廖 芳，任瑞花，孫 濤，孔德英，王仲敏，劉靜遠，印麗萍，李關榮*

(1.天津海關動植物與食品檢測中心，天津 300461；2.西南大學農(nóng)學與生物科技學院，重慶 400716； 3.重慶海關技術中心，重慶 401147； 4.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135)

【研究意義】丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)屬唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)植物，別名紅根、赤參，是一種主要以根及根莖入藥的多年生草本植物[1]。其藥用歷史悠久，藥理作用廣泛，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、鎮(zhèn)靜安神、消腫止痛等功效[2]。目前其栽培品種為丹參藥材的主要來源，主產(chǎn)區(qū)為山東臨沂、河南焦作、山西萬榮、陜西商洛、四川中江等地[3]。栽培生產(chǎn)上引種的隨意性、種植管理不規(guī)范性，產(chǎn)生了種源混亂、品種混雜、質量不穩(wěn)等問題[4]，因此，尋找快速準確鑒別不同丹參栽培居群的分子標記具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】前人曾基于生物學性狀[5]、顯微結構[6]對丹參的種質資源進行過鑒別，但丹參的形態(tài)學表現(xiàn)隨不同的環(huán)境條件差異極大，給其鑒定的準確性帶來問題。近些年來，在DNA分子水平上揭示多態(tài)性的分子標記技術成為了研究植物遺傳多樣性的有力工具，可以區(qū)分不同來源的不同形態(tài)個體，被廣泛用于藥用植物的居群鑒別及種間鑒別[7]。如唐曉清等[8]發(fā)現(xiàn)AFLP技術可作為鑒別丹參種內(nèi)不同類型間遺傳差異的手段,丹參種內(nèi)存在較為豐富的遺傳變異。【本研究切入點】核糖體DNA內(nèi)轉錄間隔區(qū)(Internal transcribedspacer,ITS)序列是核糖體DNA中位于18S、5.8S、28S之間的序列，分別由ITS1和ITS2組成，其中內(nèi)轉錄間隔區(qū)1(ITS1)位于18S rDNA和5.8S rDNA之間，內(nèi)轉錄間隔區(qū)2(ITS2)位于5.8S rDNA和28S rDNA之間[9]。在核糖體基因組中，ITS區(qū)序列進化速度快，可提供較豐富的變異位點及信息位點[10]。劉靈娣等[11]研究了28份不同來源丹參種質的rDNAITS序列，其完全序列在600～619 bp，ITS1為227～228，5.8S 為166 bp，ITS2為206～224，發(fā)現(xiàn)其變異主要發(fā)生ITS1和ITS2區(qū)，變異位點數(shù)分別為31和25，變異率分別為13.5%和11.2%;汪紅等[12]也對13個鼠尾草屬植物的ITS序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)其ITS1、ITS2長度分別為222～224和220～223 bp，ITS1的差異百分率在0～12.16%，ITS2的差異百分率在0.5%～13.5%，而丹參種內(nèi)差異百分率ITS1為 0～0.9%，ITS2為 0～0.5%?！緮M解決的關鍵問題】本文對國內(nèi)33個地區(qū)征集的42個丹參栽培居群的ITS序列進行了PCR擴增、測序和序列分析，以了解其遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育關系，為丹參栽培居群種質資源的遺傳鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

來自國內(nèi)33個地區(qū)的42種丹參栽培居群見表1，經(jīng)本實驗室形態(tài)鑒定確認均為丹參。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用CTAB法提取基因組DNA[13]。稱取100 mg幼葉，經(jīng)液氮磨成粉末后加入預熱的CTAB提取液700 μL(用前加終濃度為2%的β-巰基乙醇)中；65 ℃水浴中45 min，期間不斷顛倒混勻；取出后趁熱加入等體積700 μL的氯仿-異戊醇(24∶1 V/V)，顛倒混勻后充分乳化約10 min，12 000 r/min離心10 min；取上清液，加入2 μL RNase，室溫放置30 min；加入等體積的氯仿-異戊醇，混勻乳化10 min，12 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積的冷異丙醇，顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min；棄上清液，依次用700 μL 75%乙醇洗滌沉淀兩次，最后吸干75%的乙醇，再用無水乙醇漂洗產(chǎn)物1次；沉淀于室溫下干燥片刻，當看不到乙醇液漬且沉淀塊開始出現(xiàn)半透明時為止；加50 μL雙蒸水溶解沉淀；置于-20 ℃冰箱中保存。

表1 本研究采用的丹參材料

1.2.2 PCR擴增與測序 采用ITS通用引物：上游引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、下游引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行ITS擴增。PCR擴增體系：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，ITS1(10 μmol/L)1 μL，ITS4(10 μmol/L)1 μL，DNA模板1 μL。PCR擴增程序：98 ℃預變性3 min，98 ℃10 s，55 ℃10 s，72 ℃15 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸1 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，GoldView染色，用FR-980A凝膠成像儀觀察記錄。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，由重慶市擎科興業(yè)生物技術有限公司進行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 用BioEdit 7.09軟件對42個丹參居群的ITS序列進行分析；使用軟件MEGA X中的鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)與自展檢驗(Bootstrap=1000)構建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結果與分析

