任思睿，胡慧宇，任亭亭，劉明軍，李文蓉，張 寧，張雪梅，劉晨曦，賀三剛*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊830052；2.新疆畜牧科學院生物技術(shù)研究所，烏魯木齊830011)

特克塞爾羊原產(chǎn)自于荷蘭特克塞爾島，為我國引進的肉用羊品種。自1995年以來，我國的一些省、市、地區(qū)先后引入該品種，如陜西、寧夏、北京、甘肅和遼寧等地區(qū)，對當?shù)仄贩N進行雜交改良，效果顯著[1]。哈薩克羊，產(chǎn)地為新疆維吾爾自治區(qū)天山北麓與阿爾泰山南麓地區(qū)，是一種肉、脂兼用的粗毛羊。因其常年在季節(jié)性草場轉(zhuǎn)場放牧，所以放牧性能良好，對環(huán)境適應(yīng)能力強，善于爬山游走，耐寒抗病，耐粗飼，曾作為母系品種參與了新疆細毛羊的繁育[2]。因其產(chǎn)肉能力不足，與特克塞爾羊進行雜交改良可以提高其產(chǎn)肉性能，獲得更大的經(jīng)濟效益。

生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)基因家族編碼4種不同的肌肉特異性的轉(zhuǎn)錄因子，分別為生肌決定因子(myogenic determining factor，MyoD)、肌細胞生成素(myogenin，MyoG)、生肌調(diào)節(jié)因子5(Myf5)和生肌調(diào)節(jié)因子6(Myf6)[3]。在綿羊中，MyoG基因位于第12號染色體，含有2個內(nèi)含子和3個外顯子[4]。肌細胞生成素(Myogenin，MyoG)是MRFs基因家族在所有骨骼肌細胞系中唯一一個可表達的基因[5]。MyoG基因可以激活肌肉的基因轉(zhuǎn)錄，提高肌細胞分化增值，調(diào)控肌纖維的融合，在肌纖維的形成過程中，前體肌細胞的增殖以及定型，到個體出生之后的骨骼肌功能的完善以及成熟等過程起到中心調(diào)控的作用[6-9]。且MyoG基因可調(diào)節(jié)Myf6基因的表達，調(diào)節(jié)肌肉的特異基因，如肌肉肌酸激酶、肌鈣蛋白、肌球蛋白輕鏈基因的表達[10]。現(xiàn)在關(guān)于MyoG基因多態(tài)性的研究一般以豬和牛的研究居多，主要涉及基因多態(tài)性與肉質(zhì)品質(zhì)和胴體生長性狀的關(guān)聯(lián)研究[11]。研究表明，MyoG基因是控制肌肉生長發(fā)育的關(guān)鍵基因，且與出生時的肌纖維數(shù)目密切相關(guān)，當其撤回或降低時，成肌細胞的分裂與分化就會立即停止[12]。所以可以通過調(diào)節(jié)和改變MyoG基因相關(guān)位點的選育增強上述指標表現(xiàn)，提高產(chǎn)肉能力和肉品品質(zhì)，從而滿足人們對高品質(zhì)和高產(chǎn)肉性狀的需要[13]。

本試驗對特克塞爾×哈薩克羊橫交F2代434只個體的MyoG基因SNP位點與胴體體尺性狀進行關(guān)聯(lián)分析。篩選出對綿羊胴體體尺性狀有重要作用的SNP位點，來提高綿羊瘦肉率和產(chǎn)肉率，對新疆地區(qū)綿羊品種的遺傳特性和優(yōu)良性狀進行深入系統(tǒng)的發(fā)掘與利用，有利于綿羊肉用生產(chǎn)性能的改良和選育。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及DNA樣品采集

試驗動物均來自新疆畜牧科學院生物技術(shù)研究中心所屬的綿羊繁育試驗基地，為2014-2019年屠宰的特克塞爾×哈薩克橫交F2代綿羊(即特克塞爾公羊與哈薩克母羊雜交獲得F1代羊，F(xiàn)1代公羊和F1代母羊交配獲得橫交F2代羊)，共434只。該群體均為飼養(yǎng)管理統(tǒng)一、年齡相同、體型相近、生長狀況良好的綿羊。采集434份綿羊耳組織樣品，記錄樣品耳標號和芯片號，分裝于2 mL凍存管中(內(nèi)盛有75%的乙醇)，于-20℃冷凍保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 胴體體尺相關(guān)性狀的測定

