蘇維娜李曉晶張麗麗包志偉

(1.山東師范大學(xué)校醫(yī)院檢驗科,濟南 250014;2.山東中醫(yī)藥研究院,濟南 250014;3.山東省臨沂市沂水人民醫(yī)院檢驗科,山東 臨沂 276400;4.江漢大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科,武漢 430056)

結(jié)核分枝桿菌感染是肺結(jié)核發(fā)病的主要原因。結(jié)核分枝桿菌感染每年奪去近150萬人的生命,是目前全球死亡人數(shù)最高的病原體感染疾病之一[1-2]。由于老年人免疫功能紊亂,從而導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)病率遠高于成年人[3]。

肺泡上皮細胞包括I型肺泡上皮細胞和II型肺泡上皮細胞[4]。其中Ⅱ型肺泡上皮細胞數(shù)量多,具有增殖功能,可通過增殖,并分化形成I型肺泡上皮細胞,修復(fù)肺部損傷[5-6]。另有研究表明II型肺泡上皮細胞具有重要的免疫調(diào)控作用,可對抗結(jié)核分枝桿菌感染[7]。

MicroRNA(miRNA)可影響結(jié)核病患者免疫功能[8]。miRNA是一類內(nèi)源性,可調(diào)控多項生命活動的非編碼RNA[9]。miRNA的異常表達與結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展存在密切的關(guān)聯(lián),在宿主抵抗結(jié)核分枝桿菌的過程中具有重要的調(diào)控作用[10-11]。根據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn),miR-214在發(fā)生肺損傷后的Ⅱ型肺泡上皮細胞中異常表達[12],因此推測miR-214會影響免疫功能,但目前尚無研究報道m(xù)iR-214對結(jié)核分枝桿菌感染的Ⅱ型肺泡上皮細胞的調(diào)控作用。miRNA可以調(diào)節(jié)基因和蛋白質(zhì)的表達。且miRNA可通過影響下游靶基因的表達,進而調(diào)控機體生命活動[13-14]。在胃癌中,miR-214可通過靶向抑制FGF9,調(diào)控胃癌細胞遷移和侵襲[15]。網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_71/)顯示miR-214和FGF9之間存在結(jié)合位點。在炎癥環(huán)境下,FGF9對組織具有保護作用[16],在結(jié)核分枝桿菌感染的Ⅱ型肺泡上皮細胞中,FGF9是否具有保護作用尚未可知。

在本研究中,通過使用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv感染Ⅱ型肺泡上皮細胞A549,并分別轉(zhuǎn)染miR-214和FGF9等載體,旨在探究miR-214和FGF9對結(jié)核分枝桿菌感染的Ⅱ型肺泡上皮細胞的免疫調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 細胞

II型肺泡上皮細胞系A(chǔ)549,購自ATCC庫。

1.2 主要試劑與儀器

轉(zhuǎn)染所用載體均購自武漢伯遠生物科技有限公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑貨號為11668019,購自ThermoFisher公司;RIPA裂解液貨號為SJH0994,購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號D7168 S;Premix購自TaKaRa(中國大連分公司);鼠一抗信息如下:FGF9(ab215908,abcam,USA)、PI3K(ab140307,abcam,USA)、AKT(4691,CST Signaling,USA)、p-AKT(9614,CST Signaling,USA)、GAPDH(CW0100 M,康為世紀(jì),康為世紀(jì)生物科技有限公司,中國);二抗IgG(ab6789,Abcam,USA);Rellina質(zhì)粒購自上海吉滿生物科技有限公司;雙熒光素酶報告試劑盒購自Promega;SP-A、SPD含量的ELISA試劑盒購自睿信生物科技有限公司;測定TLR2、TLR4含量所用的試劑盒購自Merck公司;IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-8試劑盒購自abcam公司。

bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影(MG8600,北京托摩根生物科技有限公司,北京,中國);分光光度計(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA);IPP7.0軟件(Media Cybernetics,Singapore)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

II型肺泡上皮細胞系A(chǔ)549保存在EMEM培養(yǎng)基中,并加入2 mL谷氨酰胺和5%(v/v)FBS。細胞在37℃下在含有50 ng/mL PMA的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h,然后進行后續(xù)處理。

