王立俠韓金芬

(1.鄭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)電生理室,鄭州 450000;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院兒內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 453003)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種神經(jīng)退行性疾病,多發(fā)于老年群體,目前發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚[1]。有研究表明,細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激等多種因素參與了帕金森病的病 理 機(jī) 制[2-3]。枸 杞 多 糖(Lycium barbarumpolysaccharide,LBP)是從枸杞中提取出來的一種水溶性多糖,具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等多種功能[4-5]。有研究顯示,枸杞多糖可降低帕金森小鼠中腦氧化應(yīng)激損傷及對(duì)黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元起保護(hù)作用[6];枸杞多糖可通過ROS-NO途徑降低6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡[7]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)尿路上皮癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(urothelial cancer associated 1,UCA1)基因定位于19p13.12染色體,其表達(dá)高度體現(xiàn)在心臟、子宮和膀胱的胚胎發(fā)育過程中。目前UCA1在帕金森病中的研究較少,有研究顯示,lncRNA UCA1可通過調(diào)控SNCA促進(jìn)帕金森病進(jìn)展[8]。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)可通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激及損傷線粒體兩種方式選擇性破壞中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元,目前廣泛用于建立帕金森病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚9]。本研究使用MPP+誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y建立帕金森病體外細(xì)胞模型,旨在研究枸杞多糖及l(fā)ncRNA UCA1單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡保護(hù)作用及可能的分子機(jī)制,為帕金森病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y購自美國ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗均購自美國Gibco公司;枸杞多糖(由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖成分組成;純度≥50%)購自上海源葉生物科技有限公司;MPP+、MTT及DMSO均購自美國Sigma公司;Annexin VFITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒、PCR試劑盒、LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司;2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)活性氧檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購自中國碧云天生物技術(shù)研究所;Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax抗體均購自美國Abcam;酶標(biāo)儀(550型)購自美國Bio-rad公司;流式細(xì)胞儀(FACSCanto II型號(hào))購自美國BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺及1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基,放置于37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡下定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài),細(xì)胞貼壁80%～90%達(dá)到對(duì)數(shù)生長期時(shí),胰酶消化細(xì)胞,按照1∶3傳代。選擇生長狀態(tài)良好的第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MPP+及枸杞多糖作用濃度的篩選

以5×103個(gè)/孔接種生長至對(duì)數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞于96孔板,于37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,使用MPP+(終濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L的MPP+處理細(xì)胞24 h)、枸杞多糖(50、100、200、400 μg/mL的枸杞多糖[7]預(yù)處理細(xì)胞1 h后加MPP+繼續(xù)處理24 h),設(shè)置僅加入等體積培養(yǎng)基的為對(duì)照組,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后,每孔加20 μL MTT液(5 g/L),常規(guī)孵育4 h,棄掉上清,每孔加150 μL DMSO,震蕩數(shù)次使結(jié)晶能夠充分溶解。全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm各孔的光密度值,計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)UCA1基因表達(dá)

收集經(jīng)0.25、0.5、1、2 mmol/L的MPP+處理24 h的SH-SY5Y細(xì)胞,TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,按照試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)UCA1和內(nèi)參GAPDH基因序列及引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列如下:UCA1 F 5’-TTTGCCAGCCTCAGCTTAAT-3’,R 5’-TTGTCCCCATTTTCCATCAT-3’;GAPDH F 5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCa-3’,R 5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’。

按照試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系和設(shè)置PCR程序,設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,GAPDH作為內(nèi)參基因。以所得Ct值,采用2-△△Ct公式計(jì)算UCA1基因相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組、處理及UCA1 siRNA轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(細(xì)胞不經(jīng)特殊處理)、MPP+組(1 mmol/L的MPP+處理細(xì)胞24 h)、枸杞多糖組(400 μg/mL的枸杞多糖預(yù)處理細(xì)胞1 h后加1 mmol/L的MPP+繼續(xù)處理24 h)、si-UCA1組(1 mmol/L的MPP+處理細(xì)胞后轉(zhuǎn)染UCA1siRNA)、枸杞 多 糖+si-UCA1組。siRNA轉(zhuǎn) 染 參 照LipofectamineTM2000說明書。轉(zhuǎn)染前1 d接種生長至對(duì)數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞于6孔板,接種密度為105個(gè)/孔,細(xì)胞生長達(dá)70%匯合度時(shí),將UCA1 siRNA(si-UCA1)及陰性對(duì)照組(si-NC組)轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h,采用qRT-PCR檢測(cè)UCA1基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集上述分組處理后的細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌2次,加入300 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,避光環(huán)境分別加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI,室溫孵育15～20 min。上機(jī)前再加入300 μL的結(jié)合緩沖液,1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ROS水平

收集按照上述分組處理后的細(xì)胞,棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液。加入培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,離心,棄掉上清。加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA500 μL,避光孵育20 min。加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞3遍,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位

收集按照上述分組處理后的細(xì)胞,加入500 μL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,然后加入500 μL的JC-1染色工作液,混勻,于37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育20 min,離心,棄掉上清。1×的JC-1染色工作液清洗細(xì)胞2次,離心,去掉上清。500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8 Western blot檢測(cè)Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

