馬占忠 ，許紅雁，胡紅波，劉玉蘭，陳偉娟，肖鳳金，梁慶雲(yún)，葉美嫻

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院 a. 檢驗(yàn)科；b. 婦科；c. 生物樣本庫，廣東韶關(guān) 512026）

卵巢癌是嚴(yán)重危害女性健康的三大惡性腫瘤之一，病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位，據(jù)WHO 報(bào)道：2018年全球新增卵巢癌患者約29.54 萬例，死亡18.4 萬例[1-2]。由于缺乏早期特異性標(biāo)志物及臨床癥狀，卵巢癌難以早期發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者確診時(shí)已到晚期[3]，而且預(yù)后極差，總體5年生存率僅有30%～40%[4-5]。BRCA1/2 基因突變會(huì)增加患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)，約20%的卵巢癌患者存在BRCA1/2 基因突變[6-8]。因此，尋找卵巢癌早期檢測(cè)的新靶點(diǎn)及防治策略是全球關(guān)注的焦點(diǎn)和難點(diǎn)。卵巢癌中10%～15%為遺傳性卵巢癌[9]，這部分人群可以通過基因檢測(cè)做到早期診斷和精準(zhǔn)靶向用藥治療，降低卵巢癌的死亡率。并通過評(píng)估其家屬的患癌風(fēng)險(xiǎn)，采取科學(xué)干預(yù)措施，降低卵巢癌的發(fā)病率。在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，下一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing, NGS)在臨床上的廣泛應(yīng)用，對(duì)卵巢癌的個(gè)體化診療產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響[10]。本研究利用靶向高通量基因測(cè)序技術(shù)對(duì)21 種卵巢癌易感基因進(jìn)行測(cè)序。繼而分析攜帶胚系基因突變和臨床特征的相關(guān)性，為卵巢癌的個(gè)體化精準(zhǔn)診療和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年1月～2020年12月在粵北人民醫(yī)院就診的35 例卵巢癌患者的外周血標(biāo)本和臨床資料，中位年齡50.2 歲（范圍31～74 歲），所有病例均經(jīng)過組織病理學(xué)確診為卵巢癌。腫瘤分期根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（FIGO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）標(biāo)準(zhǔn)。入組患者進(jìn)行BRCA1/2 等21 種易感基因的胚系突變檢測(cè)，從病歷中收集患者臨床病理、家族史、診療等信息。本研究經(jīng)粵北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 Covaris LE220 超聲波破碎儀，Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀，Qubit3.0 熒光定量分析儀、ABI StepOne 熒光定量PCR 儀和Illumina HiSeq2500 高通量測(cè)序儀等。QIAamp DNA Blood Midi Kit 提取DNA 試劑盒，華大基因文庫構(gòu)建和測(cè)序試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 提?。翰杉颊哽o脈血5ml，EDTA-K2抗 凝， 按 照QIAamp DNA Blood Midi Kit 試劑盒說明書提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA。

1.3.2 文庫構(gòu)建：將提取的基因組DNA 利用Covaris LE220 超聲波破碎儀打斷成200 ～250 bp的片段，進(jìn)行Ampure Beads 純化，將純化后的DNA 片段末端修復(fù)、加“A”以及加接頭反應(yīng)，完成文庫構(gòu)建。

1.3.3 雜交捕獲：Non-Captured 樣品進(jìn)行LM-PCR反應(yīng)、純化，利用基因片段捕獲探針，65℃雜交捕獲24h，雜交結(jié)束后進(jìn)行洗脫，隨后進(jìn)行Captured 樣品的LM-PCR 反應(yīng)。文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀和 ABI StepOne 熒光定量PCR 儀檢測(cè)片段大小和濃度。

1.3.4 基因測(cè)序：使用Illumina HiSeq2500 基因測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序覆蓋目標(biāo)基因外顯子及其鄰近±20bp 內(nèi)含子區(qū)，包括BRCA1，BRCA2，CHEK2，PALB2，BRIP1，TP53，PTEN，STK11，CDH1，ATM，BARD1，MLH1，MRE11A，MSH2，MSH6，MUTYH，NBN，PMS1，PMS2，RAD50 和RAD51C 共21 種基因。

1.3.5 生物信息學(xué)分析：用Illumina Pipeline software(v 1.3.4) 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)處理和分析，用BWA(Burrows Wheeler Aligner)軟件與HG19 進(jìn)行序列比對(duì)，同時(shí)評(píng)價(jià)序列捕獲效果。用SOAPsnp軟件和Samtools 軟件進(jìn)行SNV(single nucletide variant) 和Indel(insertion and deletion)的分析，查詢COSMIC(https://cancer.sanger.ac.uk /cosmic)，dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)，TP53 數(shù)據(jù)庫(http://p53.iarc.fr/Protocolsand Tools.aspx), Hap-Map, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults 等數(shù)據(jù)庫，對(duì)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行歸類和注釋。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌患者臨床病理特征 35 例卵巢癌患者中，年齡＜50 歲12 例（34.3%），年齡≥50 歲23例（65.7%）；組織類型中高級(jí)別漿液性卵巢癌27例（77.1%），其他類型8 例（22.9%）；FIGO 分期I～I(xiàn)I 期9 例（25.7%），III～I(xiàn)V 期26例（74.3%）；有腫瘤家族史15 例（42.9%），CA-125中位數(shù)755.3U/ml（范圍7.9～10 000.0U/ml）。

