付有晴 婁季武 趙穎 李根洪 駱玥瑜 譚淑娟 劉彥慧

東莞市婦幼保健院（東莞 523000）

聽(tīng)力損失（Hearing loss，HL）是中國(guó)最常見(jiàn)的先天缺陷之一，在新生兒中的發(fā)生率為1/1000-3/1000[1]。WHO調(diào)查顯示在3.6億HL的人群中，兒童占有3200萬(wàn)。HL與很多因素有關(guān)，包括有遺傳因素和環(huán)境因素，或兩者之間的相互作用[2]。據(jù)報(bào)道，50%的HL與遺傳因素有關(guān)，其中70%為非綜合征性聽(tīng)力損失（non-syndromic hearing loss，NSHL），大約80% NSHL是常染色體隱性遺傳的[3,4]，根據(jù)分子病因?qū)W表明，GJB2，GJB3，SLC26A4和線粒體12Sr RNA（mtDNA 12Sr RNA）是導(dǎo)致NSHL最常見(jiàn)的4個(gè)基因[5-9]。因此，本研究擬對(duì)常見(jiàn)的這4個(gè)基因進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，以明確HL病因，并對(duì)有生育或再生育要求的遺傳性HL家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷從而有效的避免HL患兒的出生。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年6月-2019年9月就診于東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心和耳鼻喉科門(mén)診的HL高危人群，包括有家族史、曾生育HL患兒史、夫婦一方或雙方為HL者、家庭中有成員為耳聾基因篩查陽(yáng)性者。對(duì)所有高危人群進(jìn)行臨床資料采集，包括基本資料、家族史、用藥史、患病史、聽(tīng)力篩查及診斷結(jié)果、顳骨CT和MRI等結(jié)果。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的采集與處理

經(jīng)研究對(duì)象知情同意后，抽取外周靜脈血3ml，紫色EDTA抗凝。而對(duì)于接受產(chǎn)前診斷的孕婦，在超聲引導(dǎo)下，根據(jù)妊娠的孕周選擇適當(dāng)?shù)娜〔姆椒?，妊娠約11-13w時(shí)行絨毛膜取樣，16-22w時(shí)行羊膜腔穿刺羊水取樣，22-37w時(shí)行臍帶血穿刺臍血取樣。用試劑盒（廈門(mén)致善生物技術(shù)有限公司）提取樣本DNA，紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000對(duì)DNA進(jìn)行濃度及純度測(cè)定后進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序，整個(gè)測(cè)序反應(yīng)由廣州凱普生物科技有限公司完成，使用PCR技術(shù)對(duì)SLC26A4、GJB2、GJB3、mtDNA 12Sr RNA這4個(gè)基因的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并采用特異性引物進(jìn)行Sanger測(cè)序檢測(cè)，特異性引物的設(shè)計(jì)是專(zhuān)門(mén)針對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)，并覆蓋該位點(diǎn)上下游的序列，將標(biāo)本檢測(cè)得到的序列與NCBI所提供SLC26A4基因參考序列（NG_008489.1）/（NM_000441.1）、GJB2基因參考序列（NM_004004.5）、GJB3基因參考序列（NM_001005752.1）、mtDNA 12Sr RNA基因參考序列（NC_012920.1）進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 隨訪

所有新生兒出生后均隨訪其聽(tīng)力篩查結(jié)果，以確定是否存在HL及HL的性質(zhì)及程度，包括：①畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（Distortion product otoacoustic emission，DPOAE）檢測(cè)；②聽(tīng)性腦干反應(yīng)檢測(cè)（Automated auditory brainstem response，AABR）。

2 結(jié)果

2.1 HL高危人群組成情況

在319例HL高危人群中，包括89（252例）個(gè)HL高危家庭和67例個(gè)人，89個(gè)高危家庭中，已生育聾兒家庭48（149例）個(gè)，夫婦一方或雙方為HL患者的家庭9個(gè)，家庭成員為HL基因篩查陽(yáng)性者或有家族史的家庭共32個(gè)；67例個(gè)人中，HL患者共43例，有家族史3例，家庭成員為HL基因篩查陽(yáng)性者6例，要求進(jìn)行耳聾基因檢查者15例。其他31例。

