閆祎煒江 蓮李 梅張會(huì)芬沈 穎張文浩張文婷

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院兒科,石家莊 050000)

隨著早產(chǎn)兒診治水平不斷提高,早產(chǎn)兒的數(shù)量及存活率逐年提升,新生兒中早產(chǎn)兒發(fā)生率為7.8%,其中出生體重小于1500 g占32.3%,而呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生率為52.3%[1]。支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonory dysplasia,BPD)是早產(chǎn)、高氧損傷、機(jī)械通氣、感染等多種因素綜合作用引起的一種氧依賴疾病,是影響早產(chǎn)兒預(yù)后的重要因素,目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究表明,胎兒炎癥反應(yīng)綜合征(fetal inflammatory response syndrome,FIRS)與BPD明顯相關(guān),是不良新生兒結(jié)局的重要因素[2]。但是,FIRS能否確切導(dǎo)致BPD的發(fā)生機(jī)制尚不明確。尚有研究表明,FIRS介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子會(huì)明顯上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)的表達(dá)水平[3]。而高氧[4]、機(jī)械通氣[5]等因素導(dǎo)致的BPD模型中亦存在MMP-9水平升高。本研究通過臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以探討FIRS介導(dǎo)MMP-9誘發(fā)BPD的具體機(jī)制,為臨床治療提供新的靶點(diǎn)并發(fā)掘早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究人群

納入2018年5月～2019年12月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院出生的早產(chǎn)兒共118例,其中男性66例,女性52例,胎齡分布27+6周～36+5周,出生體重分布900～3600 g(表1)。依據(jù)胎齡及FIRS診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組,FIRS主要診斷指標(biāo)[6]:早產(chǎn)兒臍血IL-6＞11 pg/L,羊水CRP＞6 mg/L,胎盤和(或)臍帶病理存在炎性浸潤,羊水涂片可見炎性細(xì)胞聚集;輔助診斷指標(biāo):產(chǎn)婦發(fā)熱、心率＞100次/分,胎心＞160次/分,子宮壓痛,羊水嗅臭,外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)每升＞15×109個(gè)。對(duì)照組1(胎齡≤32周,非FIRS),n=25;對(duì)照組2(32周＜胎齡＜37周,非FIRS),n=32;研究組1(胎齡≤32周,FIRS),n=33;研究組2(32周＜胎齡＜37周,FIRS),n=28。排除母親分娩前存在妊娠合并非感染疾病、分娩過程中出現(xiàn)窒息缺氧以及合并者其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病患兒。

1.1.2 觀察指標(biāo)

留取斷臍后早產(chǎn)兒端臍靜脈血(2 mL)及胎盤組織。檢測(cè)臍血中的白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP-1)、MMP-9水平。制備胎盤組織切片觀察胎盤病理改變?；純弘S訪至28 d,明確是否發(fā)生BPD結(jié)局。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)使用45只清潔級(jí)10周齡昆明小鼠購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(冀)2018-004],其中雄鼠15只,體重35～40 g,雌鼠30只,體重30～35 g。小鼠飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(冀)2018-001],實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(1ACUC-4thHos Hebmu-2019006),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

人IL-6、MMP-9、TIMP-1、ELISA試劑盒購自艾萊薩生物科技有限公司(中國);維甲酸購自山東良福制藥;脂多糖購自Sigma公司;C-反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒購自上海捷門生物技術(shù)公司(中國);瑞姬氏染色液購自溫州康泰生物科技公司(中國);YXI-2離心機(jī)購自三洋公司(日本);全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(VERS Amax,美國);全自動(dòng)洗板機(jī)購自Sigma公司(Aw1,美國);-80℃超低溫冰箱購自SANYO公司(日本);電熱恒溫水浴箱購自上海森信實(shí)驗(yàn)有限公司(JY-17-1,中國);高精度加樣器及槍頭購自BBI公司(加拿大);顯微鏡購自O(shè)LYPUS公司(CX-21,日本);特定蛋白分析儀購自O(shè)LYPUS公司(Au2700,日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備與分組

