張 揚(yáng)，劉光麗

(1.陸軍炮兵防空兵學(xué)院 機(jī)械工程系，安徽 合肥 230031；2.安徽醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230032)

微針技術(shù)作為一種新型的經(jīng)皮給藥技術(shù)已經(jīng)在生物制藥領(lǐng)域得到了廣泛的探索[1-2]。與傳統(tǒng)的皮下注射相比，微針技術(shù)最大的特點(diǎn)就是將傳統(tǒng)的注射針頭微型化，并以陣列的形式進(jìn)行排列。經(jīng)過(guò)微針技術(shù)的不斷發(fā)展，制備的材料已由傳統(tǒng)的不銹鋼等金屬材料向現(xiàn)在的透明質(zhì)酸、麥芽糖等高分子聚合物發(fā)展[3-4]?，F(xiàn)如今大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，通過(guò)在血管豐富的真皮層中形成親水通道，微針可以促進(jìn)藥物向全身循環(huán)傳遞，微針還可以促進(jìn)藥物分子透過(guò)表皮和真皮進(jìn)入皮膚深層組織[5-6]。其優(yōu)勢(shì)是顯而易見(jiàn)的，如不會(huì)對(duì)皮膚造成損傷，易于醫(yī)護(hù)人員的管理、儲(chǔ)存和處理以及不會(huì)引起患者的疼痛等[7-8]。

透明質(zhì)酸是一種非硫酸化的糖胺聚糖，在真皮中含量最高，它是維持皮膚水分的關(guān)鍵分子之一，具有獨(dú)特的保濕能力。在生物制藥領(lǐng)域已經(jīng)嘗試將透明質(zhì)酸輸送到皮膚中。雙氯芬酸鈉作為一種低成本的非甾體抗炎藥，在臨床上常用于鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱等目的[9-10]，此藥物由于對(duì)胃腸道有較大的刺激，所以常常會(huì)限制其應(yīng)用。在本文中將雙氯芬酸鈉與透明質(zhì)酸結(jié)合制備可溶性微針，HA作為一種生物高分子材料，具有生物相容性和可生物降解性，并且HA和DS都是高度水溶性，因此選擇HA作為制備微針的聚合物基質(zhì)。在微針表面覆蓋一層雙氯芬酸鈉粉末，探究了微針的制備工藝、機(jī)械強(qiáng)度和釋放特性等參數(shù)，在增加藥物輸送總量的同時(shí)減少透明質(zhì)酸微針的吸濕性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

材料：透明質(zhì)酸粉末(hyaluronic acid, HA，醫(yī)用級(jí)，華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司)、磺酰羅丹明B(sulforhodamine B, SRB，分析純，上海信裕生物科技有限公司)、雙氯芬酸鈉緩釋片(diclofenac sodium, DS，醫(yī)用級(jí)，江西仁和藥業(yè)有限公司)、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)微針模具(廣東微科有限公司)、豬皮(當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng))、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS，?？寺∩锟萍加邢薰?、瓊脂糖(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

設(shè)備：202-OA真空干燥箱(南京華奧干燥設(shè)備有限公司)、紫外分光光度計(jì)Evolution 220(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 方法

微針制備過(guò)程如下：去離子水配置一定濃度梯度的HA與DS的水溶液。攪拌均勻后倒入制備好的PDMS微針模具中抽真空3 min，使HA水溶液完全浸入型腔中。為了避免混合液在高溫時(shí)過(guò)度失水，放置在37 ℃恒溫狀態(tài)下12 h完成干燥，取出微針，表面均勻涂抹DS顆粒。為了便于觀察，通常微針中摻入1%(體積分?jǐn)?shù))的SRB粉末。在真空干燥過(guò)程中，為控制溫度，將加濕器放置在真空干燥箱中設(shè)置37 ℃恒溫。利用濕度計(jì)讀數(shù)，通過(guò)控制加濕器的功率從而達(dá)到控制相對(duì)濕度的目的。具體的制備工藝如圖1所示。

圖1 微針制備工藝流程圖

取成年豬的腹部離體皮膚，去除多余的皮下脂肪后平鋪。將加入SRB的可溶性微針插入豬皮中，并保持插入狀態(tài)2 min后除去剩余的微針，此過(guò)程測(cè)試微針刺入皮膚的性能。將微針刺入封口膜后露出針尖的部分浸泡入10 mL的PBS緩沖液中，觀察微針在體外完全溶解的時(shí)間。稱取15 g的瓊脂糖粉末放置在100 mL的去離子水中，加熱攪拌至完全溶解，冷卻后得到透明瓊脂糖凝膠，將融合了SRB的HA微針完全刺入瓊脂糖凝膠中，確定微針在仿體模型中釋放藥物的情況。分別配制1～20 μg/mL的DS水溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)得其在284 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，由此測(cè)定出DS水溶液的吸收-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。在豬的腹部皮膚上進(jìn)行體外透皮的試驗(yàn)，并將試驗(yàn)重復(fù)5次保證數(shù)據(jù)的可靠性，皮膚的平均厚度為(0.47±0.18)mm，對(duì)照組是濃度30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的DS溶液，1測(cè)試組是HA-DS微針，2測(cè)試組是微針表面涂覆DS的HA-DS微針，待微針穿刺皮膚并釋放DS 24 h后，取1 cm2皮膚放于5 mL水中，待皮膚中的DS全部溶于水中后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定水中DS的吸收曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 微針尺寸表征結(jié)果

