郝璞,薄高峰,劉璐,白鶴鳴,吳鳳霞,周星雨,楊海峰
(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)
CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為近年來被廣泛開發(fā)應(yīng)用的基因編輯工具,主要由核酸內(nèi)切酶Cas9和一個(gè)單分子向?qū)NA(single guide RNA,sgRNA)組成,通過RNA與目標(biāo)DNA的互補(bǔ)配對(duì),Cas9蛋白在目標(biāo)序列進(jìn)行特異切割,造成DNA雙鏈斷裂,通過激活細(xì)胞自身修復(fù)機(jī)制——非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)來實(shí)現(xiàn)基因敲除、插入以及染色體重組等,最終導(dǎo)致隨機(jī)突變的產(chǎn)生[1]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)最早應(yīng)用于動(dòng)物和微生物中,后證實(shí)在水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(Nicotiana benthamiana)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)等植物中也能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)編輯[2-8];之后宋時(shí)奎等[9]整理了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在單子葉和雙子葉植物中基因組定點(diǎn)編輯的案例,得出該系統(tǒng)在植物基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯的可行性,特別是由于嵌合sgRNA的成功設(shè)計(jì),使其應(yīng)用更加簡(jiǎn)單方便。此后CRISPR/Cas9被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,在動(dòng)植物基因功能驗(yàn)證、農(nóng)作物性狀改良以及人類疾病治療方面展現(xiàn)出了巨大的發(fā)展前景[10,11]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)是分子育種學(xué)上革命性的技術(shù)突破,也是現(xiàn)代基因組學(xué)靶向修飾工作的巨大進(jìn)步[12]。
INRA717-1B4雜交楊(Populus tremula L.×P.alba L.),屬白楊派落葉喬木,具有基因組小、實(shí)驗(yàn)特性優(yōu)良、易轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)繁殖迅速等特點(diǎn)[13]。作為木本植物的模式物種,CRISPR/Cas9系統(tǒng)在楊樹中實(shí)現(xiàn)了廣泛應(yīng)用。Fan等[14]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)完成了楊樹內(nèi)源基因定點(diǎn)突變,成功敲除毛白楊(P.tomentosa Carr.)PDS基因(phytoene desaturase gene),導(dǎo)致楊樹葉片白化。Zhou等[15]利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功編輯717-1B4楊的4CL1和4CL2基因(4-coumarate:CoA ligase gene)。Bruegmann等[16]針對(duì)717-1B4楊選取了12個(gè)基因,包括調(diào)控開花時(shí)間基因SOC1、FUL及其同源基因、4個(gè)NFP基因和TOZ19基因,轉(zhuǎn)化獲得15個(gè)抗性株系,經(jīng)PCR鑒定均為陽性植株。本研究利用CRSPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)TAC基因進(jìn)行敲除,以期為TAC在717-1B4楊的基因功能驗(yàn)證提供研究依據(jù),并為其他作物TAC同源基因的功能驗(yàn)證提供材料。
INRA717-1B4雜交楊(Populus tremula L.×P.alba L.,簡(jiǎn)稱717-1B4楊),取自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院教研室;717-1B4楊全基因組數(shù)據(jù)信息源于717-1B4楊基因組數(shù)據(jù)庫(aspendb.uga.edu/databases/spta-717-genome);入 門 載體pEn-Chimera、表達(dá)載體pDE-CAS9-NPTⅡ,均由美國農(nóng)業(yè)部林務(wù)局西南太平洋工作站林木遺傳所贈(zèng)送;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DB3.1感受態(tài)細(xì)胞,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞,購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。
