宋 瓊滕夏虹王麗惠許倩倩孫曉婷鄒春林*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心,廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,南寧 530021;2.長壽與老年相關(guān)疾病教育部重點實驗室,南寧 530021;3.廣西醫(yī)科大學(xué)國際教育學(xué)院,南寧 530021)

人多能干細胞,包括人胚胎干細胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)和人誘導(dǎo)多能干細胞(human induced Pluripotent Stem Cells,hiPSCs),具有體外無限增殖、保持未分化狀態(tài)的自我更新能力和多向分化潛能,在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)以及新藥篩選方面有著廣闊的運用應(yīng)用前景[1-5]。目前干細胞hESCs和hiPSCs的體外培養(yǎng),一般需要小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作為飼養(yǎng)層細胞,但其應(yīng)用于臨床有可能導(dǎo)致動物源性病原體污染及免疫排斥等問題[6-8]。為了解決上述問題,各種無動物源性飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系被研發(fā),包括無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系和人源飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)體系[9-12]。雖然已有研究報道,某些體細胞可在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下重編程為iPSCs,但重編程的效率明顯比在MEF上的重編程效率低,并仍然需要動物源性的基質(zhì)來支持細胞的生長,因此不利于臨床的轉(zhuǎn)化應(yīng)用[13-15]。已有研究報道在端粒酶的3個亞單位中,人端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是調(diào)節(jié)端粒酶活性的關(guān)鍵組分,正常人體細胞中hTERT不表達或表達量很低,如果在體外培養(yǎng)的體細胞中過表達hTERT,可明顯延長培養(yǎng)細胞的壽命,從而建立永生化的細胞系[16-18]。此外,也有研究報道,Wnt/β-catenin信號通路在維持胚胎干細胞的多能性和體細胞重編程過程中發(fā)揮著重要作用[19]。Wnt3a作為Wnt家族的重要成員,有研究表明Wnt3a在調(diào)控干細胞多能性和自我更新中發(fā)揮重要的作用[20-21]。有研究報道,在人胚胎干細胞培養(yǎng)基中加入Wnt3a促進細胞增殖,并且不影響細胞凋亡[22]。在水牛胚胎干細胞培養(yǎng)基中加入Wnt3a,通過激活Wnt/β-catenin信號通路,β-catenin表達顯著上調(diào),進而激活下游靶基因Nanog的表達,從而維持胚胎干細胞多能性[23]。過表達Wnt3a的小鼠成纖維細胞制備的條件培養(yǎng)基可以促進小鼠胚胎干細胞的增殖能力,維持小鼠胚胎干細胞自我更新能力和多能分化能力[24]。因此,在前期研究中,通過在人骨髓間充質(zhì)細胞中穩(wěn)定表達hTERT基因和Wnt3a基因,獲得了永生化人源飼養(yǎng)層細系TW2R,TW2R細胞系雖然能夠支持人胚胎干細胞的不分化生長,但在支持人胚胎干細胞生長效率方面,與MEF比較并無明顯優(yōu)勢[25]。有研究結(jié)果顯示跨膜蛋白E-cadherin所介導(dǎo)的細胞間相互作用在體細胞重編程中起著非常重要的作用[26],因此本研究提出將E-cadherin基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至永生化人源飼養(yǎng)層細胞內(nèi),將有可能獲得可高效支持人胚胎干細胞生長的人源飼養(yǎng)層細胞系,并有助于人多能干細胞的相關(guān)研究和臨床應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級8周齡NOD-SCID雄性小鼠,2只,25～26 g,購買于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2017-0005],并飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(桂)2020-0004],實驗中所涉及的所有動物實驗操作均獲得廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(201711032),遵循3R原則。

1.1.2 細胞與病毒

人胚胎干細胞系H9由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細胞治療中心惠贈,永生化人間充質(zhì)干細胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)細胞系TW2R是由先前實驗通過在hMSCs中過表達hTERT基因和Wnt3a基因建立的永生化人飼養(yǎng)層細胞系[25],表達E-cadherin基因和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的慢病毒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司制備。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM(low glucose)培養(yǎng)基、KNOCKOUT DMEM培養(yǎng)基、KNOCKOUT Serum Replacement、MEM Non-Essential Amino Acids Solution、胎 牛 血 清、bFGF、GlutaMAX Supplement、Antibiotic-Antimycotic、0.05%Trypsin-EDTA、消化酶Accutase、Lipofectamine 2000、Opti-MEM(美國Invitrogen公司);抗E-cadherin抗體、抗OCT4抗體(美國Cell Signaling Technology公司);抗Tra-1-60抗體、抗SSEA-4抗體、抗Wnt3a抗體、抗α-SMA抗體(美國Millipore公司);抗β3-tubulin抗體(美國Sigma公司);抗NANOG抗體(美國Peprotech公司);抗AFP抗體(美國Abcam公司)。恒溫CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、水浴鍋、多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司);正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗流程