1.3.2 結(jié)核分枝桿菌感染A549細胞

BCG和H37Rv培養(yǎng):結(jié)核分枝桿菌BCG和H37Rv在添加0.5%(v/v)甘油、0.05%(v/v)Tween 80、0.5%(w/v)牛血清白蛋白和0.085%(w/v)NaCl的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。并加入50 mg/mL卡那霉素維持菌株的生長。

將BCG和H37Rv置于7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細菌生長至OD600為1.0,在5000 r/min下離心5 min,去除7H9液體培養(yǎng)基。在RPMI 1640培養(yǎng)基中再懸浮菌株。分散A549細胞并計數(shù)。將細胞置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長融合至50%,更換新RPMI 1640培養(yǎng)基,并將重懸的菌株加入培養(yǎng)基中。

1.3.3 細胞分組

對A549細胞進行分組,并進行H37Rv感染:NC mimic+oe-NC(陰性對照)、miR-214 mimic+oe-NC(miR-214過表達)、NC mimic+oe-FGF9(FGF9過表達)、miR-214 mimic+oe-FGF9(miR-214和FGF9同時過表達)。將A549細胞分別以1×106細胞/孔接種于6孔板中過夜,使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑,按照試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后,進行H37Rv感染。

1.3.4 qRT-PCR

采用qRT-PCR檢測miR-214和FGF9的表達情況。取感染后48 h細胞,棄培養(yǎng)基,使用冷PBS清晰2次。TRIzol法提取細胞RNA。取5 μL RNA樣品,用無RNA酶超純水稀釋20倍,讀取其在紫外分光光度計260 nm和280 nm處的吸收值,測定RNA的濃度和純度,OD260/OD280比值檢測純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在PCR擴增儀進行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)合成cDNA模版,由上海生工生物工程股份有限公司合成所需qPCR引物,引物信息見表1。qPCR反應(yīng)總體系為10 μL,反應(yīng)成分包括:5 μL 2×SYBR Premix,cDNA模板1 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O 3 μL。qPCR程序為:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性30 s,退火20 s,72℃延伸30 s,40個循環(huán)。FGF9以GAPDH為內(nèi)參,miR-214以U6為內(nèi)參。2-△△Ct表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關(guān)系:△△CT=△Ct實驗組-△Ct對照組。Ct為反應(yīng)的實時熒光強度達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù),此時擴增是呈對數(shù)期增長。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5 Western blot

收集各組細胞,加入含有10%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,將細胞樣品移至1.5 mL離心管中,5000 r/min離心10 min取上清,用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度后保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｈ缓笫褂肧DS-PAGE凝膠試劑盒配制12%分離膠和濃縮膠,在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白后采用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上,5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h。滴加稀釋的FGF9、PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH一抗鼠抗。4℃過夜,次日用PBST洗膜3次,每次10 min,孵育鼠二抗IgG,室溫置于搖床振蕩2 h,再次用PBST洗膜3次,每次10 min。加入顯影劑并通過bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影,使用IPP 7.0軟件進行定量分析。

1.3.6 雙熒光素酶報告

使用生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測miR-214和FGF9的結(jié)合位點,通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-214和FGF9的靶向關(guān)系。構(gòu)建靶基因FGF9雙熒光素酶報告基因載體與miR-214結(jié)合位點突變的突變體:FGF9 wt和FGF9 mut。將Rellina質(zhì)粒和兩種報告質(zhì)粒分別與miR-214 mimic和NC mimic質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293 T(ATCC)細胞中。在細胞轉(zhuǎn)染24 h后,進行雙熒光素酶檢測。首先將各組細胞裂解,裂解后以12000 r/min離心1 min,去沉淀,收集上清液。按照雙熒光素酶報告試劑盒操作,測量熒光素酶活性。操作步驟如下:將裂解后的細胞樣品吸入EP管中,每10 μL樣品中螢火蟲熒光素酶工作溶液100 μL,測得螢火蟲熒光素酶之后加入海腎熒光素酶工作溶液100 μL,測得海腎熒光素酶結(jié)果。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶。

