吳良銀，李文麗，劉 俊 (粵北人民醫(yī)院.檢驗(yàn)科；.生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東韶關(guān) 512025）

肝癌是全球第六大常見癌癥，2018年新發(fā)病例為841 000 例，死亡人數(shù)達(dá)到782 000 例。盡管慢性肝病的管理在腫瘤檢測和腫瘤治療方面不斷取得進(jìn)展，但與其他實(shí)體腫瘤相比，肝細(xì)胞癌的預(yù)后仍然較差，其五年生存率不足18%[1]。慢性肝炎病毒的持續(xù)感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的主要因素，約占原發(fā)性肝細(xì)胞癌的85%[2]。雖然手術(shù)切除和肝移植是早期肝細(xì)胞癌的最佳治療方法，但大多數(shù)晚期肝細(xì)胞癌患者不適用這些治療手段[3]。目前廣泛的研究都集中在基因的異常表達(dá)和改變上，已經(jīng)有證據(jù)表明這與肝癌的進(jìn)展有關(guān)，包括KPNA2 的表達(dá)失調(diào)與肝細(xì)胞癌的預(yù)后不良相關(guān)[4]，MiR-888 促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲[5],代謝誘導(dǎo)的腫瘤激活劑1，（metabolism-induced tumor activator 1, MITA1） 是肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動因素[6]。然而，目前尚未確定能夠用于預(yù)測臨床疾病預(yù)后的分子生物標(biāo)志物。因此，有必要對肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程進(jìn)行多方向多層次的研究。

微陣列的高通量表達(dá)數(shù)據(jù)已被用于鑒定與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)的基因中，而且測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析也在分子靶標(biāo)的預(yù)測中廣泛應(yīng)用[7]。單個微陣列分析結(jié)果的說服力有限，本研究利用三對病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌的基因芯片數(shù)據(jù)集篩選在肝細(xì)胞癌中表達(dá)失調(diào)的基因，并進(jìn)行功能富集分析和臨床相關(guān)性分析，為深入研究診斷和新藥研究的潛在生物標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 資料來源

1.1.1 芯片數(shù)據(jù)來源：基于美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)負(fù)責(zé)管理的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus darabase, GEO）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，通過篩選分析獲取所需數(shù)據(jù)。

1.1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：選取來自GEO 數(shù)據(jù)庫的三個病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌的表達(dá)芯片，納入標(biāo)準(zhǔn)：病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌的表達(dá)芯片，包括GSE84402（肝癌組織13 例、癌旁組織13 例）,GSE62232（肝癌組織29 例、癌旁組織10 例）和GSE19665（肝癌組織10 例、癌旁組織10 例），三個數(shù)據(jù)集都是基 于GPL570 芯 片 平 臺(affymetrix human genome U133 plus 2.0Array),含有52 個肝細(xì)胞癌腫瘤組織和33 個肝細(xì)胞癌旁組織（對照組），本研究不涉及倫理學(xué)規(guī)范相關(guān)內(nèi)容。

1.2 方法

1.2.1 檢索方法：GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是GEO數(shù)據(jù)庫自帶的在線分析工具，可以用兩組或多組間的比較以期獲得差異基因。

1.2.2 文獻(xiàn)評價：三個數(shù)據(jù)集分別用GEO2R 進(jìn)行了病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌組織與癌旁組織的差異分析。本研究選取滿足|logFC(foldchange)|≥1.0，P<0.05 的基因作為差異基因。用在線工具韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) 來繪制三個數(shù)據(jù)集的共同差異基因。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究中，應(yīng)用DAVID 對這些差異基因進(jìn)行功能富集和生物學(xué)分析，基因數(shù)大于10，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.1 GO 和KEGG 通路的富集分析：DAVID 數(shù)據(jù)庫 (https://david.ncifcrf.gov/)是一個在線生物信息數(shù)據(jù)庫，它集成了生物數(shù)據(jù)和分析工具。GO 用于基因的生物信息學(xué)分析和功能富集，KEGG 是一個存儲由基因組測序產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)庫，主要用于探索生物系統(tǒng)的高級功能和用途。

1.3.2 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建： STRING (http://www.string-db.org/)互作基因檢索工具用于構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。綜合評分>0.9 的互作網(wǎng)絡(luò)被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。利用Cytoscape(http://www.cytoscape.org/)對分子互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，同時采用CytoHubba 插件，用來計算蛋白之間的節(jié)點(diǎn)。

1.3.3 關(guān)鍵基因的篩選與分析：蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，連接度排名前20 的基因被鑒定為關(guān)鍵基因?；赾BioPortal 數(shù)據(jù)庫(http://www.cbioportal.org)分析關(guān)鍵基因的總體生存率和無病生存率，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)基因 本研究中選取了來自GEO 數(shù)據(jù)庫的三個mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE84402, GSE62232 和GSE19665。利用GEO2R 工具分別鑒定出1218，1765 和2616 個與病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌的差異表達(dá)基因，采用韋恩圖繪制三個數(shù)據(jù)集共有的差異基因423 個，見圖1。

圖1 病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌差異基因的韋恩圖

2.2 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選 為了探索這些差異基因的潛在作用關(guān)系，利用String 數(shù)據(jù)庫對共同差異基因進(jìn)行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，結(jié)果表明這些分子間存在較為密切的相互作用關(guān)系。通過CytoHubba 模塊，根據(jù)分子間的連接度，選取連接度前20 的基因作為關(guān)鍵基因，見圖2。

