潘會(huì)君，朱全剛，朱聰聰

(1.上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200443；2.同濟(jì)大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院，上海 200443)

知母-黃柏配伍是臨床上常用的藥對(duì)，廣泛用于實(shí)熱證和虛熱證的治療，如知柏地黃丸、滋腎通關(guān)丸等經(jīng)典方均含有知母-黃柏藥對(duì)。已有的研究顯示，知母-黃柏藥對(duì)鹽炙前后對(duì)糖皮質(zhì)激素致腎陰虛大鼠具有滋陰清熱作用[1]；知母提取物及黃柏提取物具有降糖作用，對(duì)糖尿病模型小鼠的周圍神經(jīng)病變有保護(hù)作用[2]；能提升胰島素敏感性，促進(jìn)糖脂代謝[3]。知母-黃柏藥對(duì)可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路而實(shí)現(xiàn)對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙的改善[4]。

隨著高通量組學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多種學(xué)科的交叉，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始將視角轉(zhuǎn)向復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生[5]。越來(lái)越多的中藥配伍研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行分子機(jī)制、作用靶點(diǎn)、毒性研究等。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，知母-黃柏藥對(duì)影響糖尿病胰島素抵抗、胰島素信號(hào)通路、胰高血糖素信號(hào)通路、炎癥通路和Ⅰ、Ⅱ型糖尿病通路[6]，并對(duì)精神分裂癥、糖尿病、 阿爾茨海默癥、非特異性癌癥、哮喘、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肥胖、心血管疾病等具有潛在的作用[7]。

炎癥是機(jī)體防御感染及修復(fù)損傷的保護(hù)性反應(yīng)，在機(jī)體自穩(wěn)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，引起器官的組織和細(xì)胞發(fā)生變性壞死，并且有可造成嚴(yán)重后果[8]。因此，抗炎藥物對(duì)于解決炎癥性疾病具有重要作用。臨床上非甾體類抗炎藥是臨床使用最廣泛的消炎、鎮(zhèn)痛藥物之一，近年來(lái)生物制劑(TNF-α 拮抗劑、IL-17 拮抗劑、IL-12 /23 拮抗劑、IL-23 拮抗劑)也廣泛用于炎癥性疾病的治療，如腫瘤、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、特應(yīng)性皮炎等。

已有的研究顯示，知母-黃柏藥對(duì)具有抗炎作用，其抗炎作用與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)[9]。知母-黃柏藥對(duì)屬于中藥“相須”配伍，其相須配伍的抗炎作用機(jī)制尚未闡釋清楚。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)知母-黃柏“相須”配伍的協(xié)同抗炎作用進(jìn)行解析，從而豐富知母-黃柏藥對(duì)的協(xié)同抗炎作用，為其治療炎癥性疾病提供依據(jù)。

1 方法

1.1 成分收集、篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥20%及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.1進(jìn)行篩選[10]。從中醫(yī)藥百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(an encyclopedia of traditional chinese medicine ，ETCM)(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/index.html)收集知母和黃柏的化學(xué)成分，根據(jù)藥物相似程度權(quán)重值(druglikeness weight，DW)≥0.49篩選化學(xué)成分[11]。通過(guò)ETCM、TCMSP收集的所有靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重，統(tǒng)一在UniProt上校正，轉(zhuǎn)換成homo sapiens的Official Gene Symbol。

1.2 炎癥相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

通過(guò) OMIM(online mendelian inheritance in man)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)[12], Phenopedia數(shù)據(jù)庫(kù) (https:// phgkb.cdc.gov/PHGKB/startPagePhenoPedia.action)[13]，以“inflammation”為關(guān)鍵詞進(jìn)行捜索，收集靶點(diǎn)，去除重復(fù)，獲得炎癥相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 篩選知母-黃柏藥對(duì)抗炎靶點(diǎn)

通過(guò)Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)[14]將篩選得到的中藥靶點(diǎn)映射到炎癥靶點(diǎn)，得到知母-黃柏藥對(duì)的潛在抗炎靶點(diǎn)。