實驗流程見圖1。

圖1 永生化人源飼養(yǎng)層細胞系TWE3R的構(gòu)建Figure 1 Establishment of immortalized human feeder cell line TWE3R

1.3.2 培養(yǎng)基配置

(1)人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基:含10%胎牛血清、1%Antibiotic-Antimycotic和1 ng/mL bFGF的低糖DMEM;(2)293T培養(yǎng)基:含10%胎牛血清的高糖DMEM;(3)人胚胎干細胞培養(yǎng)基:含1% Antibiotic-Antimycotic、1% Lglutamine、1% Nonessential amino acids、20% KNOCKOUT Serum Replacement、0.007‰ β-mercaptoethanol和10 ng/mL bFGF的KNOCKOUT DMEM。

1.3.3 人骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)

將人骨髓來源去除CD34陽性細胞的單個核細胞重懸于hMSCs培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每48 h更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)14 d左右見明顯細胞克隆形成,將細胞進行傳代培養(yǎng)。

1.3.4 構(gòu)建過表達E-cadherin的TWE3R細胞系和空載對照組TWN3R細胞系

將含有Puromycin抗性基因和E-cadherin基因的慢病毒以及僅含有Puromycin抗性基因的慢病毒濃縮液分別感染TW2R細胞系,通過1 μg/mL Puromycin加藥篩選,獲得穩(wěn)定過表達E-cadherin基因的細胞系TWE3R和穩(wěn)定表達Puromycin抗性基因的對照組細胞系TWN3R。

1.3.5 細胞免疫熒光檢測

將細胞接種于24孔板中,待細胞貼壁,PBS清洗,4%的多聚甲醛固定,0.3% TritonX-100滲透,5%正常驢血清封閉1 h,一抗4℃孵育過夜(抗Ecadherin抗體1∶200稀釋,抗Wnt3a抗體1∶100稀釋,抗Tra-1-60抗體1∶300稀釋,抗Oct-4抗體1∶400稀釋,抗NANOG抗體1∶300稀釋,抗SSEA-4抗體1∶100稀釋)。PBS清洗后室溫避光孵育熒光二抗1.5 h,DAPI染核5 min,置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 人胚胎干細胞在不同飼養(yǎng)層細胞上的克隆形成實驗

將10 μg/mL絲裂霉素處理的hMSCs、TW2R、TWN3R、TWE3R和CF1 MEF飼養(yǎng)層細胞分別接種于預(yù)包被明膠的24孔板中,過夜培養(yǎng)。將無飼養(yǎng)層細胞中培養(yǎng)的H9人胚胎干細胞用Accutase酶消化,制備單細胞懸液,按1、10、100、1×103和1×104細胞密度分別接種到含有不同飼養(yǎng)層細胞的24孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)7 d后,通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色,計數(shù)陽性克隆數(shù)。

1.3.7 人胚胎干細胞在TWE3R飼養(yǎng)層細胞上的長期傳代培養(yǎng)以及生物學(xué)特性分析

將H9人胚胎干細胞接種于絲裂霉素預(yù)處理的TWE3R上并連續(xù)傳代10代,然后進行相關(guān)生物學(xué)特性的分析:細胞核型分析、擬胚體形成實驗和畸胎瘤形成實驗。

(1)細胞核型分析 在對數(shù)生長期的TWE3R細胞中加入秋水仙素(Colcemid)細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)40～60 min。DPBS清洗后,胰酶消化離心。加入KCl低滲處理,置于37℃水浴鍋中孵育10～15 min,加入固定液(甲醇:冰醋酸=3∶1)進行預(yù)固定10 min,離心棄上清。加入固定液固定30 min,離心棄上清,再次加入固定液,4℃固定過夜。將固定好的細胞懸液,滴在玻片上,置于75℃烤箱烘烤3 h。將玻片放在胰酶中消化60 s后,生理鹽水漂洗,進行Giemsa混合液染色,自來水沖洗、晾干鏡檢,共計數(shù)30個分裂相,分析3個核型。