飼養(yǎng)1周后將雌雄小鼠按2∶1合籠,次日清晨觀察到陰栓的雌鼠視為懷孕第1天。參照Rounioja等[7]制備FIRS小鼠模型(圖1),將孕鼠隨機(jī)分為3組,每組各10只,FIRS(lipopolysaccharide,LPS干預(yù))組、維甲酸(retinoic acid,RA干預(yù))組、生理鹽水(normal saline,NS干預(yù))組,孕15 d時(shí)LPS及RA組羊膜囊內(nèi)注射LPS,總量不超過100 μg/kg,NS組予等量NS羊膜囊注射,密切觀察孕鼠生命活動(dòng),注意有無感染、陰道流血流液及流產(chǎn)征象,RA組小鼠在孕17 d開始RA灌胃,劑量50 μg/kg,至分娩,將剖宮產(chǎn)及順產(chǎn)娩出的胎盤進(jìn)行病理檢查,胎盤組織存在炎性浸潤則認(rèn)為制模成功。本研究流產(chǎn)率10.00%,建模成功率為83.73%。

圖1 FIRS小鼠建模流程N(yùn)ote.A,Observation of the formation of vaginal suppository.B,In the 15th trimester of pregnancy,the amniotic sac was exposed by laparotomy,then the abdominal cavity was sutured after lipopolysaccharide injection.C,Pregnant mice were normal after drug injection.D,Pregnant mice were normal in birth.E,A large number of inflammatory cells were infiltrated in the placental tissue(HE)after delivery,and the villous structure disappeared,and edema and partial fibrosis were observed,and the modeling was successful.F,Normal placental tissue(HE).Figure 1 FIRS mice modeling process

1.3.2 標(biāo)本收集

隨機(jī)取3組3只孕19 d孕鼠,行剖宮產(chǎn)手術(shù),留取胎鼠的胎盤、肺組織,余孕鼠待自然分娩,分別于產(chǎn)后1、3、7、14 d處死仔鼠(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組n=10),均留取肺組織。

1.3.3 觀察指標(biāo)測(cè)定

采用Real-time PCR法測(cè)定肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平,HE染色觀察胎盤、肺組織病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)通過SPSS(21.0,IBM Support Forum)及GraphPad Prism(v8.2.1.441,San Diego,CA 92108)軟件進(jìn)行分析,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)比較,多組均數(shù)的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析,相關(guān)性分析采用Spearman’s線性相關(guān)。計(jì)數(shù)資料兩組資料比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

兩組患者在胎齡、性別、出生體重和Apgar評(píng)分均無顯著差異(P＞0.05)(表1)。

表1 一般資料Table 1 General characteristic

2.2 早產(chǎn)兒臍血中IL-6、MMP-9和TIMP-1表達(dá)水平

與對(duì)照組相比,同胎齡FIRS組IL-6、MMP-9、TIMP-1水平及M/T比值顯著增加(P＜0.01)。在FIRS1組和FIRS2組之間,IL-6、MMP-9和TIMP-1的水平以及M/T比值無顯著差異(P＞0.05)。對(duì)照組2中IL-6水平與對(duì)照組1中比較無顯著差異(P＞0.05)。對(duì)照組2中MMP-9和TIMP-1的水平顯著升高,而M/T比值顯著降低(P＜0.01)(表2)。

表2 不同組別臍血IL-6、MMP-9、TIMP-1、M/T比值水平比較Table 2 Levels of IL-6,MMP-9,TIMP-1 and M/T ratio in different groups

2.3 IL-6與MMP-9、TIMP-1和M/T比值之間的相關(guān)性

IL-6與MMP-9和TIMP-1及M/T的比例呈正相關(guān)(PMMP-9＜0.01,rMMP-9=0.58;PTIMP-1＜0.01,rTIMP-1=0.45;PM/T＜0.01,rM/T=0.44)(圖2)。