1.2.1 717-1B4楊TAC基因靶位點(diǎn)序列的設(shè)計(jì) CRISPR/Cas9系統(tǒng)的切割過程主要憑借核糖核蛋白復(fù)合物crRNA和Cas蛋白,掃描外源序列的protospacer以及PAM,PAM序列不顯現(xiàn)在靶點(diǎn)序列里。選擇靶點(diǎn)時(shí)要盡量保證其特異性,從而降低脫靶概率。靶點(diǎn)要求長(zhǎng)度為20 bp,靶位點(diǎn)特異性高,不要出現(xiàn)連續(xù)多個(gè)A或者T,3′端要有PAM序列,引物不顯示PAM序列。在717-1B4楊中TAC基因的第一個(gè)旁系同源基因(Potri.002G175300)和第二個(gè)旁系同源基因(Potri.014G102600)篩選外顯子序列,評(píng)估靶點(diǎn)的脫靶效應(yīng)及GC含量,GC含量保證在40%~70%之間,設(shè)計(jì)兩個(gè)靶位點(diǎn)sgRNA,分別命名為pDe-TAC1-1和pDe-TAC2-1。利用717-1B4楊基因組數(shù)據(jù)庫及推薦的靶位點(diǎn)(spta717grnas.csv)結(jié)合毛果楊等相關(guān)基因組進(jìn)行靶點(diǎn)比對(duì),確保靶點(diǎn)的特異性。根據(jù)靶點(diǎn)合成相應(yīng)引物(表1),由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成,純化級(jí)別為PAGE。
表1 本研究所用引物
1.2.2 pEn-Chimera入門載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化利用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ將pEn-Chimera載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切,酶切體系(20μL):pEn-Chimera 10μL、10×NEB buffer 2μL、NEB BbsⅠ1μL、ddH2O 7μL。37℃孵育1 h,孵育后的產(chǎn)物70℃反應(yīng)15 min,使BbsⅠ失活。線性化后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物,使用試劑盒(EasyPure?Quick Gel Extraction Kit)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收,得到線性化pEn-Chimera入門載體。取上下游靶位點(diǎn)引物TAC1-1-F/R或TAC2-1-F/R各2 μL、ddH2O 46μL于離心管中混勻,95℃處理5 min后取出,室溫冷卻20 min,制備靶點(diǎn)互補(bǔ)雙鏈。取pEn-Chimera入門載體2μL、互補(bǔ)帶有靶點(diǎn)序列的產(chǎn)物3μL、T4連接酶1μL、T4 Buffer 5μL于200μL PCR管中混勻,25℃反應(yīng)1 h,之后65℃反應(yīng)15 min,進(jìn)行載體與靶點(diǎn)序列T4酶的連接反應(yīng),最后采用電擊法進(jìn)行DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化,并過夜培養(yǎng)。挑選單菌落,以M13F為上游引物、TAC1-1-R或TAC2-1-R為下游引物,上下游引物各1μL,Premix rTaq 10μL,ddH2O 8 μL,進(jìn)行序列擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存,1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),篩選陽性菌落,測(cè)序。
取pEn-Chimera入門載體2μL、pDE-CAS9-NPTⅡ表達(dá)載體3μL、TE buffer 4μL、LR clonaseⅡ1μL于PCR管中,25℃反應(yīng)6 h,構(gòu)建LR反應(yīng)。取50μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞,加入LR反應(yīng)產(chǎn)物,混勻,冰浴30 min,42℃熱激45 s,再次冰浴2 min,加入500μL無菌LB培養(yǎng)基,37℃、200 r/min培養(yǎng)1 h,實(shí)現(xiàn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂開,37℃過夜培養(yǎng)。以TAC1-1-F或TAC2-1-F為上游引物、SS102為下游引物,上下游引物各1 μL,Premix rTaq 10μL,ddH2O 8μL,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存,1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),陽性菌落進(jìn)行測(cè)序。
