劉 昕，何一多，陳顯兵，王鳳杰

湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院病理科(湖北 恩施 445000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種病因不明，多關(guān)節(jié)受累的自身免疫性疾病。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形、骨質(zhì)疏松等，病理表現(xiàn)為滑膜組織增生、炎癥細(xì)胞浸潤、血管翳形成[1]。目前RA的治療以西藥為主，常用免疫抑制劑聯(lián)合鎮(zhèn)痛藥物治療，雖然在短時(shí)間內(nèi)具有一定療效，但是遠(yuǎn)期效果不理想，并且存在一定的副作用[2]。隨著中醫(yī)中藥的發(fā)展，中藥及其有效成分治療RA療效顯著，已成為自身免疫疾病領(lǐng)域的熱點(diǎn)。頭頂一顆珠(TTM)有安神鎮(zhèn)痛、活血化瘀、抗炎、解毒等作用，主治頭昏、失眠、軟組織損傷、外傷出血等癥[3]。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，以TTM干預(yù)治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的大鼠模型，探討TTM的抗炎作用和對(duì)滑膜細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步開發(fā)和利用土家民族藥，促進(jìn)TTM的研發(fā)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SD大鼠，雄性，二月齡，體質(zhì)量(250±20)g，購自湖北省宜昌市三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共50只大鼠，10只為正常對(duì)照組，40只制備CIA模型。飼養(yǎng)1周后造模，將乳化的Ⅱ型膠原以每只0.1 mL的劑量在大鼠左后足皮下注射，2周后同等劑量加強(qiáng)免疫1次。造模期間密切觀察大鼠活動(dòng)情況、精神狀況、隔2d觀察關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分和關(guān)節(jié)腫脹度。第2次造模結(jié)束1周后，正常組取5只、模型組取5只行滑膜病理組織觀察，評(píng)估是否造模成功。造模成功后隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各10只。模型組：2 mL生理鹽水灌胃；TTM(高、中、低)組(TTM濃度為50.0、25.0、12.5 mg/mL)2 mL灌胃，1次/d，共計(jì)1個(gè)月。

1.2主要試劑、藥物

1.2.1 主要試劑 Ⅱ型膠原(sigma公司)、不完全弗氏佐劑(sigma公司)、頭頂一顆珠由湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理實(shí)驗(yàn)中心提供。鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)一抗，鼠環(huán)氧化酶-1(COX-1)一抗，鼠COX-2一抗，鼠環(huán)氧化酶-2(COX-2)，轉(zhuǎn)化生長因子1β(factor-1β)一抗，鼠SP檢測試劑盒，3,3-二氨基苯聯(lián)胺顯色試劑盒(DAB)(博奧森生物公司)。

1.2.2 主要溶劑制備 Ⅱ型膠原乳劑：先配置60 mg/mL的乙酸，再將Ⅱ型膠原置于5 mL的60 mg/mL乙酸中，震蕩使其充分混勻，此時(shí)濃度為2 mg/mL，4℃冰箱過夜備用?；旌系润w積的不完全弗氏佐劑充分混勻乳化，最終濃度為0.1 g/mL，將液體滴在水面，懸濁液穩(wěn)定不散則說明乳化成功[4]。頭頂一顆珠乙酸乙酯部：取干燥TTM 0.5 kg，適度碎裂，在75%的酒精內(nèi)浸泡過夜后回流提取2次，每次1 h，合并提取液，濾過、減壓濃縮，即得TTM的乙醇總提取物，總提取物加水充分混勻后按照體積1∶1經(jīng)過醋酸乙酯萃取3次，歸并萃取液，60℃水浴蒸干，即得TTM乙酸乙酯部，生藥含量1 g/mL[5]。

1.3方法

1.3.1 關(guān)節(jié)炎腫脹測定 自造模后起，每周對(duì)各組大鼠按0-4級(jí)關(guān)節(jié)炎評(píng)分法評(píng)分：關(guān)節(jié)無炎癥記0分；小趾關(guān)節(jié)紅腫記1分；小趾關(guān)節(jié)和足跖紅腫記2分；踝關(guān)節(jié)水平下足爪紅腫記3分；踝部所有關(guān)節(jié)紅腫記4分。

