何 陽李其富黎昌炫陳瑞鵬

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,?？?570000)

糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病,以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)較為常見,隨著近來人們飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變,發(fā)病率呈增加且年輕化趨勢,其中糖尿病各種并發(fā)癥是其致死、致殘的重要原因,危害嚴重[1-2]。近來研究顯示,糖尿病是腦梗死的獨立危險因素,T2DM患者較非糖尿病患者發(fā)生腦缺血再灌注損傷的風(fēng)險高2～6倍,且糖尿病合并腦梗死發(fā)病率逐年升高,嚴重影響患者預(yù)后及生存質(zhì)量[3]。盡管近來研究糖尿病加重腦梗死的機制較多,但其具體機制尚未完全闡明[4]。成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)是一種新的代謝調(diào)節(jié)因子,在大腦新陳代謝、保護和認知方面發(fā)揮重要作用[5],β-klotho是一種膜蛋白,可增強FGF21與其受體FGFR1結(jié)合的親和性,輔助其完成相應(yīng)特異功能,在神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)皮功能、血糖及體重等調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[6-7]。因此本研究擬探究FGF21/βklotho/FGFR1通路在T2DM局灶性腦缺血模型大鼠腦損傷中的作用機制,以期為T2DM加重局灶性腦缺血性疾病的機制研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性清潔級10周齡SD大鼠60只,體重280～310 g,購買及飼養(yǎng)均在北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司[SCXK(滬)2017-0011][SYXK(滬)2017-0014]。本研究經(jīng)過本院動物倫理委員會批準通過(IACUC-L2018-0005)。實驗遵循3R原則,給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(貨號:RR037A)、TB Green? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(貨號:RR820A)均購自TaKaRa公司;引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成;FGFR1抑制劑PD173074(貨號:HY-10321)、FGFR1激動劑PF05231023(貨號:HY-113697)購自MCE公司;原位末端標記法(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:C1091)購自上海碧云天公司;兔源一抗anti-FGF21(貨號:ab64857)、anti-β-klotho(貨號:ab181373)、anti-FGFR1(貨號:ab173305)、anti-血小板內(nèi)皮細胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecules,CD31)(貨號:ab24590)、anti-內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)(貨號:ab242440)、anti-血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體(貨號:ab32152)、anti-GAPDH(貨號:ab9485),二抗羊抗兔IgG(貨號:ab6721)均購自英國Abcam公司;FC型酶標儀、ABI 7500 RTqPCR儀購自美國Thermofisher公司;尼康55i熒光顯微鏡購自日本Nikon公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

SD大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,根據(jù)表1造模方法進行造模處理。

表1 造模類型及方法Table 1 Model types and methods

1.3.2 實驗分組

根據(jù)表2所述,將大鼠隨機分為5組,每組12只。若造模過程中動物死亡,及時補充造模。MCAO術(shù)后24 h對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分,之后從每組大鼠中隨機選取6只處死,迅速取缺血側(cè)腦組織及其周圍腦組織置于液氮中保存?zhèn)溆?剩余6只進行石蠟包埋固定制成石蠟切片保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 大鼠的分組及給藥Table 2 Grouping and administration of rats

1.3.3 TUNEL法檢測大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,胰蛋白酶K 37℃孵育25 min,漂洗晾干后采用TUNEL試劑盒進行染色后于顯微鏡下觀察,隨機選取5個高倍鏡(×400)視野下陽性細胞,并計算其所占比例,即凋亡率=(陽性細胞/計數(shù)細胞)×100%。

1.3.4 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢 測 缺 血 側(cè) 腦 組 織FGF21、βklotho、FGFR1 mRNA表達

采用TRIzol提取腦組織樣品總RNA,用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用RT-qPCR擴增FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA片段。反應(yīng)體系:TB Green Premix Ex Taq II(2×)10 μL,ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)條件:95℃30 s;95℃5 s,61℃31 s,40個循環(huán)。FGF21、β-klotho、FGFR1及內(nèi)參GAPDH的引物序列見表3。采用2-ΔΔCT法對腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA相對表達水平進行定量分析。

表3 RT-qPCR引物序列Table 3 Primer sequence of RT-qPCR

1.3.5 免疫印跡(Western blot)檢測腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1、CD31、ET-1、VEGF蛋白表達

采用蛋白抽提試劑盒提取大鼠缺血側(cè)腦組織及周圍組織總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,置于-80℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品,進行SDSPAGE電泳分離,PVDF膜轉(zhuǎn)膜,室溫封閉,添加稀釋一抗anti-FGF21(稀釋比1∶1000)、anti-β-klotho(稀釋比1∶1000)、anti-FGFR1(稀釋比1∶5000)、anti-CD31(稀釋比1∶2000)、anti-ET-1(稀釋比1∶1000)、anti-VEGF(稀釋比1∶1000)、anti-GAPDH(稀釋比1∶5000)4℃孵育過夜,TBST緩沖液洗膜,用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG(1∶5000)室溫孵育1.5 h,洗膜后用免疫印記化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色,數(shù)字化多功能圖像增強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝片,觀察結(jié)果并分析各蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,以平均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組比較采用t檢驗,多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,任意兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著增加,PF05231023組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P＜0.05),見表4。

表4 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group

表4 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group

注:與Control組相比,*P＜0.05;與MCAO組相比,#P＜0.05;與T2DM+MCAO組相比,△P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,#P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.