2.1 丹參居群基因組DNA的提取檢測

CTAB法提取的不同丹參居群的基因組DNA質量較好，電泳條帶較清晰(圖1)。

2.2 丹參ITS的PCR擴增產(chǎn)物

42個丹參居群的PCR擴增產(chǎn)物的電泳顯示：各丹參居群的ITS產(chǎn)物條帶清晰，大小在500～750 bp 之間，差異不大(圖2)。

2.3 丹參ITS序列分析

2.3.1 丹參ITS的總體特征 分析表明，丹參ITS擴增產(chǎn)物包括ITS1、5.8S和ITS2全長及18S、28S的部分序列。總長度為642～684 bp，42個序列全部提交到GenBank獲得登錄號(表2)；42個不同丹參居群的ITS1、5.8S rDNA和ITS2及全序列，長度在592～621 bp，其ITS1、5.8S rDNA和ITS2分別為203～229、164和226～229 bp；ITS1和ITS2區(qū)序列GC含量分別為65.50%～68.84%、62.38%～65.94%，顯著高于5.8S rDNA(54.88%)；丹參ITS序列大小ITS1變化最大，ITS2次之，而5.8S rDNA比較保守(表2)。

2.3.2 栽培丹參居群ITS的核苷酸變異分析 42個栽培丹參居群的ITS序列比較分析表明，其ITS1區(qū)共有19個變異位點，變異率為8.30%，其中顛換3個，轉換13個，缺失1個，插入2個；其5.8S區(qū)沒有序列差異，高度保守；其ITS2區(qū)共有37個變異位點，變異率為16.16%，其中顛換10個，轉換26個，插入1個，無缺失。ITS2區(qū)的序列變異最大，其次是ITS1區(qū)(表3)。42個栽培丹參居群中，發(fā)現(xiàn)有3個居群的SNP指紋，即W-SCHY-W-1、V-YNLJ-V-1和W-SXYA-V-3；其中W-SCHY-W-1和V-YNLJ-V-1富含SNP變異位點，是本研究中發(fā)現(xiàn)的兩個新穎獨特材料，二者非常相近；居群W-SXYA-V-3有4個SNP變異位點；居群V-HBCD-V-3、W-HBJM-V-1和W-GZ-V-2多1個共同的缺失位點；而其余36個丹參居群的ITS序列高度保守。

圖1 不同居群丹參基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳(材料編號見表1)Fig.1 Gel electrophoregram of genomic DNAs of S.miltiorrhiza cultivated populations(Material No.see table 1)

圖2 栽培丹參居群ITS擴增產(chǎn)物的電泳圖 (材料編號見表1)Fig.2 Electrophoregram of ITS amplification products of S.miltiorrhiza cultivated populations (Material No.see table 1)

表2 栽培丹參居群ITS序列各區(qū)基礎數(shù)據(jù)

表3 不同居群丹參ITS序列核苷酸變異位點

2.4 基于丹參ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育關系

根據(jù)各丹參居群ITS序列，以GenBank的丹參ITS序列(DQ132863.1)為外群(W)，分別構建了基于ITS1、ITS2、ITS1+ 5.8S rDNA +ITS2和ITS擴增產(chǎn)物完整序列(18S +ITS1+ 5.8S rDNA +ITS2+部分28S)的系統(tǒng)發(fā)育樹，以比較考察其系統(tǒng)發(fā)育關系。

ITS1的系統(tǒng)樹顯示：W-LNSY-V-1單獨聚在一分支上，與其余的41個丹參居群聚在一起的大群分離;這一大群又分聚為2個不同分支，一支包含S-NM-V-1、V-JSSY-V-1、V-SXYA-V-3、V-GZ-V-2、V-CQ-V-1、S-HBAG-V-1共6個丹參居群；另一分支包含其余的35個丹參居群，這35個丹參居群又聚在兩個分支上，一支包含15個丹參居群，另一只包含20個丹參居群，這一分支中居群W-SHCY-W-1、W-YNLJ-V-1和W聚在一起。其余的18個居群聚在另一個分支上(圖3-A)。ITS2序列系統(tǒng)樹顯示：42個丹參居群聚在2大分支上，其中24個丹參居群聚在一個分支上，其余18個丹參居群聚在另一個分支上，同樣可見W-SCHY-W-1與W-YNLJ-V-1聚在一起(圖3-B)。完整ITS區(qū)(ITS1+5.8S rDNA+ITS2)的系統(tǒng)樹顯示：除V-GZZY-V-1單獨聚在一系支上，其余41個丹參居群聚在另一系支上，在后一系支中S-NM-V-1、V-JSSY-V-1、V-SXYA-V-3、V-GZ-V-2、V-CQ-V-1 聚在一支，其余36個居群聚在另一大支條上；在這一大支上，再次可見W-SHCY-W-1,W-YNLJ-V-1與外群(W)聚在一起(圖3-C)。ITS擴增完整序列(18S+ITS1+5.8S rDNA+ITS2+部分28S)系統(tǒng)樹顯示：S-NM-V-1和V-GD-V-1聚在一系支上，其余40個丹參居群聚在另一系支上。這后一系支又分2個分支，其中19個丹參居群一支；另22個丹參居群為另一支，同樣可見，W-SHCY-W-1,W-YNLJ-V-1與外群(W)聚在一起(圖3-D)。