2.2 HL基因檢測(cè)結(jié)果

共發(fā)現(xiàn)182人攜帶致聾基因突變，檢出率57.05%。其中GJB2基因突變109例（純合突變和復(fù)合雜合突變24例，雜合85例），占59.89%；SLC26A4基因52例（純合突變和復(fù)合雜合突變8例，雜合44例），占28.57% ；mtDNA 12Sr RNA基因突變13例（1555A＞G同質(zhì)性突變7例，異質(zhì)性突變1例，1494C＞T同質(zhì)性突變3例，7444G＞A同質(zhì)性突變2例），占7.14%；GJB3基因雜合突變4例，占2.20%；GJB2/SLC26A4雙雜合突變型3例，占1.65%；GJB3/SLC26A4雙雜合突變型1例，占0.55%。詳見(jiàn)表1。

表1 182例HL高危人群攜帶致聾基因突變的基因型Table 1 Genotypes of deaf-causing gene mutations in 182 high-risk groups of HL

2.2.1 89個(gè)高危家庭HL基因檢測(cè)結(jié)果

在已生育聾兒48個(gè)高危家庭中，明確HL病因的家庭21個(gè)，包括GJB2基因純合和復(fù)合雜合突變15個(gè)，SLC26A4基因純合和復(fù)合雜合突變6個(gè)；未明確HL病因的家庭27個(gè)，包括GJB2基因雜合突變5個(gè)，SLC26A4基因雜合突變5個(gè)，GJB3基因雜合突變1個(gè)，正常的16個(gè)。在剩下的41個(gè)高危家庭中，攜帶有HL基因突變家庭29個(gè)，其中雙方攜帶HL基因突變家庭8個(gè)：包括雙方均為GJB2基因雜合突變2個(gè)；雙方均為SLC26A4基因雜合突變2個(gè)；一方為SLC26A4基因雜合突變，一方為SLC26A4基因純合突變1個(gè)；一方為GJB2基因雜合突變，一方為SLC26A4基因雜合突變2個(gè)；一方為GJB2基因雜合突變，一方為mtDNA 12Sr RNA同質(zhì)性突變1個(gè)。一方為HL基因攜帶者家庭21個(gè)：包括GJB2基因純合突變2個(gè)，雜合突變5個(gè)；SLC26A4基因雜合突變7個(gè)；mtDNA 12Sr RNA同質(zhì)性突變7個(gè)，其中5個(gè)為女方，2個(gè)為男方。正常的12個(gè)。

2.2.2 67例個(gè)人HL基因檢測(cè)結(jié)果

在67例個(gè)人中，攜帶HL常見(jiàn)基因者共30例。在32例HL患者中，攜帶HL基因者17例，包括GJB2基因純合突變2例，雜合突變9例；SLC26A4基因純合突變1例，雜合突變2例；GJB3基因雜合突變1例；GJB2基因純合突變合并SLC26A4基因雜合突變1例；GJB2基因雜合突變合并SLC26A4基因雜合突變1例。在其他35例正常個(gè)人中，攜帶HL基因者13例，包括GJB2基因純合突變1例，雜合突變7例；SLC26A4基因雜合突變4例；GJB3基因雜合突變1例。

2.3 HL產(chǎn)前診斷及隨訪結(jié)果

在89個(gè)高危家庭中，夫婦雙方均為耳聾同基因型攜帶者29個(gè)，目前6例已妊娠并進(jìn)入產(chǎn)前診斷流程，其中初次妊娠者3例，再次妊娠者3例。共采集羊水標(biāo)本4例，絨毛標(biāo)本2例。結(jié)果顯示1例胎兒為GJB2純合突變，在知情同意下已終止妊娠；4例為GJB2雜合突變，1例為正常，隨訪至出生，均通過(guò)了聽(tīng)力篩查檢測(cè)。詳見(jiàn)表2。