1.3.2 滑膜病理學(xué)觀察 常規(guī)HE染色后觀察記錄以下指標(biāo)：滑膜細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤、新生血管、纖維組織變性?；ぜ?xì)胞增生評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1～2層細(xì)胞記0分；3～4層細(xì)胞記1分；5～6層細(xì)胞記2分；7層細(xì)胞以上記3分。炎癥細(xì)胞浸潤程度按浸潤的細(xì)胞量及類型評(píng)分：無淋巴細(xì)胞浸潤為0分；個(gè)別散在淋巴細(xì)胞浸潤記1分；淋巴細(xì)胞灶性或彌漫浸潤或可見個(gè)別漿細(xì)胞浸潤記2分；淋巴細(xì)胞片狀浸潤或見散在漿細(xì)胞浸潤記3分；形成淋巴濾泡或者彌漫漿細(xì)胞浸潤記4分；形成淋巴濾泡并生發(fā)中心記5分。新生血管增生評(píng)分：無記0分，輕度新生血管生成記1分，中度新生血管生成記2分，新生血管成簇成團(tuán)評(píng)分記3分。纖維變性程度以特染染色水平評(píng)分：無變化染色陰性記0分、染色輕度改變記1分、染色中度改變記2分、染色深染陽性記3分。

1.3.3 免疫組化染色結(jié)果判斷 鏡下免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)為棕黃色顆粒，在光鏡下觀察VGEF、TGF-1β、COX-1、COX-2標(biāo)記陽性切片。每張玻片讀3個(gè)高倍視野，根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽性數(shù)評(píng)分。按著色強(qiáng)度評(píng)分：藍(lán)色(-)為0分；淺棕黃色(+)記1分；棕黃色(++)記2分；深棕黃色(+++)記3分。按細(xì)胞陽性指數(shù)評(píng)分：藍(lán)色0分；陽性指數(shù)<30%記1分；30%～60%記2分；>60%記3分，總分6分。

2 結(jié)果

2.1 CIA模型一般情況造模后5 h大鼠左足出現(xiàn)紅腫，24 h尤為明顯。第一次免疫14 d后，右足開始出現(xiàn)輕微紅腫，第二次免疫后，左足腫脹程度較前更加明顯，食欲下降，精神萎靡、體質(zhì)量增長相對(duì)正常組緩慢，部分大鼠活動(dòng)受限、關(guān)節(jié)僵硬。

2.2 TTM對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的影響給藥2周后高中劑量組與模型組比較，大鼠關(guān)節(jié)腫脹度指數(shù)降低(P<0.05)，給藥4周時(shí)高中劑量組關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)顯著降低(P<0.01)，低劑量組與模型組相比較差異無顯著性(P>0.05)，見表1。

表1 治療組CIA大鼠足腫脹度比較

2.3滑膜組織病理改變正常大鼠滑膜的脂肪軟組織表面為單層排列的滑膜細(xì)胞，細(xì)胞之間排列有序，無擁擠，滑膜間質(zhì)內(nèi)血管分布均勻，血管壁薄，纖維組織質(zhì)地均一(圖1a)。模型組大鼠滑膜組織增生，細(xì)胞層次增多大于5層，部分區(qū)域呈指狀突起，局部顯著增厚，間質(zhì)纖維化，彌漫以淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，新生毛細(xì)血管增多，小動(dòng)脈血管壁增厚(圖1b)。3個(gè)TTM不同劑量組均可見上述不同程度的病理學(xué)改變，高、中劑量組的變化比較明顯：與模型組相比，高劑量組滑膜細(xì)胞約為1～3層，脂肪組織內(nèi)僅見個(gè)別淋巴細(xì)胞，纖維化(圖1c)。中劑量組滑膜細(xì)胞約為2～4層，散在淋巴細(xì)胞浸潤(圖1d)，而低劑量組仍可見4～5層滑膜細(xì)胞，彌漫淋巴細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維化明顯(圖1e)。

2.4滑膜組織病理評(píng)分比較模型組滑膜組織出現(xiàn)明顯的病理改變(P<0.05)。TTM高中劑量組能夠有效阻止CIA大鼠滑膜細(xì)胞增殖和滑膜新生血管，控制炎細(xì)胞浸潤和纖維化(P<0.05)。低劑量組在滑膜細(xì)胞增生及炎細(xì)胞浸潤評(píng)分較低(P<0.05)，其他3個(gè)方面評(píng)分無明顯差異，見表2。