圖2 關(guān)鍵基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO 和KEGG 通路富集分析 見圖3。利用DAVID 對差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路功能富集分析。結(jié)果顯示差異基因主要富集于細(xì)胞質(zhì)，以及胞質(zhì)外間隙區(qū)域，見圖3A；同時，差異基因主要參與細(xì)胞分裂以及氧化還原等細(xì)胞生物學(xué)過程中，見圖3B 所示；分析顯示，差異基因主要參與蛋白結(jié)合以及鐵離子結(jié)合等分子功能中，見圖3C 所示。此外，KEGG 通路分析表明，差異基因主要富集于細(xì)胞過程以及DNA 復(fù)制和P53 信號通路中，見圖3D 所示。

圖3 GO 和KEGG 通路富集分析

2.4 關(guān)鍵基因的臨床分析 見表1。為了進(jìn)一步評估關(guān)鍵基因的預(yù)后價值，采用K-M 生存分析的方法對關(guān)鍵基因的總體生存和無病生存率進(jìn)行分析，結(jié)果表明 CDK1, CDC20, BUB1, BUB1B, MAD2L1, CCN B1,RRM2,UBE2C,NCAPG,TTK,PBK,NDC80, TPX2, MELK 和KIF2C 的異常表達(dá)對肝細(xì)胞癌的總體生存率都有較顯著影響。因無病生存率在病人的預(yù)后評價中越來越得到重視，隨后對這些關(guān)鍵基因進(jìn)行無病生存率的分析，結(jié)果表明BUB1, BUB1B, CDC20, NCAPG, TPX2 和UBE2C 的異常表達(dá)與肝細(xì)胞癌病人的無病生存率顯著相關(guān)（P<0.05）。

表1 關(guān)鍵基因生存分析信息表

3 討論

近年來研究表明肝細(xì)胞癌的發(fā)生是多基因、多途徑參與的過程[8]，目前其發(fā)生和發(fā)展的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明[9]。盡管肝細(xì)胞癌的診斷和治療水平有所提高，但其預(yù)后效果仍不理想[10]。因此，篩選和鑒定出與肝細(xì)胞癌發(fā)生及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物對了解肝細(xì)胞癌的發(fā)展過程非常重要。

本研究中，利用生物信息學(xué)分析方法，篩選出423 個共同差異表達(dá)的基因，最終鑒定出連接度最高的20 個關(guān)鍵基因，隨后通過總生存率和無病生存率相關(guān)性分析，結(jié)果表明BUB1, BUB1B, CDC20, NCAPG, TPX2 和UBE2C 在肝細(xì)胞癌腫瘤組織中過表達(dá)與病毒性肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后有顯著相關(guān)性（P<0.05）。針對篩選出的上述六個基因，搜索閱讀文獻(xiàn)，有研究報道，BUB1B 是正常有絲分裂中所必需的基因，主要編碼參與紡錘體檢查點(diǎn)功能的激酶，與肝細(xì)胞癌、胰腺癌以及肺腺癌的不良預(yù)后有關(guān)[11-13]。CDC20 編碼的蛋白充當(dāng)調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞周期的多個點(diǎn)與蛋白質(zhì)相互作用，通過促進(jìn)核轉(zhuǎn)位和β-連環(huán)蛋白的反式激活，維持CD44+前列腺癌干細(xì)胞的自我更新能力，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中通過CDC20 的下調(diào)，抑制Wnt /β-catenin 信號通路，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和降低遷移能力[14-15]。NCAPG 編碼縮合蛋白復(fù)合物的亞基，其負(fù)責(zé)有絲分裂和減數(shù)分裂期間染色體的濃縮和穩(wěn)定，其異常表達(dá)與肝細(xì)胞癌的病理性T 分期和組織學(xué)分級密切相關(guān)[16]。TPX2 是細(xì)胞凋亡過程中微管正常組裝所必需的，有研究報道可通過沉默TPX2 基因，抑制Wnt 信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和凋亡相關(guān)蛋白，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且沉默TPX2 可以負(fù)調(diào)節(jié)PI3K / AKT 并激活p53 信號通路，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖從而加速細(xì)胞凋亡[17-18]。UBE2C 編碼的蛋白質(zhì)是破壞有絲分裂細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期進(jìn)展所必需的，有研究表明UBE2C 通過失調(diào)-自噬，從而抑制小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展，此外UBE2C 在直腸癌中過表達(dá)，其受miR-381 調(diào)節(jié)，會抑制細(xì)胞增殖，侵襲和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19-20]。

綜上所述，多項(xiàng)研究已表明BUB1，BUB1B，CDC20，NCAPG，TPX2 和UBE2C 這六個基因參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但其在肝細(xì)胞癌的功能和作用尚不明確。而本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫的三個病毒性肝細(xì)胞癌的芯片陣列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過臨床相關(guān)性驗(yàn)證，鑒定出 BUB1，BUB1B，CDC20，NCAPG，TPX2 和UBE2C 在病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌中均高表達(dá)，其過表達(dá)對肝細(xì)胞癌患者的整體生存和無病生存都起著重要作用。本研究結(jié)果可能為病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌提供了新的預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)，后續(xù)我們會通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。