1.4 知母-黃柏藥對(duì)抗炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建知母和黃柏中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并使用Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)湫再|(zhì)參數(shù)，確定靶點(diǎn)的受調(diào)控分[15]，從而確定靶點(diǎn)被中藥調(diào)控的強(qiáng)度。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)湫再|(zhì)參數(shù)，包括度(degree)、介數(shù)中心度(betweenness)及接近中心性(closeness)[16]。研究認(rèn)為，一個(gè)點(diǎn)的度值為該網(wǎng)絡(luò)度中位數(shù)的2倍或以上則定義為核心成分和靶點(diǎn)[17]。

1.5 GO及KEGG富集分析

利用DAVID(the database for annotation, visualization and integrated discovery)v6.8(https://david.ncifcrf.gov/)[18]在線分析工具對(duì)知母-黃柏藥對(duì)的潛在抗炎靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 通路富集。使用OmicStudio tools(https:// www.omicstudio.cn/tool)對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行氣泡圖繪制。

1.6 中藥-成分-抗炎靶點(diǎn)-信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

使用OmicStudio tools繪制中藥-成分-抗炎靶點(diǎn)-信號(hào)通路桑基圖。

2 結(jié)果

2.1 知母-黃柏藥對(duì)的成分及靶點(diǎn)

通過(guò) TCMSP和ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得知母化學(xué)成分25個(gè)，黃柏化學(xué)成分42個(gè)，知母、黃柏共有成分1個(gè)，為Stigmasterol(圖1)；知母化學(xué)成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)141個(gè)，黃柏化學(xué)成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)250個(gè)，知母、黃柏共有靶點(diǎn)113個(gè)(圖1)。知母、黃柏共有成分、共有靶點(diǎn)從一定程度上為知母-黃柏的“相須”配伍提供了物質(zhì)基礎(chǔ)及分子基礎(chǔ)。

圖1 知母-黃柏藥對(duì)化學(xué)成分及靶點(diǎn)維恩圖Fig.1 Venn diagram of the chemical constituents and targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

通過(guò)構(gòu)建知母-黃柏-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2)，發(fā)現(xiàn)存在單一成分作用在多個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，同一靶點(diǎn)與多種成分相關(guān),符合中藥多成分、多靶點(diǎn)相互作用的特征，知母-黃柏多種成分參與對(duì)共有靶點(diǎn)調(diào)控，為其“相須”配伍提供了分子靶點(diǎn)基礎(chǔ)。

圖2 知母-黃柏藥對(duì)化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of the chemical constituents and targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

2.2 炎癥靶點(diǎn)庫(kù)的構(gòu)建

通過(guò)OMIM,Phenopedia數(shù)據(jù)庫(kù)，以“inflammation”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集靶點(diǎn)，去除重復(fù)，獲得炎癥相關(guān)靶點(diǎn)2597個(gè)(圖3)。

2.3 知母-黃柏藥對(duì)對(duì)炎癥靶點(diǎn)的調(diào)控作用

為研究知母-黃柏藥對(duì)靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)的關(guān)系，本研究將知母靶點(diǎn)、黃柏靶點(diǎn)映射到炎癥靶點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，91個(gè)知母靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)重疊，168個(gè)黃柏靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)重疊，182個(gè)知母-黃柏藥對(duì)靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)重疊，這些靶點(diǎn)定義為潛在抗炎靶點(diǎn)。其中77個(gè)靶點(diǎn)為知母、黃柏、炎癥共有(圖3)，共有靶點(diǎn)為知母-黃柏藥對(duì)“相須”抗炎作用提供了直接作用分子靶點(diǎn)。

圖3 知母-黃柏靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)的維恩圖Fig.3 Venn diagram of the targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex and inflammation