表2 大鼠滑膜組織病理評(píng)分

2.5免疫組化染色結(jié)果免疫組化染色陽性表達(dá)定位于滑膜組織的上皮細(xì)胞，從以下各組各項(xiàng)指標(biāo)的免疫組化陽性表達(dá)中可以觀察到陽性強(qiáng)弱和陽性的范圍表達(dá)有差異，隨著藥物劑量的增加其陽性指數(shù)越低。模型組滑膜細(xì)胞呈強(qiáng)陽性(圖2a)，高劑量組陽性細(xì)胞散在分布(圖2b)，預(yù)防治療組呈弱陽性(圖2c)，中劑量組見散在弱陽性(圖2d)，低級(jí)別見彌漫的弱陽性表達(dá)(圖2e)。

與正常組比較，模型組免疫組化評(píng)分明顯升高(P<0.05)，低劑量組與模型組相比表達(dá)有所下降(P<0.05)，高中劑量組與模型組比較，各項(xiàng)免疫組化指標(biāo)的評(píng)分顯著降低(P<0.01)，見表3。

注：a.VEGF;b.TGF-β;c.COX-1;d.COX-2。圖2 各組滑膜組織VEGF、TGF-β、COX-1、COX-2免疫組化染色(×20)

表3 滑膜組織免疫組化評(píng)分

3 討論

RA是常見的關(guān)節(jié)疾病，炎癥反應(yīng)存在于疾病全程，表現(xiàn)為促炎性因子水平升高且作用增強(qiáng)，從而打破炎癥-抑制的動(dòng)態(tài)平衡[6]，RA滑膜組織的增生與炎性細(xì)胞因子密切相關(guān)，包含細(xì)胞增殖的調(diào)控、組織炎癥的刺激與缺氧環(huán)境、免疫平衡的失調(diào)等共同作用。VEGF是一種重要的細(xì)胞因子，其作用體現(xiàn)在與特異性血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)聯(lián)合在一起磷酸化胞內(nèi)酪氨酸殘基[7]。通過影響VEGF這個(gè)交通樞紐影響RA血管生成和炎癥發(fā)展。TGF-1β廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)在它可以選擇性激活內(nèi)皮細(xì)胞和ALK1、ALK5兩個(gè)特定受體。TGF-1β濃度的高低及ALK5、ALK1受體之間的平穩(wěn)共同控制著內(nèi)皮細(xì)胞增殖的方向[8]。RA患者滑膜、滑液和血清中均可檢測到VEGF，通過與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合使血管內(nèi)皮細(xì)胞膜局部產(chǎn)生H2O2，促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖，與疾病的活動(dòng)度呈正相關(guān)性[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠模型造模成功后VEGF、TGF-β呈高表達(dá)，表明CIA大鼠滑膜炎癥性反應(yīng)與血管增生與VEGF、TGF-1β的水平有關(guān)，并且通過給藥后高中劑量組免疫組化評(píng)分顯著降低，說明TTM可抑制VEGF、TGF-1β的表達(dá)。

研究表明[10]，在RA患者的滑膜組織中可檢測到COX-1和COX-2，通過培養(yǎng)RA滑膜細(xì)胞，在多種免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)都有表達(dá)。分別分離出COX-1和COX-2，觀察大鼠對(duì)花生四烯酸的炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)前者可以減輕炎癥表達(dá)，而后者依舊存在炎癥反應(yīng)，且其反應(yīng)程度與正常大鼠沒有明顯差異[11]，選擇性地抑制COX-1活性可以有效治療炎癥而不會(huì)造成胃損傷和心血管疾病[12]。因此，COX-1被重新考慮作為炎癥治療的靶點(diǎn)[13]。除炎癥外，COX-1還參與許多疾病的病理過程，如疼痛、血栓癥、內(nèi)皮功能紊亂、癌癥等[14]。本研究通過觀察CIA滑膜組織COX-1和COX-2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)模型組表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常組，說明COX-1和COX-2參與了CIA大鼠滑膜損傷。TTM各治療組均可降低COX-1和COX-2，提示TTM可以通過下調(diào)COX-1和COX-2的表達(dá)水平，從而抑制炎癥反應(yīng)、修復(fù)滑膜損傷。

綜上所述，TTM可緩解CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹，調(diào)節(jié)滑膜VEGF、TGF-1β、COX-1和COX-2的表達(dá)水平，對(duì)CIA大鼠有一定的治療作用，可能與TTM能啟動(dòng)炎性因子與炎性介質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。