表2 6例孕婦的產(chǎn)前診斷結(jié)果Table 2 Prenatal diagnosis results of 6 pregnant women

3 討 論

由于HL的遺傳異質(zhì)性和表型多樣性，在臨床上為患者提供適當(dāng)?shù)倪z傳咨詢(xún)?nèi)悦媾R著巨大挑戰(zhàn)。到目前為止，數(shù)百種與遺傳性HL相關(guān)的基因被確定。而大多數(shù)NSHL是由GJB2，SLC26A4，mtDNA 12Sr RNA和GJB3這四個(gè)基因突變所引起的[5,7]。以此為HL基因的產(chǎn)前診斷提供了相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。在本研究中，用Sanger測(cè)序分析了319例HL高危人群中這四個(gè)基因的43個(gè)突變位點(diǎn)，結(jié)果表明，在109例（59.89%）攜帶GJB2基因突變的患者中，20例為GJB2基因純合突變，4例為GJB2基因復(fù)合雜合突變，85例為GJB2基因單雜合突變。其中235delC最常見(jiàn)，占19.4%（62/319），其次是109G＞A和176_191del16bp，分別占15.0%（48/319）和0.94%（3/319）。研究表明在中國(guó)人群中[8,9]，GJB2基因最常見(jiàn)的突變類(lèi)型是235delC，299_300delAT和176_191del16bp，本次研究結(jié)果與之較一致，但新增了109G＞A的突變位點(diǎn)，本次研究發(fā)現(xiàn)109G＞A純合突變11例，其HL程度以輕中度為主，有7例表現(xiàn)為單/雙耳輕度異常，2例表現(xiàn)為雙耳中度異常，2例正常；235delC和109G＞A的復(fù)合雜合子3例，其中1例為雙耳輕度異常，1例為左耳重度異常。在早期研究中，由于109G＞A突變?cè)谡Ｈ巳褐械母邤y帶率，故認(rèn)為是良性多態(tài)性[10,11]。然而，在越來(lái)越多的HL患者中鑒定出109G＞A純合突變或合并GJB2基因其它致病性位點(diǎn)的復(fù)合雜合子，認(rèn)為109G＞A可能增加HL的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是導(dǎo)致輕度或中度的HL，并具有不完全的外顯率[12-16]，目前已明確109G＞A是致病變異[17]，約65%的109G＞A突變患者患有先天性HL，其余35%的患者發(fā)病延遲?；颊叩腍L程度從正常到嚴(yán)重HL不等，其嚴(yán)重程度與年齡密切相關(guān)[18,19]。

SLC26A4基因突變會(huì)引起大前庭導(dǎo)水管綜合征（Enlargement of the vestibular aqueduct,EVA），其突變頻率僅次于GJB2基因[20]。在東亞和高加索人群中，SLC26A4突變引起5-7%先天性的隱性聽(tīng)力障礙。目前，SLC26A4基因中有超過(guò)140個(gè)突變被報(bào)道，在SLC26A4基因編碼區(qū)域中和剪接位點(diǎn)檢測(cè)到大量突變，而較少的突變發(fā)現(xiàn)在非編碼外顯子1和FOX1結(jié)合內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。Yuan[21]等人研究發(fā)現(xiàn)在中國(guó)人群中，最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為IVS7-2A＞G，2168A＞G和1174A＞T。在本次研究中，發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是IVS7-2A＞G，2168A＞G和1229C＞T，與Yuan等人的發(fā)現(xiàn)較一致。本研究中，在48個(gè)已生育聾兒家庭中，檢測(cè)出聾兒SLC26A4基因純合突變或復(fù)合雜合突變6個(gè)，其中2個(gè)患兒顳骨CT/MRI檢測(cè)有EVA；SLC26A4基因單雜合突變5個(gè)，5個(gè)患兒均有EVA，基因型均為IVS7-2A＞G單雜合突變。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[22,23]，大約有70%的SLC26A4單雜合突變合并有EVA，部分學(xué)者推測(cè)可能在此基因的啟動(dòng)子區(qū)域或者具有潛在剪切位點(diǎn)的內(nèi)含子區(qū)存在另一個(gè)突變，或與功能性相關(guān)的基因（FOX11，KCNJ10）編碼區(qū)相關(guān)，從而導(dǎo)致患兒出現(xiàn)EVA。因此對(duì)于SLC26A4單雜合突變者，需密切觀察聽(tīng)力變化，并聯(lián)合影像學(xué)檢查觀察。