2.2 卵巢癌患者胚系基因突變分布 見表1。35例卵巢癌患者中檢出已知致病突變19 例，突變率54.3%，其中BRCA1 基因突變7 例，BRCA2 基因突變4 例，RAD51C 基因突變2 例，CHEK2，ATM，RAD50，MSH2，MRE11A 和TP53基因突變各1 例，這19 種突變類型中有17 種已在公共數(shù)據(jù)庫中有報(bào)道，另外，發(fā)現(xiàn)兩種新的基因突變，包括BRCA1 基因c.438delC 和RAD51C 基因c.390_391delAA。

表1 卵巢癌患者胚系基因突變分布

2.3 主要基因突變與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。卵巢癌患者多以高級(jí)別漿液性卵巢癌晚期為主，BRCA1 和BRCA2 是卵巢癌最主要的胚系突變基因。BRCA1/2 基因突變和組織類型相關(guān)（P=0.034），和家族史顯著相關(guān)（P=0.003），與年齡和FIGO 分期無顯著相關(guān)性（P>0.05）。

表2 主要基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性分析[n=35, n(%)]

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者易感基因突變率為54.3%，BRCA1 基因突變率最高(20.0%)，其次是BRCA2 基因突變率(11.4%)，BRCA1 和BRCA2 是卵巢癌中最主要的胚系突變基因，并且該基因突變與遺傳性卵巢癌顯著相關(guān)。檢測(cè)出的突變類型有框移突變、剪接突變和錯(cuò)義突變，所有突變均為雜合子和常染色體顯性遺傳。其中由基因缺失引起的框移突變占42.1%，該類突變可能導(dǎo)致基因編碼蛋白異常。新發(fā)現(xiàn)的BRCA1 基因c.438delC 和RAD51C基因c.390_391delAA 突變?cè)诠矓?shù)據(jù)庫中尚未見報(bào)道，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)深入研究。另外，研究發(fā)現(xiàn)BRCA1/2 基因突變頻率高，且無熱點(diǎn)突變，所以傳統(tǒng)的熒光定量PCR 不適宜做BRCA1/2基因突變檢測(cè)，測(cè)序是檢測(cè)此類基因突變的最佳技術(shù)手段。

卵巢癌的發(fā)生本質(zhì)上是基因突變和免疫逃逸所致，對(duì)高危人群進(jìn)行易感基因篩查是卵巢癌早期診斷的有效手段[11]。本研究結(jié)果也證實(shí)了BRCA1/2 基因突變與遺傳性卵巢癌發(fā)病密切相關(guān)。BRCA1 和BRCA2 分別定位在人類染色體17q21 和13q12，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、調(diào)控轉(zhuǎn)錄及DNA 修復(fù)等作用，基因發(fā)生突變使得細(xì)胞的正常調(diào)節(jié)失活，引起細(xì)胞異常生長(zhǎng)，最終發(fā)生腫瘤[12-13]。一般人群中卵巢癌終生發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)約為1.5%，而BRCA1和BRCA2 基因突變攜帶者患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)分別是25%～65%和15%～20%[14]。美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）在遺傳性乳腺癌及卵巢癌綜合征檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，建議應(yīng)對(duì)有家族史的人群檢測(cè)BRCA1 和BRCA2 基因，對(duì)于攜帶已知致病性突變的人群應(yīng)加強(qiáng)健康管理，以利于早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)[15]。

卵巢癌腫瘤細(xì)胞和胚系細(xì)胞中主要的突變基因有差異。KWONG 等[16]應(yīng)用高通量測(cè)序檢測(cè)卵巢癌患者體細(xì)胞易感基因，排在前五的突變是TP53(52.9%)，KRAS(23.5%)，PIK3CA(11.8%)，BRCA1(5.9%) 和RB1(5.9%)。GARZIERA 等[17]在遺傳性卵巢癌腫瘤細(xì)胞中檢出最主要的突變是TP53(72.1%)， KRAS (8.9%)，F(xiàn)BXW7(3.8%)，PTEN (3.8%)和 PIK3CA (3.8%)，研究結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞中以TP53 突變?yōu)橹?，而胚系?xì)胞中則以BRCA1/2 突變?yōu)橹鱗18]。2013年5月14日，國(guó)際影星安吉麗娜·朱莉(Angelina Jolie)公布了她檢測(cè)到BRCA1 基因有突變，加之母親患乳腺癌，評(píng)估其罹患乳腺癌和卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)分別高達(dá)87%和50%的情況下，她選擇了雙側(cè)乳房切除術(shù)預(yù)防腫瘤的消息[19]。此事除明星效應(yīng)引起全球關(guān)注外，也引發(fā)了醫(yī)學(xué)界對(duì)預(yù)防性器官切除及醫(yī)療指征的熱議[20]。目前，國(guó)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)已廣泛開展遺傳性腫瘤的基因測(cè)序和遺傳咨詢[21]，國(guó)內(nèi)腫瘤基因測(cè)序在臨床上的應(yīng)用也取得了一定的進(jìn)展[22-23]。隨著高通量基因測(cè)序在遺傳性腫瘤防治中的應(yīng)用，使得腫瘤的防治有了重大突破，腫瘤患者的生存獲益有了質(zhì)的飛躍[24-26]?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)的臨床研究必將極大地推動(dòng)以基因大數(shù)據(jù)與個(gè)體化診療為特征的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，影響和改變我們的臨床實(shí)踐，具有臨床推廣應(yīng)用前景。