收集按照上述分組處理后的細(xì)胞,每孔加細(xì)胞裂解液200 μL,4℃搖床快速震蕩10 min,離心,取上清。BCA法測(cè)定總蛋白含量?？偟鞍着c5×loading buffer混勻,100℃水浴鍋10 min。在膠泳道中加30 μg變性蛋白,經(jīng)電泳(恒壓100 V,3 h)、轉(zhuǎn)PVDF膜(200 mA,3 h)后,將轉(zhuǎn)好的膜浸泡在5%脫脂奶粉中,封閉1 h。加入一抗(1∶500),4℃孵育過夜,TBST洗膜。加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1000),室溫孵育3 h,TBST洗膜。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對(duì)膜進(jìn)行成像分析,Image J軟件分析灰度值。以目的蛋白Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值為各蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組差異比較采用單因素方差分析,兩兩比較采SNK-q檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖及UCA1表達(dá)的影響

以對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%及UCA1基因表達(dá)為1計(jì)算,隨著MPP+作用濃度增加,當(dāng)細(xì)胞處理24 h后,細(xì)胞存活率呈現(xiàn)出下降趨勢(shì),UCA1基因表達(dá)升高,其中0.5～2 mmol/L的MPP+與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。0.25 mmol/L MPP+處理后的細(xì)胞存活率及UCA1基因表達(dá)與對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。由于在MPP+作用濃度為1 mmol/L時(shí),細(xì)胞存活率為(49.02±4.23)%,因此選擇1 mmol/L為MPP+的為最佳損傷濃度。見表1。

表1 MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖及UCA1表達(dá)的影響Table 1 Effect of MPP+on the proliferation of SH-SY5Y cells and the expression of UCA1

2.2 枸杞多糖對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響

MPP+損傷后的細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組[(49.23±1.88)%比(100.00±2.12)%,P＜0.05];使用100、200、400 μg/mL枸杞多糖干預(yù)后,細(xì)胞存活率顯著升高[(56.97±2.15)%、(65.18±2.23)%、(77.25±3.11)%比(49.23±1.88)%,P＜0.05],而50 μg/mL枸杞多糖對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率無顯著影響[(49.88±1.74)%比(49.23±1.88)%,P＞0.05]。選擇400 μg/mL的枸 杞多糖進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 枸杞多糖及si-UCA1單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡的影響

SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA后,UCA1表達(dá)顯著低于對(duì)照組(0.255±0.026比1.000±0.026,P＜0.05),si-NC組UCA1表達(dá)與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.995±0.018比1.000±0.026,P＞0.05)。與對(duì)照組比較,MPP+組細(xì)胞存活率顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)。與MPP+組比較,LBP組和si-UCA1組細(xì)胞存活率顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05)。與LBP組或si-UCA1組比較,LBP+si-UCA1組細(xì)胞存活率顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05)。見圖1、表2。

表2 枸杞多糖及si-UCA1單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡的影響Table 2 Effect of Lycium barbarum polysaccharide and si-UCA1 alone or in combination on proliferation and apoptosis of SH-SY5Y cells induced by MPP+

圖1 枸杞多糖及si-UCA1單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡的影響Figure 1 Effect of Lycium barbarum polysaccharide and si-UCA1 alone or in combination on proliferation and apoptosis of SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.4 枸杞多糖及si-UCA1單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響

DCF熒光強(qiáng)度可間接反映ROS水平。與對(duì)照組比較,MPP+組DCF熒光強(qiáng)度顯著升高(88.67±4.32比45.12±2.01,P＜0.05),說明MPP+可提高SH-SY5Y細(xì)胞中ROS水平。與MPP+組比較,LBP組和si-UCA1組DCF熒光強(qiáng)度顯著降低(63.56±2.81、68.74±3.13比88.67±4.32,P＜0.05),說明LBP或UCA1 siRNA可降低MPP+誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞中ROS水平。與LBP組或si-UCA1組比較,LBP+si-UCA1組ROS水平顯著降低(52.34±2.71比63.56±2.81、68.74±3.13,P＜0.05),說明LBP及UCA1 siRNA聯(lián)合可增強(qiáng)二者單獨(dú)作用對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中ROS水平的抑制作用。

2.5 枸杞多糖及si-UCA1單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞膜電位影響

紅/綠熒光比可直接的反映出線粒體膜電位的變化。與對(duì)照組比較,MPP+組紅/綠熒光比顯著降低(0.44±0.04比1.62±0.11,P＜0.05),說明MPP+可降低SH-SY5Y細(xì)胞膜電位。與MPP+組比較,LBP組和si-UCA1組紅/綠熒光比顯著升高(1.01±0.08、0.82±0.07比0.44±0.04,P＜0.05),說明LBP或UCA1 siRNA可提高M(jìn)PP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞膜電位。與LBP組或si-UCA1組比較,LBP+si-UCA1組紅/綠熒光比顯著升高(1.41±0.09比1.01±0.08、0.82±0.07,P＜0.05),說明LBP及UCA1 siRNA聯(lián)合可增強(qiáng)二者單獨(dú)作用對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞膜電位的促進(jìn)作用。