取農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞100μL加入0.01~1.00μg表達(dá)載體質(zhì)粒,混勻,冰上靜置5 min,液氮冷凍5 min,37℃水浴5 min,冰浴5 min,加入700μL LB液體培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)2~3 h。6 000r/min離心1 min,取100μL上清重懸菌塊,在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂開,28℃倒置培養(yǎng)2~3 d。取SS61和靶點(diǎn)反向序列TAC1-1-R或TAC2-1-R各1μL,Premix rTaq 10μL,ddH2O 8μL于PCR管中混勻,使用槍頭蘸取單菌落于離心管中,PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃恒溫保存。1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化檢測(cè)。
利用葉盤法進(jìn)行717-1B4楊的轉(zhuǎn)化。①預(yù)培養(yǎng):取生長(zhǎng)良好、無病害的717-1B4楊組培苗自上而下第三片到第五片葉,使用打孔器沿葉脈方向進(jìn)行打孔取材,置于CIM愈傷誘導(dǎo)(無抗生素)培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)。②菌種活化與培養(yǎng):取農(nóng)桿菌于含Rif和Spec的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線,28℃倒置培養(yǎng),篩選單菌落進(jìn)行搖菌活化,180 r/min、28℃暗培養(yǎng)至OD600為0.3~0.5。③侵染:將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行離心,重懸,重懸OD600值為0.3~0.5,振蕩侵染葉片10 min,50~100 r/min離心,過濾菌體,取出葉片。④共培養(yǎng):將葉片于CIM愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(無抗生素)上,28℃暗培養(yǎng)2~3 d,直至葉片背面出現(xiàn)環(huán)形菌斑,但無大面積形成。⑤選擇培養(yǎng):取出共培養(yǎng)的葉片,ddH2O洗滌3次,每次5 min,清洗液洗滌1次,轉(zhuǎn)移至抗Kana的CIM愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,28℃暗培養(yǎng)2周后,更換新的抗Kana的CIM愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)為28℃光下培養(yǎng)1周,促進(jìn)愈傷的形成。⑥使用Kana抗性的SIM芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo),直到不定芽生長(zhǎng)至1~2 cm,切下置于Kana抗性SEM芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基組培瓶中進(jìn)行光下伸長(zhǎng)培養(yǎng),直到獲得抗性植株。
使用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉片DNA,以序列TAC1-1-F或TAC2-1-F為上游引物、SS102為下游引物,PCR擴(kuò)增體系(20 μL):上、下游引物各1μL、DNA 1μL、2×Easy Taq PCR Super Mix 10μL、ddH2O 7μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃恒溫保存,取10μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),篩選陽性植株。
以轉(zhuǎn)基因植株DNA為模板,使用引物TLZF和TLZ-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(20μL):上、下游引物TLZ-F、TLZ-R各1μL,模板DNA 1μL,2×Easy Taq PCR Super Mix 10μL,ddH2O 7μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。4℃恒溫保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pMD19-T載體連接,取5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,在AMP抗性的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12~16 h,挑選完整、圓潤的20個(gè)單菌落進(jìn)行菌落檢測(cè),取陽性菌斑進(jìn)行活化、測(cè)序,利用DNAMAN(Version 7.0)對(duì)測(cè)序結(jié)果與靶點(diǎn)序列進(jìn)行比對(duì),計(jì)算編輯效率。
