卜浩林李麗紅李 欣郭建紅*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室,太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所,太原 030001)

絕經(jīng)綜合征是指婦女絕經(jīng)前后出現(xiàn)性激素波動或減少所致的一系列軀體及精神心理癥狀[1]。雌激素可以降低食欲、增加能量消耗,減少體重和脂肪聚集,因此,雌激素對體重的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[2]。絕經(jīng)后婦女由于體內(nèi)雌激素的減少出現(xiàn)體重增加、內(nèi)臟脂肪積累等癥狀,絕經(jīng)后肥胖的發(fā)生率為64.3%[3-4]。另外,雌激素與肝雌激素受體結(jié)合上調(diào)小二聚體伴侶(SHP)的表達(dá),從而抑制下游SREBP-1c的表達(dá),減少肝脂類的合成[5]。女性絕經(jīng)后失去雌激素的保護(hù)作用,非酒精性脂肪肝的患病率明顯升高[6]。

目前絕經(jīng)綜合征的治療包括藥物治療和非藥物治療,藥物治療主要為激素替代治療和中藥療法等,而非藥物治療包括飲食與運動等調(diào)節(jié)方式[7]。先前調(diào)查表明,激素替代療法患中風(fēng)、乳腺癌和靜脈血栓的風(fēng)險增加[8],因此激素替代治療以外的研究也越來越受到重視。飲食治療包括低蛋白飲食、高蛋白飲食、生酮飲食(高脂肪)等。據(jù)報道,低蛋白飲食可以通過蛋白質(zhì)限制引起的肝綜合應(yīng)激反應(yīng)改善代謝[9],而高蛋白飲食則是通過膳食誘導(dǎo)熱效應(yīng),以及蛋白質(zhì)攝入增多引起的飽腹感從而減少能量的攝入,達(dá)到控制體重的作用[10-11]。此外,高蛋白飲食能夠改善由高脂飲食引起的脂肪肝[12]。因此,我們使用OVX小鼠模型模擬絕經(jīng)后狀態(tài),同時給予不同蛋白濃度飲食喂養(yǎng)24周,觀察其對卵巢切除小鼠肝和脂肪組織的影響,并研究其中可能涉及的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡C57/BL6雌性小鼠32只,體重(20±0.5)g,購自山西醫(yī)科大學(xué)動物中心[SCXK(晉)2019-0004],飼養(yǎng)于本課題組獨立動物房[SYXK(晉)2019-0004],室溫(22±1)℃,光暗循環(huán)12 h/12 h。所有動物實驗及操作遵循山西醫(yī)科大學(xué)動物管理委員會的規(guī)定進(jìn)行(IACUC-2017016),動物實驗過程中遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

HE染色液(索來寶生物科技有限公司,G1120);小鼠GLP-1 ELISA檢測試劑盒(江萊生物,JL11122);M5 Total RNA Extraction Reagent(北京聚合美生物科技有限公司,MF034-01);M5 Super qPCR RT kit with gDNA remover(北京聚合美生物科技有限公司,MF166-1);2×M5 HiPer SYBER Premix EsTaq(北京聚合美生物科技有限公司,MF787-1);SREBP-1c引物、GLP-1、β-actin(華大基因)、Rabbit Anti-SREBP-1c antibody(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,bs-1402R);包 埋 機(jī)(Leica公 司,Leica EG1150H,德國);組織切片機(jī)(Leica公司,Leica RM2245,德國);分光光度計(eppendorf公司,BioSpectrometer,德國);實時定量PCR儀(上海吉泰生物科技有限公司,STRATAGENE Mx3005P,中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 高、低蛋白飲食的配制

參照本課題組制作特殊飼料的方法[13]:100 g標(biāo)準(zhǔn)飼料蛋白質(zhì)含量為18%,由標(biāo)準(zhǔn)飼料粉劑和伊利高蛋白脫脂奶粉配制蛋白含量24%的高蛋白飲食,由標(biāo)準(zhǔn)飼料粉劑和玉米淀粉配制蛋白含量6%的低蛋白飲食。1000 kcal能量三種飲食的配法;(1)標(biāo)準(zhǔn)飲食:標(biāo)準(zhǔn)飼料277.50 g;(2)高蛋白飲食:標(biāo)準(zhǔn)飼料粉158.47 g+伊利脫脂奶粉110.56 g;(3)低蛋白飲食:標(biāo)準(zhǔn)飼料粉78.68 g+玉米淀粉207.15 g。