(2)擬胚體形成實驗 將TWE3R飼養(yǎng)層細胞上連續(xù)傳代10代的H9人胚胎干細胞接種到低粘附6孔板中,隔天換液,8 d后將形成擬胚體接種于0.1%明膠預(yù)處理的24孔板,繼續(xù)培養(yǎng)2 d后,4%多聚甲醛固定,細胞免疫熒光檢測,抗體稀釋比例如下:抗β3-tubulin抗體1∶1000稀釋、抗AFP抗體1∶500稀釋、抗α-SMA抗體1∶500稀釋。

(3)畸胎瘤形成實驗 在TWE3R飼養(yǎng)層細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)10代的H9人胚胎干細胞,膠原酶消化,離心后將約5×106細胞重懸于1∶1稀釋的Matrigel中,注射于NOD-SCID小鼠的后肢肌肉中,4～8周后將形成的畸胎瘤取出,經(jīng)4%的多聚甲醛固定,石蠟包埋后進行切片和HE染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,GraphPad Prism 8.0軟件進行圖標制作,計量結(jié)果以平均數(shù)±標準差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),組間兩兩比較采用t檢驗,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建永生化人源飼養(yǎng)層細胞TWE3R

前期研究通過先后轉(zhuǎn)染共表達hTERT基因和Hygromycin抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及共表達Wnt3a基因和Neomycin抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒載體到hMSCs細胞,通過體外長期傳代培養(yǎng)獲得了永生化的人源飼養(yǎng)層細胞系TW2R。在TW2R細胞基礎(chǔ)上,通過轉(zhuǎn)染共表達E-cadherin基因和Puromycin抗性基因的慢病毒載體到TW2R細胞,抗性篩選獲得了穩(wěn)定過表達E-cadherin基因的永生化TWE3R細胞系。如圖2A中相差顯微鏡圖片所示在細胞形態(tài)上TW2R、TWN3R和TWE3R細胞系與原代hMSCs基本相似,細胞呈長梭形。免疫熒光染色結(jié)果顯示hMSCs不表達Wnt3a蛋白和E-cadherin蛋白。TW2R和TWN3R僅表達Wnt3a蛋白不表達E-cadherin蛋白,TWE3R既表達Wnt3a蛋白也表達E-cadherin蛋白。由于原代hMSCs在連續(xù)傳5～6代后,其細胞增殖能力開始下降,并開始出現(xiàn)細胞核與細胞質(zhì)的比率減小等細胞衰老的特征,因此本研究通過對TWE3R細胞進行長期連續(xù)傳代培養(yǎng),來觀察TWE3R細胞是否會出現(xiàn)細胞衰老的表型,以證實TWE3R是否具有永生化細胞的生物學(xué)特點,結(jié)果如圖2B所示,連續(xù)傳代中TWN3R和TWE3R細胞的增殖倍增曲線顯示,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E-cadherin基因不會影響TWE3R細胞的增殖能力,對照組的TWN3R細胞和TWE3R細胞的細胞倍增時間在長期連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中無明顯改變,兩種細胞連續(xù)傳代50代以上,細胞形態(tài)無明顯改變,也未出現(xiàn)衰老的表現(xiàn)。細胞染色體核型分析結(jié)果如圖2C所示,TWE3R細胞具有正常的人染色體細胞核型,無染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。

圖2 永生化人源飼養(yǎng)層細胞系TWE3R的生物學(xué)特性Note.A,Cells morphology observation in phase contrast microscopy images and immunofluorescence staining for Wnt3a(Red)or E-cadherin(Red)and nuclei DAPI(Blue).B,Growth curves of TWN3R and TWE3R on continuous passaging.C,TWE3R maintained a normal karyotype.Figure 2 Characterization of immortalized human feeder cell line TWE3R