測定屠宰后綿羊的胴體重、胴體長、胸寬、肩寬、胸深、臀寬和踝骨寬胴體體尺性狀體尺數(shù)據(jù)。測定方法如下：

①胴體重(Carcass weight,CW)：將試驗動物屠宰徹底放血，并去掉動物的皮毛、內(nèi)臟、頭和蹄剩余的重量，重量單位為公斤(kg)，小數(shù)點后保留兩位；

②胴體長(Back length,BL)：用皮(軟)尺量取由肩端前緣至同側(cè)尾根的直線距離。②～⑦表型性狀的長度測量單位均為厘米(cm)，小數(shù)點后保留兩位；

③踝骨寬(Bone thickness at malleolus,BM)：用皮(軟)尺量踝骨寬；

④臀寬(Back dorsal width at pelvis,BP)：骨盆處的背部寬度，用測仗測量；

⑤胸寬(Back dorsal width at thorax,BT)：測定沿肩胛骨后方，從鬐甲到胸骨的垂直距離，用測仗測量；

⑥肩寬(Back dorsal width at shoulder,BS)：肩部處的背部寬度，用測仗測量；

⑦胸深(Dorsoventral height at thorax,TH)：胸腔的高度，用測仗測量。

1.2.2 DNA提取及質(zhì)量檢測

依照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(目錄號：DP304)說明書提取434只綿羊耳組織的DNA。使用1.0%的瓊脂糖的凝膠電泳檢測樣本DNA的完整性，使用Nanodrop One超微量分光光度計檢測樣本DNA的純度和濃度，確保OD260/OD280值為1.8～2.0。

1.2.3 PCR引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank Oar_v4.0(NC_019469.2)提供的綿羊MyoG基因序列，將序列分成三段進行PCR擴增，擴增長度約為3 100 bp。采用軟件Primer 5.0和National Center for Biotechnology Information在線相結(jié)合的方式設(shè)計3對引物(見表1)。引物由上海生工生物股份有限公司進行合成。

表1 MyoG基因引物序列

1.2.4 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物(補充濃度)各1 μL，模板DNA(補充濃度)2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)(95℃變性30 s、最佳退火溫度30 s、72℃延伸45 s)，72℃終延伸10 min，產(chǎn)物4℃保存。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物檢測(見圖1)。

圖1 MyoG基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖檢測

1.2.5 DNA雙向測序

從434只特克塞爾×哈薩克橫交F2代綿羊中隨機挑選50只個體進行MyoG基因組序列擴增，將3段序列進行DNA雙向測序，篩選SNP位點。由上海生工生物股份有限公司進行DNA測序。

1.2.6 Sequenom MassARRAY○RSNP檢測分型

用Sequenom MassARRAY○RSNP檢測384只綿羊的MyoG基因SNP位點基因型，由新疆康普森生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計方法

利用Microsoft Excel 2016計算基因頻率、基因型頻率、期望雜合度、觀測雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)和Hardy-Weinberg平衡，并利用SPSS 23.0軟件中的一般線性模型進行最小二乘方差對基因中的不同基因型與胴體體尺性狀進行相關(guān)性分析，一般線性模型為：

式中：Yijk為個體表型值，μ為群體平均值，Gi為個體基因型效應(yīng)，Sj為個體性別效應(yīng)，Mk為個體屠宰年份，Eijk為隨機殘差效應(yīng)。結(jié)果用“均值±標準誤”來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP位點的檢測結(jié)果

將MyoG基因的測序結(jié)果與GenBank公布的序列進行比對(登錄號:NC_019469.2)，共發(fā)現(xiàn)6個SNP位點，分別為rs600781279、rs407552631、rs410212255、rs419534498、rs400160301和rs405981477(rs號來源于參考文獻[16])，均位于內(nèi)含子上。其中，rs600781279和rs407552631位于內(nèi)含子Ⅰ上，rs410212255、rs419534498、rs400160301和rs405981477位于內(nèi)含子Ⅱ上，6個SNP多態(tài)性位點的信息見表2。