1.3.2 小鼠分組及處理

將32只8周齡雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組:(1)對照組(n=8):標(biāo)準(zhǔn)飲食;(2)模型組(n=8):標(biāo)準(zhǔn)飲食;(3)高蛋白組(n=8):高蛋白飲食;(4)低蛋白組(n=8):低蛋白飲食。所用小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后,其中模型組、高蛋白組、低蛋白組小鼠行卵巢切除術(shù),切開腹部,在左右兩側(cè)找到卵巢并摘除取出,縫合切口;對照組用同樣的手法切開腹部,找到卵巢復(fù)位后縫合腹部切口。手術(shù)恢復(fù)3 d后,各組按照不同的飲食飼養(yǎng)24周,自由進(jìn)食進(jìn)水,每周測量小鼠體重,24周實驗結(jié)束經(jīng)1%戊巴比妥鈉麻醉后眼眶采血,取肝、結(jié)腸組織、腹膜后脂肪組織,稱重脂肪組織。

1.3.3 HE染色

取小鼠部分肝組織、部分腹膜后脂肪組織,10%福爾馬林溶液固定24 h,常規(guī)脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片(切片厚度為4 μm),HE染色。

1.3.4 ELISA

于EP管中收集全血后靜置30 min,離心,取上層血清,按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測血清中GLP-1的含量。

1.3.5 Real-time PCR

稱取適量的肝組織、結(jié)腸組織,在無菌無酶條件下,用M5 Total RNA Extraction Reagent試劑盒提取總的RNA,然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)合成cDNA,最后使用2×M5 HiPer SYBER Premix EsTaq對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃30 s,1個循環(huán);95℃5 s,60℃20 s,40個循環(huán)。β-actin上游引物序列為5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’,下游引物為5’-GCTGTGGTGGTGAAGCTGTa-3’;GLP-1上游引物序列為5’-CATCGTGGCTGGATTGTTTG-3’,下游引物序列為5’-GAATGGCGTTTGTCTTCGTTTa-3’;SREBP-1c的上游引物序列為5’-CTGCTTGGC TCTTCTCTTT-3’,下游引物序列為5’-CTTGTTTGC GATGTCTCC-3’。

1.3.6 圖像采集

使用OLYMPUS光學(xué)顯微照相系統(tǒng)采集組織學(xué)圖片,使用Image J軟件對組織學(xué)結(jié)果進(jìn)行光密度測定,GraphPad Prism 5.0軟件制作統(tǒng)計圖。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析,多組間對比采用單因素方差分析,實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化及腹膜后脂肪的重量

與對照組相比,在8周之后,模型組小鼠體重呈增加趨勢,12、16、20和24周末體重增加(圖1A,P＜0.05),高蛋白組與模型組相比,體重顯著降低(圖1A,P＜0.01),低蛋白組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義;24周末,與對照組相比,模型組小鼠腹膜后脂肪重量增加(圖1B,P＜0.05),高蛋白組與模型組相比,脂肪重量明顯降低(圖1B,P＜0.001),低蛋白組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 小鼠體重及腹膜后脂肪的重量Note.A,Body weight.B,Retroperitoneal fat wight.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the OVX group,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 1 Weight of body and retroperitoneal fat

2.2 小鼠肝、腹膜后脂肪組織HE染色

對照組小鼠肝細(xì)胞僅見少量脂滴(圖2A),模型組小鼠肝細(xì)胞排列松散,肝細(xì)胞內(nèi)可見大量脂滴,出現(xiàn)脂肪變性(圖2B);高蛋白組肝細(xì)胞內(nèi)可見微量脂滴,脂肪變性明顯改善(圖2C);低蛋白組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴增大、胞漿疏松(圖2D);相比于對照組,模型組腹膜后脂肪細(xì)胞體積明顯增大(圖2E、2F),高蛋白組脂肪細(xì)胞體積回縮(圖2G),而低蛋白組變化不明顯(圖2H)。