2.2 比較人胚胎干細胞在TW2R、TWN3R、TWE3R和MEF細胞上的克隆形成率

由于克隆形成實驗通常用來檢測細胞的增殖能力,為了證實TWE3R比其親本細胞和MEF細胞具有更高效率支持人胚胎干細胞增殖的特性,本研究比較了不同細胞密度的H9人胚胎干細胞在TW2R、TWN3R、TWE3R和MEF細胞上的克隆形成率,結(jié)果如圖3A所示,在TWE3R細胞上,不同密度的H9人胚胎干細胞克隆形成率均高于TW2R、TWN3R和MEF細胞,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而在TW2R、TWN3R和MEF細胞之間克隆形成率無顯著差異(P＞0.05),并且更值得關(guān)注的是,TWE3R細胞可支持低密度接種條件下(每平方厘米5個)人胚胎干細胞的生長,而在其他飼養(yǎng)層細胞上幾乎觀察不到人胚胎干細胞克隆的形成。

2.3 人胚胎干細胞在TWE3R細胞上長期傳代培養(yǎng)后的生物學(xué)特性的鑒定

H9人胚胎干細胞系是國際上最通用胚胎干細胞系之一,為了證實人胚胎干細胞可在TWE3R細胞上長期傳代培養(yǎng)并保持未分化人胚胎干細胞的生物學(xué)特點,本研究將H9人胚胎干細胞在TWE3R細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)10代,分別進行人胚胎干細胞染色體細胞核型分析、特異性標志物的染色、擬胚體形成和畸胎瘤形成實驗。為了檢測H9人胚胎干細胞在TWE3R細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)后是否具有正常的二倍體核型,結(jié)果如圖3B顯示連續(xù)傳代的H9人胚胎干細胞仍然保持正常的染色體細胞核型,無染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。如圖3C顯示,H9人胚胎干細胞在TWE3R細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)后,H9人胚胎干細胞呈克隆團樣生長,克隆邊緣清晰,細胞形態(tài)均一,核質(zhì)比高,細胞仍然保持正常未分化的形態(tài),堿性磷酸酶染色呈強陽性。進一步細胞免疫熒光染色結(jié)果也顯示,連續(xù)傳代的H9人胚胎干細胞仍然表達多能干細胞特異性標志物Tra-1-60、OCT4、NANOG和SSEA-4。擬胚體形成實驗是檢測人胚胎干細胞體外多向分化潛能的重要實驗,而畸胎瘤形成實驗是檢測人胚胎干細胞體內(nèi)多向分化潛能的重要實驗,本研究結(jié)果如圖3D顯示,由連續(xù)傳代的H9人胚胎干細胞體外分化形成的擬胚體表達外胚層標志物(β3-tubulin),中胚層標志物(α-SMA)和內(nèi)胚層標志物(AFP)。此外,H9人胚胎干細胞在TWE3R傳10代后,注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi),可形成畸胎瘤,并且畸胎瘤HE染色顯示腫瘤組織含有來自外胚層、內(nèi)胚層和中胚層的組織,表明H9人胚胎干細胞細胞在TWE3R飼養(yǎng)層細胞上長期傳代后仍然保持體內(nèi)、體外向3個胚層分化的能力。

圖3 TWE3R可支持未分化狀態(tài)人胚胎干細胞的長期傳代培養(yǎng)Note.A,H9 hESCs plated on TWE3R feeders showed a higher efficiency of clonal growth than those on TW2R,TWN3R or MEF.Compared with TW2R,*P＜0.05.Compared with TWN3R or MEF,**P＜0.01.B,After 10 passages on TWE3R,the H9 hESCs maintained a normal female karyotype and undifferentiated morphology and expression of pluripotency markers such as SSEA4,TRA-1-60,OCT4,NANOG and alkaline phosphatase.D,Potential to differentiate to derivatives of all three embryonic germ layer in vivo(right panel)and in vitro(left panel)in embryoid body formation assays and teratoma formation assays.Figure 3 TWE3R human feeders support long-term culture of undifferentiated human ESCs

3 討論

人胚胎干細胞具有體外無限增殖、保持未分化狀態(tài)的自我更新能力和多向分化潛能的一類細胞。干細胞生長所處的微環(huán)境,在調(diào)節(jié)干細胞活性和行為方面發(fā)揮著主導(dǎo)作用,主要包括細胞間的相互作用和細胞與細胞外基質(zhì)間的相互作用。細胞之間的相互作用通過3種方式介導(dǎo):可溶性因子、細胞外矩陣(ECM)和細胞間粘附。其中細胞間粘附是調(diào)節(jié)細胞的分化和增殖的重要因素[27-28]。