1.3.7 ELISA

收集各組細胞,檢測細胞中免疫相關(guān)因子SPA、SP-D、TLR2、TLR4,炎癥因子IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-8含量。按照試劑盒操作檢測各組細胞中SP-A、SP-D、TLR2、TLR4、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-8含量,根據(jù)操作說明書將樣品進行處理后,通過分光光度計,檢測各組樣品在450 nm處OD值,得到各組樣品中SP-A、SP-D、TLR2、TLR4、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-8含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件,兩組數(shù)據(jù)之間的比較使用t檢驗比較,而多組之間的單因素比較采用one-way ANOVA分析,多因素采用two-way ANOVA分析,所有數(shù)據(jù)均表示為至少3個獨立實驗的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。對于偏態(tài)分布數(shù)據(jù),采用非參數(shù)檢驗確定統(tǒng)計顯著性。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-214在經(jīng)結(jié)核分枝桿菌感染的肺泡Ⅱ型細胞表達上調(diào),FGF9表達下調(diào)

培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌減毒株BCG和標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv,并分別感染A549細胞。qRT-PCR檢測感染后細胞中miR-214、FGF9的表達情況(圖1A),Western blot檢測FGF9蛋白的表達情況(圖1B、1C)。結(jié)果顯示和未經(jīng)感染和BCG感染后相比,H37Rv感染后,A549細胞中miR-214表達顯著升高,而FGF9 mRNA和蛋白表達則顯著降低。

圖1 miR-214、FGF9在經(jīng)結(jié)核分枝桿菌感染的肺泡Ⅱ型細胞中的表達情況Note.A,qRT-PCR was used to detect the expression of miR-214 and FGF9.B,Protein banding.C,Expression of FGF9 was detected by Western blot.Compared with BCG group,*P＜0.05.Figure 1 Expression of miR-214 and FGF9 in alveolar type II cells infected by Mycobacterium tuberculosis

2.2 miR-214靶向抑制FGF9的表達

生信網(wǎng)站分析(http://www.targetscan.org/vert_71/)查詢到miR-214和FGF9存在結(jié)合位點(圖2A)。根據(jù)結(jié)合位點信息,構(gòu)建FGF9 wt和FGF9 mut報告載體,雙熒光素酶報告驗證miR-214和FGF9的靶向關(guān)系。結(jié)果顯示,和FGF9 mut共轉(zhuǎn)的兩組細胞熒光素酶活性無顯著差異。而NC mimic與FGF9 wt共轉(zhuǎn)細胞相比,miR-214 mimic與FGF9 wt共轉(zhuǎn)后,熒光素酶活性顯著降低(圖2B)。同時通過qRT-PCR檢測感染后細胞中miR-214、FGF9的表達情況(圖2C),Western blot檢測FGF9蛋白的表達情況(圖2D、2E)。結(jié)果顯示和NC mimic+oe-NC組相比,miR-214 mimic+oe-NC組miR-214表達顯著升高,FGF9 mRNA和蛋白表達均顯著降低;NC mimic+oe-FGF9組中miR-214表達無顯著變化,FGF9 mRNA和蛋白表達均顯著升高。和miR-214 mimic+oe-NC組相比,miR-214 mimic+oe-FGF9組miR-214表達無顯著變化,FGF9 mRNA和蛋白表達均顯著升高。

圖2 miR-214靶向抑制FGF9的表達Note.A,Predicted binding sites between miR-214 and FGF9.B,Double luciferase assay was used to analyze the targeting relationship between miR-214 and FGF9.C,Expression of miR-214 and FGF9 was detected by qRT-PCR.D,Protein banding.E,Expression of FGF9 was detected by Western blot.Compared with NC mimic group,*P＜0.05.Compared with NC mimic+oe-NC group,#P＜0.05.Compared with miR-214 mimic+oe-NC group,&P＜0.05.Figure 2 miR-214 inhibits the expression of FGF9

2.3 miR-214通過靶向FGF9參與結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞免疫反應(yīng)