利用717-1B4楊基因組數(shù)據(jù)庫及推薦的靶位點(diǎn),結(jié)合已知的水稻、擬南芥基因序列,將717-1B4楊和毛果楊基因組序列進(jìn)行對(duì)比,在毛果楊中確定2個(gè)TAC同源基因Potri.002G175300、Potri.014G102600,將其與717-1B4楊中的2個(gè)TAC同源基因進(jìn)行比對(duì),序列相似度分別高達(dá)97.65%和98.01%(圖1)。表明717-1B4楊TAC基因組序列為TAC-like基因的旁系同源基因。根據(jù)基因編輯靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)了717-1B4楊中2個(gè)TAC同源基因的2個(gè)單基因編輯靶點(diǎn),其中第一個(gè)同源基因的基因編輯位點(diǎn)位于外顯子第323個(gè)核苷酸處,第二個(gè)同源基因的基因編輯位點(diǎn)位于外顯子第58個(gè)核苷酸處。靶點(diǎn)均位于基因的前中端。
圖1 TAC基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹
電泳檢測(cè)結(jié)果(圖2)表明,目標(biāo)條帶約369 bp,與預(yù)期目標(biāo)片段一致。經(jīng)測(cè)序比對(duì),TAC1-1、TAC2-1基因靶點(diǎn)已成功進(jìn)入pEn-Chimera載體,表明TAC1-1、TAC2-1入門載體連接成功。
圖2 入門載體的PCR鑒定
將攜帶靶點(diǎn)序列的入門載體pEn-Chimera通過同源置換反應(yīng)構(gòu)建pDE-CAS9-NPTⅡ表達(dá)載體。電泳檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明,目標(biāo)條帶約933 bp,與預(yù)期目標(biāo)片段一致,且無明顯非特異性擴(kuò)增。經(jīng)測(cè)序分析,TAC1-1、TAC2-1入門載體已成功置換pDE-CAS9-NPTⅡ表達(dá)載體中,表明pDE-CAS9-NPTⅡ::TAC1-1、pDE-CAS9-NPTⅡ::TAC2-1表達(dá)載體構(gòu)建成功。
圖3 表達(dá)載體的PCR鑒定
將構(gòu)建成功的基因編輯載體pDE-CAS9-NPTⅡ::TAC1-1、pDE-CAS9-NPTⅡ::TAC2-1通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化717-1B4楊。經(jīng)外植體葉片預(yù)培養(yǎng)、抗性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)、抗性芽的分化和伸長(zhǎng)培養(yǎng)、生根與增殖培養(yǎng),pDE-CAS9-NPTⅡ::TAC2-1載體成功獲得抗性苗(圖4)。
圖4 轉(zhuǎn)基因植株獲得過程
對(duì)獲得的20株抗性苗進(jìn)行鑒定,以攜帶靶點(diǎn)的質(zhì)粒為陽性對(duì)照,野生型717-1B4楊為陰性對(duì)照,進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果(圖5)表明,1、2、4、6、8、11、12、15、16、18、19、20號(hào)共12個(gè)株系檢測(cè)為陽性,PCR陽性鑒定轉(zhuǎn)化率為60%。
圖5 轉(zhuǎn)基因陽性苗鑒定
在獲得的12株轉(zhuǎn)基因植株中,基因靶標(biāo)序列位點(diǎn)在8號(hào)、15號(hào)株系中均發(fā)生堿基缺失,其中8號(hào)株系靶點(diǎn)的第11、12個(gè)堿基發(fā)生缺失,15號(hào)株系靶點(diǎn)的第5~9個(gè)堿基發(fā)生缺失,靶點(diǎn)編輯效率16.7%,均為雜合突變體。其余株系均如株系1、2、4號(hào)未發(fā)生基因缺失或插入(圖6)。
圖6 靶點(diǎn)基因突變類型
TAC基因作為IGT基因家族的一員,主要參與植物地上部的分枝角度以及側(cè)枝生長(zhǎng)方向的調(diào)控。在水稻、玉米、桃樹、擬南芥等植物中,TAC1通過調(diào)控枝條的向地性,影響植物的分枝角度[17];在水稻中,TAC2突變體表型與TAC1接近。因此,本試驗(yàn)以TAC基因?yàn)槔O(shè)計(jì)了兩個(gè)基因靶點(diǎn),構(gòu)建入門載體和表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化717-1B4楊,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得抗性植株,并對(duì)抗性植株進(jìn)行鑒定、靶點(diǎn)編輯檢測(cè)及靶點(diǎn)編輯效率分析,旨在為后續(xù)717-1B4楊I(lǐng)GT基因家族TAC基因功能的研究提供數(shù)據(jù)參考。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新興基因編輯技術(shù),具有廣泛的應(yīng)用前景,僅需設(shè)計(jì)1~2個(gè)目標(biāo)靶向序列就可以引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)目的基因進(jìn)行特異性的結(jié)合修飾,最終導(dǎo)致基因突變或敲除,極大地推動(dòng)了基因基礎(chǔ)研究的發(fā)展[18]。研究顯示,利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯植物基因組DNA,產(chǎn)生的突變類型多為堿基缺失和插入,且堿基缺失突變頻率遠(yuǎn)高于堿基插入突變頻率[19,20]。本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行編輯,從陽性植株中篩選獲得2株雜合突變體,且均為堿基缺失,基因編輯效率16.7%,說明717-1B4楊TAC基因產(chǎn)生的堿基缺失突變頻率較高,與前人研究結(jié)論一致。