制備的微針陣列是15×15的圓錐陣列，底面直徑為380 μm，高度為860 μm，針尖距離為700 μm。微針陣列圖如圖2所示，圖2a和圖2b分別代表了表面未添加DS粉末和添加DS粉末的數(shù)碼相機(jī)圖；而圖2c和圖2d則是相對(duì)應(yīng)的光學(xué)顯微鏡圖。由于HA具有吸濕性，所以常常會(huì)在高濕度的環(huán)境中潮解。將烘干后的HA表面均勻地覆蓋上DS粉末，由于微針的相對(duì)表面積減少，能有效阻止在高濕度下的微針的潮解。從圖2中可以看到，表面覆蓋了DS粉末相比沒(méi)有覆蓋DS粉末的微針能更長(zhǎng)時(shí)間地保持微針結(jié)構(gòu)的完整性。

a)未添加DS粉末的微針

2.2 HA濃度對(duì)微針成型的影響

HA濃度對(duì)微針的影響見(jiàn)表1。將溫度設(shè)定在37 ℃，控制HA的濃度后發(fā)現(xiàn)，在低濃度狀態(tài)下(20%)，由于HA的含量在水溶液中的比例過(guò)低，完全干燥后無(wú)法產(chǎn)生實(shí)心的微針。而當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)，由于溶液的粘度過(guò)大，在干燥過(guò)程中常出現(xiàn)氣孔、空腔等。分析主要原因是HA的濃度過(guò)高造成溶液流動(dòng)性下降。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，認(rèn)為HA濃度為50%的狀態(tài)下能夠制備完整的微針陣列，同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生氣孔等缺陷，微針的制備性能主要受到HA濃度的影響。

表1 HA濃度對(duì)微針的影響

2.3 微針穿刺皮膚試驗(yàn)

采用成年豬的腹部皮膚進(jìn)行穿刺試驗(yàn)?zāi)M(見(jiàn)圖3)。由圖3可知，當(dāng)微針插入皮膚后，皮膚中的組織液等溶液會(huì)溶解HA。皮膚表面的紅色點(diǎn)陣說(shuō)明微針已經(jīng)完全扎入豬皮中，而紅色的方框是因?yàn)槲⑨標(biāo)闹艿倪吘壟c皮膚相接觸，表明微針能與豬皮完全貼合而沒(méi)有在施加壓力的過(guò)程中發(fā)生脆斷。

圖3 微針穿刺皮膚實(shí)物圖

2.4 微針在PBS溶液中的溶解速率

試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，表面覆蓋DS粉末的微針在顆粒的保護(hù)作用下剛開(kāi)始溶解緩慢，在(11.15±0.13)s時(shí)，隨著微針表面覆蓋的DS的溶解，溶解速率增快；在(0.00±0.20)～(11.15±0.13)s時(shí)，無(wú)DS覆蓋的微針會(huì)由于較大的接觸面積快速溶解；在(30.03±0.15)s結(jié)束時(shí)，2種不同的微針的溶解速率相似。試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了當(dāng)微針表面覆蓋DS時(shí)能夠有效控制微針的吸濕性。

圖4 微針的溶解速率圖

2.5 微針在仿體模型中的藥物釋放

微針的仿體釋放試驗(yàn)如圖5所示，微針在瓊脂糖凝膠中不斷釋放SRB，紅色的區(qū)域隨著時(shí)間的增加而變大，開(kāi)始時(shí)由于微針融入的SRB局部濃度較高，紅色釋放速度較快，隨著局部濃度的不斷降低，擴(kuò)散速度逐漸變慢。在瓊脂糖凝膠中僅需要(12±0.25)h則完全停止擴(kuò)散。

圖5 微針的仿體釋放試驗(yàn)

2.6 微針在組織的體外透皮試驗(yàn)

皮膚內(nèi)DS的遞送量見(jiàn)表2。表2列出了表皮和真皮內(nèi)DS的遞送量以及整體的遞送量結(jié)果，在皮膚內(nèi)的總遞送結(jié)果顯示，對(duì)照組(30%的DS溶液)和1測(cè)試組(HA-DS微針)的遞送總量分別為(45.2±4.3)和(36±4.9)μg/cm2，2測(cè)試組(表面涂覆DS的HA-DS微針)的遞送總量為(103.9±3.4)μg/cm2，皮膚內(nèi)DS的總遞送量明顯增加。此外，真皮層中的數(shù)據(jù)也顯示，表面涂覆DS的HA-DS微針可以更好地將藥物遞送到真皮層中。

表2 皮膚內(nèi)DS的遞送量

3 結(jié)語(yǔ)

本文基于可溶性微針技術(shù)制備了包封雙氯芬酸鈉的雙重釋放微針，并就微針的機(jī)械強(qiáng)度、釋放速率和制備工藝等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，拓展了其實(shí)際應(yīng)用的可行性。雙重DS微針在傳統(tǒng)可溶性微針將藥物與HA互溶的基礎(chǔ)上，利用高分子材料特有的粘性，在表面進(jìn)一步覆蓋DS顆粒，從而進(jìn)一步擴(kuò)大了載藥量，同時(shí)改善了水溶性微針容易吸水潮解的問(wèn)題，對(duì)微針的臨床應(yīng)用和深入研究有著一定的參考價(jià)值。