為探究miR-214靶向FGF9,對結(jié)核分枝桿菌感染后,肺泡Ⅱ型細胞免疫反應(yīng)的影響,ELISA檢測各組細胞中SP-A、SP-D、TLR2、TLR4的含量(圖3)。結(jié)果顯示和NC mimic+oe-NC組相比,miR-214 mimic+oe-NC組SP-A、SP-D含量顯著降低,TLR2、TLR4含量顯著升高;NC mimic+oe-FGF9組中SP-A、SP-D含量顯著升高,TLR2、TLR4含量顯著降低。和miR-214 mimic+oe-NC組相比,miR-214 mimic+oe-FGF9組SP-A、SP-D含量顯著升高,TLR2、TLR4含量顯著降低。

圖3 miR-214通過靶向FGF9參與結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞免疫反應(yīng)Note.A,SP-A content was detected by ELISA.B,Content of SP-D was detected by ELISA.C,TLR2 was detected by ELISA.D,TLR4 was detected by ELISA.Compared with NC mimic+oe-NC group,*P＜0.05.Compared with miR-214 mimic+oe-NC group,#P＜0.05.Figure 3 miR-214 participates in alveolar type II cellular immune response to Mycobacterium tuberculosis infection by targeting FGF9

2.4 miR-214通過靶向抑制FGF9,促進結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞的炎癥反應(yīng)

ELISA檢測炎性因子IL-10、TNF-α、IL-1β、TNFγ的含量(圖4)。結(jié)果顯示,和NC mimic+oe-NC組相比,miR-214 mimic+oe-NC組IL-10含量顯著降低,TNF-α、IL-1β、TNF-γ含量顯著升高;NC mimic+oe-FGF9組中IL-10含量顯著升高,TNF-α、IL-1β、TNF-γ含量顯著降低。和miR-214 mimic+oe-NC組相比,miR-214 mimic+oe-FGF9組IL-10含量顯著升高,TNF-α、IL-1β、TNF-γ含量顯著降低。

圖4 miR-214通過靶向FGF9參與結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞的炎癥反應(yīng)Note.A,Content of IL-10 was detected by ELISA.B,TNF-α was detected by ELISA.C,Content of IL-1β was detected by ELISA.D,Content of TNF-γ was detected by ELISA.Compared with NC mimic+oe-NC group,*P＜0.05.Compared with miR-214 mimic+oe-NC group,#P＜0.05.Figure 4 miR-214 participates in the Inflammation of type II alveolar cells infected by Mycobacterium tuberculosis by targeting FGF9

2.5 miR-214靶向FGF9,影響結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞中PI3K/AKT信號通路表達

Western blot檢測各組細胞中PI3K/AKT信號通路成員PI3K、AKT、p-AKT的表達情況(圖5)。結(jié)果顯示,和NC mimic+oe-NC組相比,miR-214 mimic+oe-NC組PI3K、AKT/p-AKT表達水平顯著降低;NC mimic+oe-FGF9組PI3K、AKT/p-AKT表達水平顯著升高。和miR-214 mimic+oe-NC組相比,miR-214 mimic+oe-FGF9組PI3K、AKT/p-AKT表達水平顯著升高。

圖5 miR-214靶向FGF9,影響結(jié)核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型細胞中PI3K/AKT信號通路表達Note.A,Protein band diagram.B,Expression of PI3K and p-AKT/AKT was statistically analyzed.Compared with NC mimic+oe-NC group,*P＜0.05.Compared with miR-214 mimic+oe-NC group,#P＜0.05.Figure 5 miR-214 targets FGF9 and affects the expression of PI3K/Akt signaling pathway in alveolar type II cells infected by Mycobacterium tuberculosis

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種嚴(yán)重的健康問題[17]。據(jù)報道,全世界約有三分之一的人口受到結(jié)核分枝桿菌的感染,死亡率占感染性疾病的首位[18]。盡管目前已使用卡介苗作為全球唯一可用的結(jié)核病疫苗。但是卡介苗在對抗感染方面并沒有顯著的效果,且在發(fā)展中國家,結(jié)核病的發(fā)病率有明顯上升[19]。