E-cadherin是鈣依賴性黏附分子的亞族成員,是一種跨膜蛋白,廣泛分布在非神經(jīng)上皮組織,它與細胞內(nèi)的特異性分子結(jié)合,參與同種親和性的細胞-細胞間的黏附,胚胎發(fā)育以及正常組織中上皮細胞層的形成和維持[29]。在胚胎發(fā)育過程的早期,研究顯示E-cadherin介導(dǎo)的細胞與細胞間黏附作用參與了細胞的遷移和組織的形成[30]。此外,有研究顯示E-cadherin在維持多能干細胞的生長方面也有著重要作用。Nagaoka等[31-32]研究報道,包被了E-cadherin蛋白膜外部分的培養(yǎng)表面能夠充分維持小鼠胚胎干細胞和人多能干細胞的生長,并可維持多能干細胞的全部生物學(xué)特性,這說明E-cadherin不但是一個細胞黏附分子,同時可能也起到了激活維持多能干細胞多能性信號通路的作用。Chen等[33]研究報道,在小鼠成纖維細胞重編成為誘導(dǎo)多能干細胞的過程中下調(diào)內(nèi)源性E-cadherin表達,可使重編程的效率降低80%,并且證明E-cadherin所介導(dǎo)的細胞間黏附作用在體細胞重編程為誘導(dǎo)多能干細胞的過程中起到至關(guān)重要的作用。由于體細胞重編程為誘導(dǎo)多能干細胞是小概率事件,因此如何提高重編程過程中單個誘導(dǎo)多能干細胞的存活率,對于誘導(dǎo)多能干細胞的應(yīng)用有著重要意義。已知ES細胞和誘導(dǎo)多能干細胞表達E-cadherin,而飼養(yǎng)層細胞不能表達E-cadherin。先前已有研究報道,單個人胚胎干細胞由于不能及時重建Ecadherin所介導(dǎo)的細胞與細胞間的相互黏附作用,而易發(fā)生凋亡,導(dǎo)致細胞自我更新能力的下降和細胞死亡的增加[34]。文獻報道hMSCs不能表達Ecadherin[35],我們研究發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)層細胞hMSCs以及永生化TW2R細胞均不表達E-cadherin。由于ES細胞和誘導(dǎo)多能干細胞表達E-cadherin,因此提出本研究假設(shè),在飼養(yǎng)層細胞過表達E-cadherin基因可通過增強多能干細胞和飼養(yǎng)層細胞間的相互作用來提高多能干細胞的自我更新和存活能力。本研究顯示,通過在前期建立的永生生化TW2R細胞上過表達E-cadherin,可獲得永生化的人源飼養(yǎng)層細胞系TWE3R,人胚胎干細胞在TWE3R細胞上克隆形成率均明顯高于其親本細胞(TW2R)和對照組細胞(TWN3R),并且具備特異性支持低密度接種條件下(每平方厘米5個)的生長,而MEF、TW2R和TWN3R不具備這種能力,這說明人胚胎干細胞在被消化成單個細胞后在低密度下具有較差的克隆形成能力,而過表達E-cadherin的TWE3R可以顯著提高其單細胞存活率和克隆形成率。其機制可能與E-cadherin調(diào)控其下游信號分子β-catenin有關(guān),而β-catenin是Wnt信號系統(tǒng)下游的關(guān)鍵分子,其可通過調(diào)控細胞內(nèi)Nanog和OCT-4基因的表達和分布影響胚胎干細胞的增殖和多能性維持[36-38]。此外,人胚胎干細胞在TWE3R上連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中,細胞仍然保持正常未分化的形態(tài),保持正常的染色體細胞核型,表達干細胞標志物Tra-1-60、OCT4、NANOG和SSEA-4[39],在體外擬胚體實驗和體內(nèi)畸胎瘤實驗證實所培養(yǎng)的人胚胎干細胞保持體內(nèi)、體外向3個胚層分化的能力。

綜上所述,本研究所建立的過表達E-cadherin的永生化人源飼養(yǎng)層細胞系TWE3R高效支持人胚胎干細胞未分化狀態(tài)生長的優(yōu)勢,是理想的人源飼養(yǎng)層細胞,為解決人胚胎干細胞體外培養(yǎng)和臨床應(yīng)用時面臨的一系列問題提供了新的解決方案。