圖2 早產(chǎn)兒IL-6和MMP-9、TIMP-1及M/T比值之間的相關(guān)性Figure 2 Correlation between IL-6 and M/TMP-9,TIMP-1 and M/T ratio in preterm infants

2.4 早產(chǎn)兒胎盤組織的組織學(xué)檢查

對(duì)照組(圖3A)胎盤組織無明顯病理改變,絨毛膜羊膜炎病變多集中在絨毛膜部位,可見炎細(xì)胞浸潤(圖3B)。此外,急性炎癥組織呈現(xiàn)炎性細(xì)胞浸,伴組織充血及水腫(圖3C)。

圖3 胎盤組織(HE染色)Note.A,Normal placental tissue showed no obvious pathological changes.B,Chorionic tissue showed mild inflammatory cell infiltration.C,Acute inflammatory placental tissue showed congestion and edema,aggregation of neutrophils.Figure 3 Placental tissue(HE staining)

2.5 疾病結(jié)局

FIRS組BPD發(fā)生率高于同胎齡對(duì)照組(P＜0.05)(表3)。

表3 不同組中BPD發(fā)生率的比較Table 3 Incidence of BPD in different groups

2.6 仔鼠肺組織病理改變

程度明顯減輕(圖4)。

2.7 不同日齡FIRS鼠肺組織IL-6、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平

NS組為正常肺組織(圖4A1～D1)RA組(圖4A3～D3);FIRS組肺泡數(shù)目減少(圖4A2～D2),肺泡間隔減少、增厚,間質(zhì)部分及肺泡內(nèi)可見少量出血,部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞;RA組與FIRS組病變相似,

圖4 肺組織(HE染色)Note.A1～D1,Lung tissue of mice in the control group at 19 days of gestation,1,7 and 14 days after delivery.A2～D2,Lungs of mice in the control group at 19 days of gestation,1,7 and 14 days in the FIRS group tissue.A3～D3,Lung tissue of mice in the control group of RA group at 19 days gestation,1,7 and 14 days postpartum.Figure 4 Lung tissue(HE staining)

FIRS組:19日齡胎鼠及1、7、14日齡新生鼠IL-6、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平及M/T比值均明顯高于同日齡對(duì)照組(P＜0.01)。RA干預(yù)后:19日齡胎鼠及1、7、14日齡新生鼠IL-6、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平及M/T比值仍明顯高于同日齡對(duì)照組(P＜0.01),但該日齡胎鼠及新生鼠IL-6、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平及M/T比值則明顯低于同日齡FIRS組(P＜0.01)(表4)。

表4 不同日齡各組胎鼠/新生鼠肺組織IL-6、MMP-9、TIMP-1、M/T比值表達(dá)水平的比較(n=8)Table 4 Expression of IL-6,MMP-9,TIMP-1,M/T ratio of lung tissue of different groups in different time points

2.8 FIRS鼠肺組織IL-6與MMP-9、TIMP-1及M/T的相關(guān)性分析

小鼠肺組織中IL-6與MMP-9(PMMP-9＜0.01,rMMP-9=0.741)、TIMP-1(PTIMP-1＜0.01,rTIMP-1=0.677)及M/T呈正相關(guān)(PM/T=0.02,rM/T=0.410)(圖5)。

圖5 小鼠IL-6和MMP-9,TIMP-1以及M/T比值之間的相關(guān)性Figure 5 Correlation between mice IL-6 and MMP-9,TIMP-1 and M/T ratio