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2.2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬神經(jīng)元細胞凋亡情況比較

Control組大鼠腦組織海馬偶見神經(jīng)元凋亡,與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬神經(jīng)元細胞凋亡率均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬神經(jīng)元細胞凋亡率顯著增加,PF05231023組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬神經(jīng)元細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05),見表5。

表5 各組大鼠缺血側(cè)腦組織海馬神經(jīng)元細胞凋亡率比較(±s,n=6)Table 5 Comparison of apoptotic rate of hippocampal neurons in ischemic brain tissue of each group

注:與Control組相比,*P＜0.05;與MCAO組相比,#P＜0.05;與T2DM+MCAO組相比,△P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,#P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.

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2.3 各組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA表達水平比較

與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA表達水平均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA表 達 水 平 顯 著 降 低(P＜0.05),PF05231023組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、βklotho、FGFR1 mRNA表達水平顯著增加(P＜0.05),見圖1。

圖1 各組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA表達水平比較(n=6)Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,# P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.Figure 1 Comparison of mRNA expression levels of FGF21,β-klotho and FGFR1 in ischemic brain tissue of rats in each group

2.4 各組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平比較

與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05),PF05231023組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平顯著增加(P＜0.05),見圖2。

圖2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平比較(n=6)Note.A,Protein band map of FGF21,β-klotho and FGFR1.B,Relative expression levels of FGF21,β-klotho and FGFR1 proteins.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,#P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.Figure 2 Comparison of protein expression levels of FGF21,β-klotho and FGFR1 in ischemic brain tissue of rats in each group

2.5 各組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平比較

PF05231023組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05),見圖3。

圖3 各組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平比較(n=6)Note.A,Protein band map of ET-1,CD31 and VEGF.B,Relative protein expression levels of ET-1,CD31 and VEGF.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,#P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.Figure 3 Comparison of ET-1,CD31 and VEGF protein expression levels around ischemic brain tissue of rats in each group

與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平顯著增加(P＜0.05),

3 討論

糖尿病是腦血管疾病的一個重要危險因素,持續(xù)高糖可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷、破裂,極易造成血管阻塞,誘發(fā)血栓及腦梗死[12]。腦缺血急性期,隨缺血時間延長,神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)顯著增加,神經(jīng)元壞死與凋亡并存,壞死主要位于缺血中心區(qū),凋亡則主要出現(xiàn)在缺血半暗帶[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與MCAO組比較,T2DM+MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著增加,缺血腦組織中海馬神經(jīng)元細胞凋亡率顯著增加,結(jié)果與何婧等[14]發(fā)現(xiàn)相一致,提示T2DM可進一步加重腦缺血損傷。研究證實,血管再生可增加腦缺血后腦組織血流灌注、改善神經(jīng)功能[15]。CD31又稱血小板內(nèi)皮細胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1),是一種存在于血管內(nèi)皮和血小板中可直觀有效反映新生血管數(shù)目和側(cè)支循環(huán)建立情況的糖蛋白,在腦缺血梗死周圍顯著增加[16-17]。ET-1是一種具有強縮血管作用的小分子多肽[18]。VEGF是由大腦中的許多神經(jīng)血管細胞產(chǎn)生和分泌,被認為是缺血后血管生成的中樞介質(zhì)[19],其表達升高與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,與Control組比較,與MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血組織周圍CD31、ET-1和VEGF蛋白表達顯著增加,提示局灶性腦缺血模型大鼠存在腦血管內(nèi)皮損傷,而T2DM可加重腦血管內(nèi)皮損傷,但關(guān)于其具體機制尚未完全闡明。

FGF家族分為7個亞族,共有22個成員,其中FGF21主要表達于肝組織,是新發(fā)現(xiàn)的一種脂質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白。由于FGF21與肝素的親和力較低,可以通過簡單的擴散穿透血腦屏障,對大腦具有潛在的保護作用。FGF21已被證實在大腦新陳代謝、保護和認知方面發(fā)揮重要作用[20]。FGF21通過細胞-表面受體復(fù)合體發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用,該復(fù)合體由FGFR和單一跨膜蛋白β-klotho組成。

研究報道,FGF21可減輕淀粉樣蛋白和興奮性氨基酸誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠模型中的神經(jīng)元損傷和認知缺陷[21]。創(chuàng)傷性腦損傷后,FGF21還可通過FGFR1/β-klotho上調(diào)PPARγ來保護血腦屏障[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與T2DM+MCAO組比較,FGFR1抑 制 劑PD173074可 顯 著 降 低FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA及蛋白表達水平,增加T2DM腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能缺損,促進海馬神經(jīng)元細胞凋亡,增加血管內(nèi)皮損傷標志蛋白CD31、ET-1表達,而FGFR1激活劑PF05231023可顯著增加FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA及蛋白表達水平,減輕T2DM腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能缺損,降低海馬神經(jīng)元細胞凋亡,減少血管內(nèi)皮損傷標志蛋白CD31、ET-1和VEGF表 達。Ye等[23]研 究發(fā) 現(xiàn),FGF21激活FGFR1/β-klotho通路可明顯改善新生兒缺氧缺血性腦損傷。本研究結(jié)果結(jié)合前人發(fā)現(xiàn),推測FGF21/β-klotho/FGFR1信號通路的激活可能在T2DM局灶性腦缺血進程中發(fā)揮重要保護作用。

綜上所述,FGF21/β-klotho/FGFR1通路可能是T2DM加重腦缺血損傷的重要傳遞信號通路,促進該通路激活在T2DM局灶性腦缺血模型大鼠中發(fā)揮重要保護作用。但神經(jīng)凋亡機制復(fù)雜,腦缺血引起血管內(nèi)皮損傷及神經(jīng)凋亡過程是否還涉及其他信號通路共同參與及其與FGF21/β-klotho/FGFR1通路的上下游作用關(guān)系,有待進一步深入探究。