圖2 小鼠肝和腹膜后脂肪組織HE染色Figure 2 HE staining of mice liver and retroperitoneal adipose tissue

2.3 小鼠血清中GLP-1的含量

與對照組相比,模型組血清中GLP-1含量降低(圖3,P＜0.05),高蛋白組與模型組相比,血清中GLP-1含量顯著升高(圖3,P＜0.001),低蛋白與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 小鼠血清中GLP-1的含量Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the OVX group,###P＜0.001.Figure 3 GLP-1 content in serum of mice

2.4 小鼠結(jié)腸組織GLP-1 mRNA以及肝組織中SREBP-1 cmRNA的表達(dá)

與對照組相比,模型組結(jié)腸組織GLP-1 mRNA表達(dá)量減少(圖4A,P＜0.05),高蛋白組與模型組相比GLP-1 mRNA表達(dá)量增加(圖4B,P＜0.01),低蛋白組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在肝中,與對照組相比,模型組SREBP-1c mRNA表達(dá)量增加(圖4C,P＜0.05),高蛋白組相比模型組SREBP-1c mRNA表達(dá)量減少(圖4D,P＜0.001)低蛋白組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 小鼠結(jié)腸組織GLP-1和肝SREBP1-c的mRNA的表達(dá)Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the OVX group,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 4 Expression of GLP-1mRNA in colon tissues and SREBP-1c mRNA in liver of mice

2.5 小鼠肝組織中SREBP-1c蛋白的表達(dá)

相比于對照組,模型組肝組織中棕黃色顆粒染色較深(圖5A、5B、5E,P＜0.01,提示SREBP-1c蛋白表達(dá)增多);與模型組相比,高蛋白組染色較淺(圖5B、5C、5E,P＜0.01,SREBP-1c蛋白表達(dá)減少),低蛋白組(圖5D)改善不明顯。

圖5 小鼠肝SREBP-1c免疫組織化學(xué)染色Note.A,Control group.B,OVX group.C,OVX+HP group.D,OVX+LP group.E,Mean optical density value.Compared with the control group,**P＜0.01.Compared with the OVX group,##P＜0.01.Figure 5 Immunohistochemical staining of mouse liver tissue SREBP-1c

3 討論

雌激素是參與機(jī)體物質(zhì)能量代謝的重要激素,其作用主要由雌激素受體(ER)介導(dǎo)[14]。在靶細(xì)胞中,ER以多蛋白的抑制性復(fù)合體形式存在,其與雌激素結(jié)合后,發(fā)生同源二聚體化,結(jié)合靶基因上的雌激素反應(yīng)元件,促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄[2]。在下丘腦中,雌激素與下丘腦ERα受體結(jié)合,刺激下丘腦神經(jīng)元釋放厭食神經(jīng)肽以及抑制攝食神經(jīng)肽兩種基因的表達(dá)。卵巢切除后的小鼠由于雌激素下降,引起食欲增加、基礎(chǔ)代謝率降低、能量消耗減少,導(dǎo)致肥胖[15]。另外,雌激素可以通過增強(qiáng)過氧化物酶增殖受體γ的表達(dá)促進(jìn)脂肪代謝,下調(diào)氧化物酶增殖受體γ2的表達(dá)減少脂肪含量改善胰島素敏感性。雌激素還可以抑制腹膜脂肪基因的表達(dá),減少腹內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖分化,從而影響身體脂肪的分布[16-17]。卵巢切除的大鼠,內(nèi)臟白色脂肪含量增加,容易發(fā)生肥胖,腹腔注射雌激素后肥胖和內(nèi)臟脂肪得到改善[18]。這與本課題組在24周觀察的結(jié)果一致,相比對照組,模型組體重、腹膜后脂肪重量增加,HE染色觀察到脂肪細(xì)胞擴(kuò)張。