結(jié)核分枝桿菌感染會引發(fā)機體免疫反應(yīng),隨著免疫反應(yīng)的增強,會促進下游識別受體,如TLR-2、TLR4的表達[20]。TLR-2、TLR4持續(xù)的異常表達會刺激下游促炎因子IL-1β、TNF-α、TNF-γ的表達,進而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[21]。炎癥發(fā)展對招募免疫細胞具有重要的作用,但同時會導(dǎo)致免疫紊亂,從而使炎癥進一步發(fā)展,導(dǎo)致機體損傷加重[22]。近期有研究發(fā)現(xiàn)II型肺泡上皮細胞具有免疫調(diào)控的作用[23]。II型肺泡上皮細胞具有合成和分泌表面活性物質(zhì)的功能,其中SP-A、SP-D是兩種常見的親水性表面活性物質(zhì)[24]。SP-A、SP-D是肺部重要的天然免疫防御分子,具有調(diào)節(jié)免疫和炎癥的作用[25]。SP-A、SPD可下調(diào)IL-1β、TNF-α等促炎因子的表達,同時抑制細胞因子的合成和釋放,促進抑炎因子的表達,進而抑制機體炎癥反應(yīng)[26]。miR-214屬于microRNA家族重要的成員之一。李丹等[27]研究報道顯示,miR-214過表達的缺血性急性腎損傷大鼠炎癥浸潤加重。本研究發(fā)現(xiàn)H37Rv感染A549細胞后,miR-214表達異常上調(diào),FGF9表達顯著下調(diào)。過表達miR-214會導(dǎo)致SP-A、SP-D、IL-10含量降低,TLR-2、TLR-4、TNF-α、IL-1β、TNF-γ含量顯著升高,呈現(xiàn)出對免疫反應(yīng)的過度激活和炎癥反應(yīng)的促進作用。FGF9表達會升高SP-A、SP-D、IL-10含量,降低TLR-2、TLR-4、TNF-α、IL-1β、TNF-γ含量。結(jié)果提示miR-214會導(dǎo)致免疫反應(yīng)過度激活,導(dǎo)致II型肺泡上皮細胞免疫反應(yīng)紊亂,導(dǎo)致炎癥的發(fā)展,而FGF9則與之相反。

有文獻表明miR-214和FGF9之間存在結(jié)合位點。因此,推測FGF9可能對感染后的II型肺泡上皮細胞具有調(diào)控作用。FGF9屬于FGFs家族成員之一。在腫瘤學(xué)領(lǐng)域,FGF9被認為是多類癌癥進展的重要介質(zhì),其在免疫領(lǐng)域的作用機制尚不明確。有研究認為FGF9的表達可促進II型肺泡上皮細胞的生長[28]。本研究通過雙熒光素酶報告、qRT-PCR和Western檢測也證實miR-214可靶向抑制FGF9的表達。且過表達FGF9可阻斷miR-214對免疫反應(yīng)的過度激活和對炎癥反應(yīng)的促進作用。

PI3K/AKT信號通路可調(diào)節(jié)T細胞生長、分化、代謝等過程[29]。PI3K/AKT通路被抑制后,會促進Treg細胞的增殖以及活化,進而導(dǎo)致免疫逃逸。結(jié)核分枝桿菌可通過抑制PI3K/AKT信號通路的活化[30]。本研究結(jié)果顯示過表達miR-214會抑制PI3K/AKT信號通路的活化,過表達FGF9會促進PI3K/AKT信號通路的活化,且過表達FGF9可阻斷miR-214對PI3K/AKT信號通路的抑制作用。

綜上所述,miR-214可通過靶向抑制FGF9的表達,進而抑制PI3K/AKT信號通路的激活,導(dǎo)致經(jīng)結(jié)核分枝桿菌感染的II型肺泡上皮細胞免疫反應(yīng)紊亂,并促進細胞免疫反應(yīng)。本次研究進一步完善了結(jié)核病的發(fā)病機制,為預(yù)防結(jié)核病以及更有效治療結(jié)核病具有重要的指導(dǎo)作用。但目前的研究仍缺乏進一步的動物研究?？紤]到A549細胞屬于人類肺泡基底上皮細胞,與人和小鼠的同源性極高,有望成功得到進一步的體內(nèi)研究證實。