ-15、最低的為ZJ-11；游離氨基酸含量最高的為ZJ-11，最低的為ZJ-13，超過“紫娟”的有7份材料；咖啡堿含量超過“紫娟”的材料有6份材料。由表6可知，夏茶花青素含量超過10%的有5份材料，總體上夏茶的花青素含量要高于春茶；夏季水浸出物含量最低的為ZJ-18，最高的為ZJ-06，超過“紫娟”的共有9份材料；茶多酚含量超過“紫娟”的有7份材料，最高的為ZJ-15，最低的為ZJ-11；游離氨基酸含量最高的為ZJ-20，最低的為ZJ-05、ZJ-06及ZJ-16，超過“紫娟”的有4份材料；咖啡堿含量超過“紫娟”的材料只有ZJ-06。

春、夏兩季進(jìn)行比較，花青素總量的變異系數(shù)最大，春季為72.16%，夏季為77.86%，表明誘變后代的花青素具有較為豐富的多樣性，遺傳改良的潛力較為巨大。春季游離氨基酸總量的變異系數(shù)大于20%，但夏季的變異系數(shù)才7.6%，這可能與春季游離氨基酸含量整體偏高有關(guān)。

表4 “紫娟”及其誘變后代的花器官性狀

表5 春季 “紫娟”及其誘變后代的生化成分

表6 夏季 “紫娟”及其后代的生化成分

2.3 “紫娟”及其后代的DNA質(zhì)檢

21個(gè)樣品中提取的DNA電泳質(zhì)檢合格，結(jié)果見圖1。

2.4 “紫娟”及其后代的SSR遺傳多樣性分析

通過毛細(xì)血管電泳，使用genemapper ID 3.2軟件分析對(duì)44對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，分析結(jié)果見表7，44對(duì)引物共擴(kuò)增到165個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增到2～10個(gè)等位基因，平均等位基因7.5個(gè)，各位點(diǎn)多態(tài)信息量(PIC)變化范圍0.233～0.846；有效等位基因(Ne)在1.368～7.221，平均值為2.562，與觀察到的等位基因數(shù)存在著較大差距，表明等位基因在群體內(nèi)分布不均勻；觀測(cè)雜合度(H0)變化范圍在0.048～1.000，平均值為0.629，期望雜合度(He)變化范圍在0.269～0.862，平均值為0.565，不同位點(diǎn)的雜合度差異較大，平均觀測(cè)雜合度高于期望雜合度，說明群體內(nèi)雜合度較高；Shannon信息指數(shù)最高的為2.083，43個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記有18個(gè)為高度多態(tài)性(多態(tài)信息量>0.5)，25個(gè)為中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25<多態(tài)信息含量<0.5)，表明“紫娟”及其后代遺傳多樣性較為豐富。

M1500為1500 bp marker，ZJ01～ZJ20為“紫娟”的后代 M1500 is 1500 bp marker;ZJ01-ZJ20 are Zijuan’s mutagenesis progeny圖1 DNA電泳圖Fig.1 DNA electrophoretogram

表7 43個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性和變異性

續(xù)表7 Continued table 7

3 討 論

試驗(yàn)選定的20份“紫娟”誘變后代材料在葉色、芽色、葉形等外部形態(tài)特征上具有明顯的差異性，通過春、夏兩季花青素組分分析，證實(shí)花青素是“紫娟”葉片呈紫色的主要原因，驗(yàn)證了前期的推論，花青素含量多少影響著芽葉色澤，選定的誘變材料在生化成分上具有較高的遺傳多樣性。但是試驗(yàn)也有不足之處，茶樹屬于異花授粉作物，可能在自然雜交過程中會(huì)有自然突變的情況發(fā)生，這就造成誘變后代是因?yàn)榛瘜W(xué)或太空造成的突變還是自然環(huán)境造成的突變不得而知，故在今后的誘變后代分析上，首先可以采用扦插苗或穗條進(jìn)行誘變，減少自然因素的干擾；再者分析群體時(shí)，可以把自然雜交群體和誘變?nèi)后w進(jìn)行一個(gè)遺傳多樣性分析，找出遺傳多樣性的差異，從而判斷誘變效果。此外由于20份“紫娟”的誘變后代材料屬于單株群體，長(zhǎng)勢(shì)各有不同，在進(jìn)行春、夏理化成分分析時(shí)，蒸青樣很難采夠20 g的分析量，故最后春季只能分析15份，夏季只能分析14份，造成分析結(jié)果不夠全面，數(shù)據(jù)不夠完整，在今后的研究過程中，可以采用擴(kuò)繁的方式，來彌補(bǔ)數(shù)據(jù)的缺失。