肝是體內(nèi)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要器官之一,絕經(jīng)后女性由于體內(nèi)雌激素的減少發(fā)生非酒精性脂肪肝的機(jī)率明顯升高[6]。在肝脂質(zhì)代謝方面,雌激素發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用,雌激素與肝ER受體結(jié)合,上調(diào)SHP表達(dá),抑制下游SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄。另外,雌激素也可以通過膜受體介導(dǎo)的快速非基因信號AMPK通路抑制SREBP-1a的核定位,從而減少SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄,減少肝脂質(zhì)合成[19]。SREBP-1c是肝甘油三酯合成的關(guān)鍵基因,在非酒精性脂肪肝的形成中具有重要作用。SREBP-1c的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,可以激活下游脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶、酯酰輔酶A去飽和酶等,從而使肝脂質(zhì)合成增加導(dǎo)致肝脂肪變性[5]。本實驗結(jié)果顯示:切除卵巢后的模型組相比于對照組,肝組織中SREBP-1c的mRNA表達(dá)升高,SREBP-1c蛋白表達(dá)增多,肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴聚集。

GLP-1是在食物刺激下由腸道L細(xì)胞分泌的腸道肽類激素,其生物學(xué)功能包括:刺激胰島素分泌,保護(hù)胰島β細(xì)胞;延緩胃排空和腸蠕動;抑制食欲等。其受體廣泛分布于除胰島外的組織,包括腎、心臟、肝以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[20]。因此,越來越多的學(xué)者開始研究其發(fā)揮降糖、減輕胰島素抵抗之外的作用。據(jù)報道,腸道L細(xì)胞主要位于空腸和結(jié)腸,并且L細(xì)胞中存在GLP-1和促性腺激素釋放激素共同分泌的現(xiàn)象,但是GLP-1與雌激素的關(guān)系尚不明確[21]。GLP-1改善肝脂代謝的可能機(jī)制:減少了肝脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白的表達(dá),在Ding等[22]的研究中,GLP-1受體激動劑可以增強(qiáng)脂肪酸氧化基因的表達(dá),增加脂肪酸的β氧化,同時抑制脂質(zhì)合成相關(guān)基因SREBP-1c、硬脂酰輔酶A去飽和酶1的轉(zhuǎn)錄,明顯改善肥胖小鼠的肝脂肪變性;GLP-1受體激動劑使非酒精性脂肪肝小鼠AMPK磷酸化增加,抑制SREBP-1c的表達(dá)[23]。侯洪濤等[24]報道,GLP-1能夠抑制JAK-STAT通路中信號因子的表達(dá),下調(diào)高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄,減輕高脂飲食大鼠肝脂質(zhì)的聚集,治療非酒精性脂肪肝,而非酒精性脂肪肝患者血漿中GLP-1含量減少[25]。本實驗觀察到:與對照組相比,模型組小鼠結(jié)腸組織中GLP-1mRNA的表達(dá)量下降,血清中GLP-1含量減少,肝中SERBP-1c的mRNA表達(dá)上調(diào),提示由于OVX小鼠雌激素缺乏,腸道L細(xì)胞分泌GLP-1減少、肝細(xì)胞內(nèi)大量脂滴聚集。前人研究發(fā)現(xiàn)高蛋白飲食能夠促進(jìn)腸道分泌GLP-1[26],我們在給予OVX小鼠高蛋白飲食飼養(yǎng)后,小鼠結(jié)腸組織中GLP-1mRNA表達(dá)明顯升高,血清中GLP-1含量增加,肝中SERBP-1c的mRNA和蛋白表達(dá)減少,肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性明顯減輕。另有研究表明,GLP-1亦可以減少高脂飲食喂養(yǎng)小鼠腹部等部位脂肪的聚集[27],這與本研究結(jié)果一致,長期高蛋白飲食可顯著改善卵巢切除后引起的腹膜后脂肪聚集以及脂肪細(xì)胞體積脹大。

綜上所述,OVX小鼠出現(xiàn)體重增加、腹部脂肪堆積、肝脂質(zhì)聚集,在長期高蛋白飲食飼養(yǎng)后,以上癥狀得到明顯改善,而低蛋白飲食效果不明顯。其相關(guān)機(jī)制可能與高蛋白飲食促進(jìn)腸道L細(xì)胞分泌GLP-1增加、下調(diào)肝中SERBP-1c及蛋白的表達(dá),發(fā)揮類似雌激素的作用有關(guān)。