3 討論

早產(chǎn)是致使胎兒臟器發(fā)育不完全最重要的病因,據(jù)報(bào)道,早產(chǎn)與FIRS密切相關(guān)[8]。Helmo等[9]研究表明IL-6(＞11 pg/mL)是導(dǎo)致重大新生兒發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Rangel-Frausto等[10]通過檢測(cè)胎兒臍血細(xì)胞因子變化,結(jié)果顯示胎兒早產(chǎn)前IL-6水平明顯升高。而通過IL-6、IL-1β和TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)會(huì)刺激MMP的分泌[11-12],其中MMP-9是白細(xì)胞分泌的4型膠原酶,與胎膜損傷有關(guān)[13]。在本研究中,出現(xiàn)FIRS的新生兒臍帶血中IL-6、MMP-9、TIMP-1水平及M/T的比值明顯增加,且IL-6水平與MMP-9和TIMP-1水平以及M/T比值呈正相關(guān)。而上述炎性指標(biāo)對(duì)FIRS具有一定的診斷價(jià)值,是預(yù)測(cè)BPD發(fā)生率的有效指標(biāo)。

此外,筆者對(duì)胎齡的因素影響進(jìn)一步探討。既往研究報(bào)道,MMP-9水平似乎與胎齡有關(guān),未發(fā)生BPD的早產(chǎn)兒中,在妊娠33～36周時(shí)觀察到最高水平,而足月新生兒中TIMP-1水平最高[14]。Bednarek等[15]報(bào)道,早產(chǎn)兒的MMP-9水平和胎齡也明顯相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組2中MMP-9和TIMP-1的水平高于對(duì)照組1。但是,對(duì)照組2的M/T比值低于對(duì)照組1。同樣,FIRS組2中的M/T比值略低于FIRS組1。提示M/T比值與胎齡呈負(fù)相關(guān),這可能和胎齡增加肺部發(fā)育逐漸成熟相關(guān)。

尚有研究表明,BPD早產(chǎn)兒體內(nèi)的MMP-9和TIMP-1的水平明顯上調(diào)[14-15]。在本研究中,FIRS組1的BPD損傷的發(fā)生率均高于對(duì)照組1。但是,FIRS組2和對(duì)照組2的BPD發(fā)生率無顯著差異,這些結(jié)果表明BPD可能與胎齡也存在密切相關(guān)。Mittendorf等[16]報(bào)道的結(jié)果表明胎齡和低出生體重可能是BPD的主要風(fēng)險(xiǎn),和本研究結(jié)果一致。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)FIRS組1的BPD發(fā)生率高于FIRS組2。表明MMP-9和TIMP-1的水平與胎齡結(jié)合可能是預(yù)測(cè)BPD發(fā)生的更為精確的指標(biāo)。Fukunaga等[17]進(jìn)行的一項(xiàng)臨床研究結(jié)果顯示,在胎齡30周的嬰兒中,臍帶血中M/T的比例與BPD的發(fā)生明顯相關(guān),該研究結(jié)果和本研究一致。

此外筆者在小鼠動(dòng)物模型中驗(yàn)證了FIRS介導(dǎo)MMP-9上調(diào)誘發(fā)BPD的相關(guān)性并探討了藥物治療的可行性。建模成功后,小鼠胎盤病理顯示FIRS模型的胎盤組織可見大量炎細(xì)胞浸潤,絨毛結(jié)構(gòu)消失,組織水腫及部分纖維化。本研究結(jié)果顯示FIRS組小鼠可見IL-6、MMP-9、TIMP-1及M/T明顯高于對(duì)照組,而MMP-9抑制劑組可見炎癥指標(biāo)明顯降低,且上述炎癥指標(biāo)變化趨勢(shì)呈明顯正相關(guān)。上述結(jié)果和臨床研究結(jié)果相一致。Chang等[18]進(jìn)行的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:M/T比值在BPD的進(jìn)程中起著重要作用,并且觀察到4-苯甲酸、卟啉氯化物、維甲酸可以有效降低大鼠模型中M/T比值,并減少BPD的發(fā)生,其結(jié)果和本研究相似。

綜上,FIRS可通過釋放IL-6,調(diào)節(jié)MMP-9、TIMP-1水平及M/T比值,介導(dǎo)BPD發(fā)生,應(yīng)用MMP-9抑制劑可在肺損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用,為臨床治療提供了潛在的藥物治療靶點(diǎn)。