表2 MyoG基因中的SNP位點

2.2 Sequenom MassARRAY○RSNP分型結(jié)果

檢測6個SNP位點在剩余384只綿羊的基因型，分型結(jié)果如下(見圖2)，至此共得到434只綿羊的SNP位點信息數(shù)據(jù)。

圖2 MyoG基因飛行時間質(zhì)譜分型結(jié)果

2.3 MyoG基因多態(tài)性分析

2.3.1MyoG基因變異頻率分析和Hard-Weinberg平衡檢驗

對哈代-溫伯格平衡檢驗定律來說，當P＞0.05時，說明群體中基因出處于遺傳平衡狀態(tài)。由表3可知，MyoG基因的6個SNP位點在特克塞爾×哈薩克橫交F2代綿羊群體中都處于平衡狀態(tài)。就基因頻率和基因型頻率而言，rs600781279、rs410212255和rs419534498 3個SNPs的G等位基因、rs407552631的T等位基因、rs400160301的A和rs405981477的C為優(yōu)勢等位基因。并且rs600781279的優(yōu)勢等位基因型為GG，rs410212255的優(yōu)勢等位基因型為GG，rs419534498的優(yōu)勢等位基因型為GG，rs407552631的優(yōu)勢等位基因型為TT，rs400160301的優(yōu)勢等位基因型為GA，rs405981477的優(yōu)勢等位基因型為CC。

表3 MyoG基因變異頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗

續(xù)表

2.3.2MyoG基因多態(tài)性分析

表4 列出了MyoG基因SNP各個位點的多態(tài)性，分析可知rs407552631、rs400160301和rs405981477屬于中度多態(tài)(0.25＜PIC＜0.5)，rs600781279、rs410212255和rs419534498屬于低度多態(tài)(PIC＜0.25)。

表4 MyoG基因多態(tài)性分析

2.3.3MyoG基因與胴體體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表5可知，在特克塞爾×哈薩克橫交F2代群體發(fā)現(xiàn)的6個SNP位點中，有4個位點與胴體體尺性狀顯著相關(guān)，它們分別為rs600781279、rs407552631、rs410212255和rs400160301。MyoG基因?qū)﹄伢w重和胴體胸寬的影響不顯著(P＞0.05)。在rs600781279的基因型效應(yīng)中，GG基因型個體鑒定時的踝骨寬極差異顯著高于AG基因型個體(P＜0.01)。在rs407552631的基因型效應(yīng)中，GT基因型個體鑒定時的胴體長、臀寬和踝骨寬差異顯著高于TT基因型個體(P＜0.05)，GT基因型個體鑒定時的肩寬差異極顯著高于TT基因型個體(P＜0.01)。在rs410212255的基因型效應(yīng)中，GA基因型個體的胸深顯著高于GG基因型個體(P＜0.05)。在rs400160301的基因型效應(yīng)中，GA基因型個體鑒定時的胴體長差異顯著高于AA基因型個體(P＜0.05)，GG基因型個體鑒定時的肩寬和胸深差異顯著高于AA基因型個體(P＜0.05)，GG基因型個體鑒定時的臀寬差異極顯著高于AA基因型個體(P＜0.01)，GA基因型個體鑒定時的臀寬差異極顯著高于AA基因型個體(P＜0.01)，GA基因型個體鑒定時的踝骨寬差異極顯著高于AA基因型個體(P＜0.01)。

表5 MyoG基因與胴體體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

注：同列數(shù)據(jù)不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）、不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）、相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動物肌肉組織中的肌纖維在胚胎時期就已經(jīng)形成，且動物出生以后肌纖維數(shù)目不改，肌肉的生長發(fā)育主要依靠肌細胞分化增殖從而促使肌纖維的長度增加和直徑增大，而不是依靠肌肉細胞的增殖，因此動物的肌纖維數(shù)目的多少決定了它產(chǎn)肉能力的大小[14]。MyoG基因是MRFs基因家族中唯一可在所有骨骼肌細胞中可表達的基因。MyoG基因可以調(diào)控肌細胞分化，促使單核成肌細胞融合為多核肌管，終止成肌細胞的增殖[15]。