本研究構(gòu)建的兩個(gè)表達(dá)載體為單靶點(diǎn)基因編輯載體,TAC基因的靶位點(diǎn)符合設(shè)計(jì)要求,GC堿基含量為40%,但靶位點(diǎn)編輯效率較低。有研究指出,通常情況下單個(gè)sgRNA只能靶向1個(gè)基因位點(diǎn),編輯效率低且不穩(wěn)定,而多個(gè)sgRNA靶向同一基因的不同位點(diǎn),不僅可以提高基因編輯頻率,還可能造成大片段的堿基突變[21]。胡春華等[22]利用改良的CRISPR/Cas9多靶點(diǎn)載體系統(tǒng),以香蕉MaPDS基因?yàn)槔晒?shí)現(xiàn)了對(duì)香蕉內(nèi)源基因的定點(diǎn)敲除,獲得白化突變體株系。汪秉琨等[23]構(gòu)建了Wx基因雙靶點(diǎn)CRISPR/Cas9表達(dá)載體,也獲得多個(gè)位點(diǎn)突變的個(gè)體。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的編輯效率受其他多種因素的影響,如Cas9蛋白活性[24]、靶標(biāo)數(shù)量、sgRNA啟動(dòng)子[25]、靶點(diǎn)序列GC含量[26]及載體的sgRNA表達(dá)量[27]等,甚至還會(huì)出現(xiàn)脫靶情況[28]。Slaymaker等[29]對(duì)Cas9蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了完善,提高了表達(dá)載體的突變效率,減少了脫靶情況。Ma等[30]在水稻研究中發(fā)現(xiàn)靶位點(diǎn)序列的GC含量較高(50%~70%)時(shí)編輯效率相對(duì)更高。Dang等[31]在原有sgRNA長(zhǎng)度的基礎(chǔ)上增加了10個(gè)堿基,完善了sgRNA骨架序列,結(jié)果表明完善后的基因編輯效率提高約50%。Fu等[32]探討了突變效率與sgRNA長(zhǎng)度的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)其自身活性不受影響的前提下,控制sgRNA長(zhǎng)度在17~18 nt可以明顯降低脫靶效應(yīng)。以本試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),在運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)物種進(jìn)行編輯時(shí),可以嘗試對(duì)該物種所用的sgRNA長(zhǎng)度、Cas9載體、GC含量、蛋白結(jié)構(gòu)等進(jìn)行優(yōu)化,從而獲得更高的編輯效率。
本試驗(yàn)pDE-CAS9-NPTⅡ::TAC2-1載體成功獲得抗性苗,pDE-CAS9-NPTⅡ::TAC1-1載體未獲得抗性苗,植株遺傳轉(zhuǎn)化的方法、品種等因素可能是原因之一;717-1B4楊作為試驗(yàn)材料,在遺傳轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)浸染時(shí)發(fā)現(xiàn)植株外植體容易發(fā)生褐化死亡、農(nóng)桿菌過度污染導(dǎo)致死亡等問題,對(duì)抗性植株的獲得造成了極大阻礙,在參考劉閔豪[33]、蘇文龍[34]等對(duì)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液侵染濃度以及農(nóng)桿菌侵染時(shí)間等一系列優(yōu)化調(diào)整后,農(nóng)桿菌過度污染等問題得到緩解。本試驗(yàn)基于CRISPR/Cas9技術(shù),成功構(gòu)建了717-1B4楊TAC基因敲除表達(dá)載體,并獲得了基因突變植株,后續(xù)將移入土中繼續(xù)進(jìn)行觀察與分析,為深入研究TAC基因的生物學(xué)功能及分子機(jī)制提供良好的數(shù)據(jù)參考。
本研究利用717-1B4楊基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建了TAC基因敲除表達(dá)載體,并對(duì)717-1B4楊進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化,共獲得12個(gè)株系抗性苗,基因編輯效率為16.7%,為CRISPR/Cas9技術(shù)在717-1B4楊中的應(yīng)用做了初步探索,同時(shí)為TAC基因功能的研究和分子育種提供理論依據(jù)。