為了評(píng)價(jià)靶點(diǎn)被中藥調(diào)控的強(qiáng)度，引入靶點(diǎn)的受調(diào)控分進(jìn)行評(píng)價(jià)。靶點(diǎn)的受調(diào)控分為靶向此蛋白的中藥-化合物組合的數(shù)量，例如，只有一個(gè)化合物靶向某靶點(diǎn)，但是此化合物包含在復(fù)方的3 味中藥中，此靶點(diǎn)的受調(diào)控分為3；另一個(gè)靶點(diǎn)被2個(gè)化合物所靶向，其中一個(gè)化合物包含在2味中藥中，另一個(gè)包含在另外3味中藥中，這個(gè)靶點(diǎn)的受調(diào)控分就是5。受調(diào)控分高的靶點(diǎn)即為受復(fù)方作用更強(qiáng)的靶點(diǎn)。

通過(guò)分析知母-黃柏藥對(duì)與炎癥的潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)，發(fā)現(xiàn)其中不少靶點(diǎn)都具有較高的受調(diào)控分，其中知母靶點(diǎn)受調(diào)控分中位數(shù)為1，黃柏靶點(diǎn)受調(diào)控分中位數(shù)為2，知母-黃柏藥對(duì)靶點(diǎn)受調(diào)控分中位數(shù)為4，知母-黃柏配伍后靶點(diǎn)受調(diào)控分明顯增加，說(shuō)明“相須”配伍具有分子靶點(diǎn)協(xié)同作用。知母-黃柏配伍后靶點(diǎn)受調(diào)控分≥8的靶點(diǎn)為29個(gè)，如PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2、AR、CHRM1、ADRA1B、CHRM3、F10、NOS3等(表1)。

圖4 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of TCM-constituents-targets

表1 靶點(diǎn)受調(diào)控得分

2.4 GO富集分析

對(duì)182個(gè)潛在抗炎靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，根據(jù)P<0.01且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR(false discovery rate)<0.01得到GO條目301條。GO 富集分析分為3 類：生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cell component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。將GO條目按FDR從小到大排序后選取前20繪制BP、CC和MF的柱狀圖(圖5)。

圖5 知母-黃柏藥對(duì)潛在抗炎靶點(diǎn)參與的生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能Fig.5 Biological process, cell component, and molecular function of potential anti-inflammatory targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

BP相關(guān)的條目最多，有235條，主要涉及RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、藥物反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡的正向調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞缺氧反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、蛋白激酶B信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、腫瘤壞死細(xì)胞因子反應(yīng)等方面；CC相關(guān)的條目25條，主要涉及細(xì)胞質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核染色質(zhì)、外泌體和線粒體等方面;MF相關(guān)的條目38 條，主要涉及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子活性、RNA聚合酶 Ⅱ 轉(zhuǎn)錄因子活性和血紅素結(jié)合等方面。

2.5 KEGG 通路富集

對(duì)182個(gè)潛在抗炎靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集，根據(jù)P<0.01得到106條KEGG通路，與癌癥、炎癥、慢性疾病、感染等相關(guān)。涉及癌癥，如癌癥通路、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、癌癥中的蛋白多糖、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤、慢性粒細(xì)胞白血?。恍盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、FOXO信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路；免疫系統(tǒng)，T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路；內(nèi)分泌代謝性疾病，如胰島素抵抗、 催乳激素信號(hào)通路等；病毒感染疾病，如乙型肝炎，甲型流感，丙型肝炎；信號(hào)分子及其相互作用，如神經(jīng)活性配體-受體相互作用；細(xì)菌感染疾病，如查加斯??；寄生蟲(chóng)感染疾病，如弓形蟲(chóng)??；以及破骨細(xì)胞分化等。以上KEGG通路均與炎癥密切相關(guān)，因此知母-黃柏藥對(duì)調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路，發(fā)揮治療炎癥相關(guān)性疾病的作用。將KEGG通路按P<0.01 從小到大進(jìn)行排序后選取排名前60的通路繪制氣泡圖(圖6)。

圖6 知母-黃柏藥對(duì)潛在作用靶點(diǎn)富集的KEGG 通路Fig.6 KEGG pathway of the potential anti-inflammatory targets of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