本研究中，發(fā)現(xiàn)13名患者攜帶mtDNA 12Sr RNA1555A＞G突變，占7.14%。攜帶mtDNA 12Sr RNA突變可導(dǎo)致氨基糖苷類(lèi)藥物引起的HL[24]。由于臨床實(shí)踐中對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的嚴(yán)格控制，導(dǎo)致因藥物引起的HL患者比例很小。在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)4名患者攜帶GJB3基因突變位點(diǎn)，均為單雜合突變。

本次研究中，已生育聾兒家庭中，有16個(gè)HL患兒未檢出HL基因突變，考慮患兒可能存在本次檢測(cè)范圍外的其他突變位點(diǎn)的存在。據(jù)相關(guān)的研究表明，我國(guó)非綜合征HL患者中約1/3可通過(guò)常見(jiàn)HL基因全序列檢測(cè)明確分子病因及致聾突變，另有1/6可通過(guò)二代測(cè)序等手段在已知的罕見(jiàn)HL基因中明確病因及突變，而近半數(shù)患者經(jīng)以上檢測(cè)后仍病因不明[25]。這部分患者可能為一些環(huán)境因素所致，如巨細(xì)胞病毒感染、頭部創(chuàng)傷、耳毒性藥物的使用等，通常這種情況下再生育聾兒的風(fēng)險(xiǎn)不會(huì)特別的增加。但另一方面，這些患者也可能為目前所未知的一些遺傳因素所致，包括未知HL基因突變或已知HL基因的非編碼區(qū)突變及大片段DNA缺失或改變等所導(dǎo)致，這種情況就給臨床上的遺傳咨詢(xún)帶來(lái)很大的難度，期望未來(lái)能有更大范圍和深度的基因篩查與臨床大數(shù)據(jù)的積累及基因突變的功能學(xué)研究以進(jìn)行明確的突變致病性判斷，從而能有效的降低再生育聾兒的風(fēng)險(xiǎn)。

在這項(xiàng)研究中，對(duì)6個(gè)父母雙方均為HL基因攜帶者的高危家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷，遺傳分析和遺傳咨詢(xún)表明1個(gè)胎兒的基因型是與先證者一致，所以這1個(gè)家庭決定終止妊娠。1個(gè)胎兒未發(fā)現(xiàn)突變，其他4個(gè)胎兒的基因型與他們的父母相同，亦為攜帶者。隨訪結(jié)果顯示這5名胎兒出生后聽(tīng)力正常。檢測(cè)耳聾夫婦GJB2，SLC26A4和mtDNA 12Sr RNA基因以確定基因型并根據(jù)基因型估算復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。如果父母攜帶的致病基因位于不同的基因，他們的后代患病的風(fēng)險(xiǎn)較低，不需要產(chǎn)前診斷。如果父母是同種基因突變（GJB2或SLC26A4），它們的后代有25%的耳聾風(fēng)險(xiǎn)，建議產(chǎn)前診斷后進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。如果母親攜帶mtDNA 12Sr RNA突變，他們的兄弟姐妹，母親和后代應(yīng)終身禁止服用氨基糖苷類(lèi)藥物，以有效預(yù)防耳聾的發(fā)生。

在HL高危人群中，HL基因突變攜帶率較高，因此對(duì)高危人群盡早進(jìn)行HL基因篩查，提供相應(yīng)的HL基因診斷，對(duì)HL病因分析和高危家庭夫妻在孕期的產(chǎn)前咨詢(xún)和診斷意義重大，可有效降低再生育聾兒的風(fēng)險(xiǎn)。