2.6 枸杞多糖及si-UCA1單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax表達(dá)影響

與 對(duì) 照 組 比 較,MPP+組Cyt-C、caspase3、caspase9和Bax表達(dá)顯著升高,Bcl-2表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。與MPP+組比較,LBP組和si-UCA1組Cyt-C、caspase3、caspase9和Bax表達(dá)顯著降低,Bcl-2表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。與LBP組或si-UCA1組比較,LBP+si-UCA1組Cyt-C、caspase3、caspase9和Bax表達(dá)顯著降低,Bcl-2表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。見圖2、表3。

表3 Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax的蛋白相對(duì)表達(dá)量Table 3 Relative protein expression of Cyt-C,caspase3,caspase9,Bcl-2 and Bax

圖2 枸杞多糖及si-UCA1單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)影響Figure 2 Effect of Lycium barbarum polysaccharide and si-UCA1 alone or in combination on the protein expression of Cyt-C,caspase3,caspase9,Bcl-2 and Bax in SH-SY5Y cells induced by MPP+

3 討論

MPP+是一種神經(jīng)毒素,可通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I,導(dǎo)致線粒體功能障礙、氧自由基大量產(chǎn)生及線粒體ATP缺失和膜電位降低,引起細(xì)胞損傷,最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡,目前常用于建立帕金森病細(xì)胞模型[10-11]。SH-SY5Y細(xì)胞是一種分化程度很低的腫瘤細(xì)胞,與正常神經(jīng)細(xì)胞有相似的細(xì)胞形態(tài)及生理生化功能,且生長繁殖較快,目前已廣泛用于帕金森病、阿爾茲海默癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型[12-13]。本研究使用0.25～2 mmol/L的MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)1 mmol/L的MPP+可抑制近一半的細(xì)胞增殖,因此選擇1 mmol/L的MPP+為最佳損傷濃度。50、100、200、400 μg/mL的枸杞多糖處理經(jīng)1 mmol/L的MPP+損傷的SH-SY5Y細(xì)胞,細(xì)胞存活率呈劑量依賴升高,選擇400 μg/mL的枸杞多糖作為研究濃度。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn),帕金森病發(fā)病與線粒體損傷密切相關(guān)[14]。當(dāng)線粒體呼吸鏈?zhǔn)艿揭种茣r(shí),可引起跨膜電位的改變、Cyt-C及凋亡相關(guān)的caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白釋放,最終引起細(xì)胞凋亡[15]。Cyt-C是一種信號(hào)物質(zhì),正常情況下存在于線粒體內(nèi)外膜的腔中,當(dāng)有凋亡信號(hào)刺激時(shí),可從線粒體中釋放至胞漿,引起caspase9、caspase3活化,從而觸發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16]。Bcl-2是一個(gè)抑凋亡蛋白,Bax為促凋亡蛋白,Bcl-2主要存在于線粒體外膜上,可通過直接或間接阻止Cyt-C從線粒體中釋放出來,從而抑制caspase9的活化[17-18]。當(dāng)Cyt-C缺乏時(shí),可引起ATP合成減少及ROS產(chǎn)生過度。ROS有高氧化活性,病理?xiàng)l件下,胞內(nèi)大量的ROS堆積可引起DNA損傷,引起代謝系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,MPP+可抑制SHSY5Y細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,降低細(xì)胞膜電位,上調(diào)促凋亡蛋白Cyt-C、caspase3、caspase9和Bax表達(dá),下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),這與Ramalingam等[12]研究吻合,表明帕金森病細(xì)胞模型構(gòu)建成功。枸杞多糖處理可顯著逆轉(zhuǎn)MPP+誘導(dǎo)的上述改變,與Cao等[19]報(bào)道對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷和凋亡的保護(hù)作用一致。UCA1已被證與多種細(xì)胞損傷相關(guān),Tian等[20]研究顯示缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中UCA1表達(dá)增加,UCA1 siRNA可提高細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡,減輕缺氧損傷;Zhao等[21]證實(shí)UCA1 siRNA可增強(qiáng)脂多糖誘導(dǎo)的人胚肺WI-38細(xì)胞活力,緩解細(xì)胞凋亡和炎癥損傷。本研究發(fā)現(xiàn),UCA1 siRNA可抑制MPP+誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞ROS產(chǎn)生和凋亡,且枸杞多糖和UCA1 siRNA聯(lián)用的保護(hù)作用更明顯。以上研究表明,枸杞多糖及UCA1 siRNA通過線粒體凋亡途徑降低MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。然而,本文僅是細(xì)胞模型研究,這與整體動(dòng)物特別是人體間可能存在一定差異,枸杞多糖及UCA1 siRNA的作用尚需進(jìn)一步的觀察驗(yàn)證。

綜上所述,枸杞多糖及抑制UCA1表達(dá)均可促進(jìn)由MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率,抑制細(xì)胞凋亡,兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞存活率及凋亡率影響更明顯,機(jī)制可能與抑制線粒體凋亡途徑有關(guān),提示枸杞多糖及UCA1基因聯(lián)合使用可能是帕金森病治療的新途徑。