2.6 知母-黃柏藥對(duì)協(xié)同調(diào)控炎癥信號(hào)通路

已有的研究顯示，炎癥與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，為了更直接地理解知母-黃柏配伍對(duì)信號(hào)通路的協(xié)同作用，構(gòu)建知母-黃柏藥對(duì)中藥-成分-靶點(diǎn)-通路?；鶊D(圖7)。從圖7中發(fā)現(xiàn)，知母-黃柏藥對(duì)所含成分，靶點(diǎn)作用于多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、FOXO信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路；并且每條信號(hào)通路均有知母和黃柏相應(yīng)的成分和靶點(diǎn)參與，兩藥協(xié)同調(diào)控炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗炎的作用。知母和黃柏共同調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)分子靶點(diǎn)，如磷酸肌醇3激酶(PIK3CG)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2) 、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS3)、毒蕈堿型膽堿受體M1(CHRM1)、毒蕈堿型膽堿受體M2(CNRM2)、類視黃醇X受體 alpha (RXRA)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1 (JUN)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、腫瘤壞死因子(TNF)等。因此，知母-黃柏藥對(duì)“相須”作用的分子機(jī)制是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)調(diào)控共同信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

圖7 知母-黃柏藥對(duì)中藥-成分-靶點(diǎn)-通路?；鶊DFig.7 Sankey diagram of TCM-constituents-targets-pathways of Anemarrhenae Rhizoma-Rhellodendri Chinensis Cortex

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)知母-黃柏藥對(duì)的抗炎作用進(jìn)行解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)182個(gè)知母-黃柏藥對(duì)靶點(diǎn)與炎癥靶點(diǎn)重疊，知母-黃柏配伍后靶點(diǎn)受調(diào)控分大于等于8的靶點(diǎn)為29個(gè)，如PTGS2、PTGS1、RXRA、ADRB2、AR、CHRM1、ADRA1B、CHRM3、F10、NOS3等；知母-黃柏藥對(duì)所含成分，靶點(diǎn)作用于多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、FOXO信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。體外細(xì)胞研究顯示，知母-黃柏30%醇洗脫部位能明顯降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及降低NO分泌，并降低iNOS和COX-2蛋白及基因表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路[9]。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，知母-黃柏藥對(duì)可以調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，影響PTGS2(即COX-2)表達(dá)，影響NO合成，以及TNF分泌，文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)相吻合。在KEGG通路及生物過(guò)程分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，知母-黃柏藥對(duì)能影響胰島素抵抗，因此其對(duì)糖尿病可能具有潛在的作用。已有的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)知母-黃柏藥對(duì)對(duì)糖尿病動(dòng)物模型有明顯的改善作用，能減輕對(duì)胰島素的抵抗[2-3]，與預(yù)測(cè)相吻合。

炎癥在腫瘤發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，對(duì)炎癥的調(diào)控成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。KEGG通路及生物過(guò)程分析發(fā)現(xiàn)，知母-黃柏藥對(duì)對(duì)多種腫瘤具有潛在作用。研究顯示，知母藥材不同藥用部位對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞、人肝Hepg-2細(xì)胞和人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞體外增值具抑制作用，并能抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO[19]；黃柏的成分黃柏苷可以通過(guò)阻滯細(xì)胞周期，上調(diào)Bax因子的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2因子的表達(dá)，并且激活caspase 3進(jìn)而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡[20]。因此，基于已有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，知母-黃柏藥對(duì)可以用于腫瘤治療，臨床腫瘤的中醫(yī)治療往往在中藥復(fù)方基礎(chǔ)上配伍知母-黃柏，其抗腫瘤作用可能與炎癥密切相關(guān)。

總之，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示了知母-黃柏藥對(duì)的抗炎作用機(jī)制。知母-黃柏藥對(duì)通過(guò)多種成分、多靶點(diǎn)共同調(diào)控炎癥信號(hào)通路及炎癥疾病通路，影響炎癥生物學(xué)過(guò)程，發(fā)揮抗炎作用，從而治療疾病。本研究為知母-黃柏藥對(duì)“相須”配伍提供了分子依據(jù)，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究深入挖掘知母-黃柏藥對(duì)的分子機(jī)制將有利于其在臨床上的精準(zhǔn)使用。