綜合聚類結果顯示：雖然依據(jù)不同序列的聚類大體結果相似，但有一些差異，但W-SHCY-W-1、W-YNLJ-V-1總是與外群W聚在一起，說明這兩種材料的特殊性。另外S-NM-V-1、V-JSSY-V-1、V-SXYA-V-3、V-GZ-V-2、V-CQ-V-1、S-HBAG-V-1等親緣關系較近。

3 討 論

白東東等[14]對9種甘草種質進行了ITS序列分析，并構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)ITS2序列可有效的區(qū)分5種甘草混偽品；成宇等[15]基于ITS序列對19科26屬30種林木樹種進行鑒定，發(fā)現(xiàn)鑒定成功率達到 83%。

本研究發(fā)現(xiàn)W-SCHY-W-1居群的ITS存在42個變異位點；居群V-YNLJ-V-1存在41個；居群W-SXYA-V-3有4個SNP變異位點。與其他居群比較，居群V-HBCD-V-3、W-GZ-V-2和W-HBJM-V-1額外多1個共同的缺失位點；其余36個丹參居群的ITS序列沒有變異位點。本研究發(fā)現(xiàn)栽培丹參的5.8S區(qū)非常保守，這與王迎等[16]研究結果相同，他們分析了27個鼠尾草屬藥用植物的ITS和5.8S rDNA完整序列，發(fā)現(xiàn)5.8S rDNA序列相當保守，而ITS區(qū)段則在亞屬間差異明顯。據(jù)ITS的SNP指紋能鑒別3個栽培丹參居群，這與劉靈娣[10]等的研究結果不同，其對28個丹參材料的ITS研究結果表明，此技術足以用于闡明丹參種內(nèi)演化及其地理分布關系。筆者認為，單一一種分子標記，還不足以鑒別所有栽培丹參居群。不同研究的偏差，很可能是因為研究材料的來源、數(shù)目、在生產(chǎn)上的廣泛無序交流所致，也可能是栽培丹參的ITS變異還不足以區(qū)別各居群。栽培丹參居群的準確可靠的分子鑒定還需要從多個基因上尋找復合分子標記。

A:ITS1;B: ITS2;C:ITS1+5.8S rDNA+ITS2;D:ITS1+5.8S rDNA+ITS2+ partial 28S rDNA圖3 基于ITS序列各區(qū)構建的不同居群丹參的系統(tǒng)樹Fig.3 Phylogenetic trees based on different regions of the ITS of S.Miltiorrhiza cultivated populations

根據(jù)聚類結果，筆者認為ITS序列揭示的栽培丹參之間的親緣關系與地理來源關系不大，這一研究結論與與劉靈娣[11]的研究結果不同。丹參具有較高遺傳多樣性，但遺傳多樣性多表現(xiàn)在居群內(nèi)，不同來源丹參之間的親緣關系尚不十分明確，丹參居群間的親緣關系與其地理分布之間關系，不同學者結論不同，這可能與研究者所用的研究材料不同有一定關系，此外，栽培丹參由于存在引種選育等人為因素的影響，與地理分布的關系更為復雜。采用多種分子標記復合指紋鑒定，可能是栽培丹參居群的遺傳鑒定可靠的技術。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)，栽培丹參rDNA的ITS1、5.8S rDNA和ITS2區(qū)的長度分別為203～229、164和226～229 bp；其ITS1區(qū)大小變化較大，而ITS2區(qū)核苷酸變異大。其SNP變異位點存在于ITS1和ITS2區(qū)，變異位點數(shù)分別為19和37個，變異率分別為8.30%和16.16%。丹參的5.8S區(qū)非常保守。本研究發(fā)現(xiàn)W-SCHY-W-1居群的ITS存在42個變異位點；居群V-YNLJ-V-1存在41個；居群W-SXYA-V-3有4個SNP變異位點。與其他居群比較，居群V-HBCD-V-3、W-GZ-V-2和W-HBJM-V-1額外多1個共同的缺失位點；其余36個丹參居群的ITS序列沒有變異位點。故據(jù)ITS的SNP指紋能鑒別3個栽培丹參居群。更為準確可靠的栽培丹參居群分子鑒定可能需要多個基因或標記構成的復合分子標記。