新梢葉色有15份材料芽葉色澤與“紫娟”相近；成熟葉片的葉形只有2份材料與“紫娟”相同，為披針形，其余的為橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，葉色與“紫娟”相同的有9份材料，都為紫綠色，有7份材料葉色為黃綠色，有4份材料為綠色；花器官中的花萼有8份材料與“紫娟”相同，花萼花青甙顯色；20份材料中花柱的長(zhǎng)度、開裂數(shù)與“紫娟”基本一致，在裂位上，ZJ-02和ZJ-08為中裂，其余的為淺裂。

春、夏季生化成分的變異系數(shù)中，變異系數(shù)最高的為花青素，春茶達(dá)到72.16%，夏茶達(dá)到77.86%，花青素含量變化夏季大于春季，這個(gè)趨勢(shì)與譚曉琴[18]的研究較為一致；兩季中的茶多酚、水浸出物、游離氨基酸、咖啡堿變異系數(shù)都在30%以下，最低的為夏季游離氨基酸變異系數(shù)，達(dá)到7.60%。春季游離氨基酸的平均值為3.23%、夏季游離氨基酸的平均值為2.37%，春季茶多酚平均值為20.09%，夏季為24.34%，這個(gè)變化趨勢(shì)與周順珍等人[19]研究基本一致。

多態(tài)信息含量(PIC)反應(yīng)SSR位點(diǎn)的變異程度，數(shù)值越大，變異越多，“紫娟”誘變后代的43個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記有18個(gè)為高度多態(tài)性(多態(tài)信息量>0.5)，25個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25<多態(tài)信息含量<0.5)，平均值為0.492，已接近0.50的高多態(tài)性標(biāo)準(zhǔn)值，說明誘變后代具有一定的變異程度。

等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)相差，群體間的差異性越小，選育空間越小[20]。通過數(shù)據(jù)表明等位基因平均數(shù)為7.5，有效等位基因數(shù)為2.562，兩指標(biāo)差異較大，說明誘變后代的群體差異較大，遺傳多樣性非常豐富。本研究的多態(tài)信息量指數(shù)(PIC)平均為0.492，低于自然雜交的，但是自然雜交的Shannon信息指數(shù)I又遠(yuǎn)低于誘變后代的0.997。這與楊軍等[16]的研究結(jié)果一致。從群體的角度來說，通過誘變的子代群體遺傳多樣性較為豐富。

4 結(jié) 論

誘變后代生化成分變異系數(shù)最大的是花青素，變異系數(shù)均高于70%，說明誘變后代在花青素這個(gè)單一指標(biāo)上具有很高的遺傳多樣性。誘變后代的某些表型特征與花青素具有一定的相關(guān)性，當(dāng)花青素含量高甚至超過紫娟時(shí)，表型特征上芽葉色澤為紫綠色或紫色、芽葉花青甙顯色、葉片色澤也呈紫色或紫綠色。這些生化成分或表型特征呈現(xiàn)出特異性的誘變后代是遺傳研究和品種創(chuàng)制的物質(zhì)基礎(chǔ)，有待進(jìn)一步的跟蹤鑒定。本研究通過44個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)20份“紫娟”后代的遺傳多樣性進(jìn)行分析，其中引物3-ZJ10-F擴(kuò)增不出外其余的都成功擴(kuò)增出清晰條帶，通過數(shù)據(jù)分析得出“紫娟”誘變后代的平均多態(tài)信息量為0.492，不同位點(diǎn)的雜合度差異較大，平均觀測(cè)雜合度高于期望雜合度，群體內(nèi)雜合度較高；Shannon信息指數(shù)最高的為2.083，43個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記有18個(gè)為高度多態(tài)性，25個(gè)為中度多態(tài)位點(diǎn)，表明“紫娟”及誘變后代遺傳多樣性較為豐富。