本試驗利用DNA雙向測序技術(shù)和飛行時間質(zhì)譜分型技術(shù)檢測了434只特克塞爾×哈薩克橫交F2代綿羊MyoG基因的多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了6個位于內(nèi)含子上的SNP位點，均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。其中rs407552631、rs400160301和rs405981477屬于中度多態(tài)，rs600781279、rs410212255和rs419534498屬于低度多態(tài)。把突變位點與胴體體尺性狀的相關(guān)性進行分析，共發(fā)現(xiàn)4個與胴體體尺性狀相關(guān)的SNP位點，在rs600781279中存在AA、AG、GG三種基因型，其中GG基因型個體的踝骨寬差異極顯著高于AG基因型個體(P＜0.01)。在rs407552631中存在GG、GT、TT三種基因型，其中GT基因型個體的胴體長、臀寬和踝骨寬差異顯著高于TT基因型個體(P＜0.05)，TT基因型個體的肩寬極顯著低于GT基因型個體(P＜0.01)。在rs410212255中存在GA、GG兩種基因型，其中GA基因型個體的胸深差異顯著高于GG基因型個體(P＜0.05)。在rs400160301中存在GG、GA、AA三種基因型，其中GA基因型個體的胴體長差異顯著高于AA基因型個體(P＜0.05)，GA基因型個體的臀寬差異極顯著高于AA基因型個體(P＜0.01)，GG基因型個體的臀寬差異極顯著高于AA基因型個體(P＜0.01)，GG基因型個體的肩寬和胸深差異顯著高于AA基因型個體(P＜0.05)，GA基因型個體的踝骨寬極差異顯著高于AA基因型個體(P＜0.01)。

韓銀倉等[14]運用PCR-SSCP和DNA測序的方法對3個群體632只藏羊的MyoG基因第一外顯子進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第一外顯子的109 bp處存在單堿基突變，該SNP變異導(dǎo)致MyoG基因第一外顯子37號位的編碼的氨基酸發(fā)生突變，由谷氨酸(GAG)突變?yōu)楸彼?GCG)。其與藏羊生長性狀關(guān)聯(lián)分析表明，在貴南縣藏羊群體中AA基因型CA和基因型個體鑒定時的體長差異顯著大于CC基因型個體(P＜0.05)，在河南歐拉羊群體中AA基因型個體鑒定時的體高、體重和體長均差異顯著小于CC基因型個體(P＜0.05)，在祁連縣高原藏羊群體中AA基因型個體鑒定時的體重差異顯著小于CC基因型個體(P＜0.05)。Junior等[16]通過測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)在圣伊內(nèi)斯羊(Santa Inês sheep)MyoG基因中有17個SNP位點，但并沒有分析這17個SNPs與胴體體尺性狀的相關(guān)性。然而，其中6個SNP位點與本文報道的6個SNP位點相同。目前對綿羊MyoG基因的研究較少，本次研究新發(fā)現(xiàn)4個與綿羊胴體體尺性狀相關(guān)的SNP位點，為與綿羊胴體體尺性狀相關(guān)的分子標記的篩選提供了參考和理論基礎(chǔ)。因此，后續(xù)試驗可以增加不同品種綿羊的群體數(shù)量，深入探討MyoG基因與綿羊胴體體尺性狀相關(guān)性。

4 結(jié) 論

本試驗檢測特克塞爾×哈薩克橫交F2代綿羊群體中MyoG基因的SNP位點，并分析了這些SNP位點對胴體體尺性狀的相關(guān)性。MyoG基因rs600781279、rs407552631、rs410212255和rs400160301與綿羊胴體長、肩寬、胸深、臀寬和踝骨寬顯著相關(guān)。其中，rs600781279與踝骨寬顯著相關(guān)，rs407552631與胴體長、肩寬、臀寬和踝骨寬顯著相關(guān)，rs410212255與胸深顯著相關(guān)，rs400160301與肩寬、胸深、臀寬和踝骨寬顯著相關(guān)。研究為MyoG基因作為綿羊胴體體尺性狀的候選基因應(yīng)用于綿羊遺傳育種提供了參考。