彭立

摘 要：目的：選擇高效液相色譜法對糧油制品中黃曲霉毒素B1展開快速測定。方法：提取、凈化并濃縮樣品中黃曲霉毒素B1后，確定流動相為乙酸銨溶液（5 mmol/L）、乙腈-甲醇溶液（50︰50），以梯度洗脫程序為依據(jù)，采取液相色譜法展開測定，定量使用外標法。結(jié)果：在濃度范圍為0.2～20 ng/mL時，黃曲霉毒素B1線性回歸方程為Y=68 577.3X-20 845，R>0.998，線性關(guān)系良好;方法檢出限為0.07 μg/kg、定量限為0.2 μg/kg;加標回收率超過85.0%，RSD不超過5.5%。結(jié)論：本實驗方法結(jié)果準確可靠、重復性好，可用于快速檢測糧油制品中黃曲霉毒素B1。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;糧油食品;黃曲霉毒素;含量測定

Determination of Aflatoxin in Cereals， Oils and Foods by HPLC

PENG Li

（Yichun Grain and Oil Quality Supervision and Inspection Station， Yichun 336000）

Abstract： objective： to develop an HPLC method for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products. Methods： after extraction， purification and concentration of aflatoxin B1 in the sample， the mobile phase was determined as ammonium acetate solution （5 mmol/L） and acetonitrile methanol solution （50：50）. Based on the gradient elution procedure， the determination was carried out by liquid chromatography， and the external standard method was used quantitatively. Results： In the concentration range of 0.2～20 ng/mL， the linear regression equation of aflatoxin B1 was， and the linear relationship was good; The detection limit was 0.07 μg/kg，limit of quantitation 0.2 μg/kg;The recovery rate of standard addition is more than 85.0%，and the RSD is not more than 5.5%.Conclusion： the results of this method are accurate， reliable and reproducible.It can be used for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products.

Keywords： high performance liquid chromatography; grain， oil and food; aflatoxin; content determination

黃曲霉與寄生曲霉等菌株在特定溫濕度條件下會產(chǎn)生黃曲霉毒素，屬于一類二級代謝產(chǎn)物，此類毒素對人體有強烈致癌危害。黃曲霉毒素包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中毒性最強的為黃曲霉毒素B1。由于自然環(huán)境中存在的黃曲霉毒素相對較多，且對人類的危害性極高，因此有必要做好相關(guān)的控制工作。目前，在檢測黃曲霉毒素時多選擇液相色譜法、金標試紙法、酶聯(lián)免疫法及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中，高效液相色譜法具備極高的靈敏度和可觀的準確性，能夠精確定量黃曲霉毒素，因此被廣泛應用于食品中黃曲霉毒素的檢測。本文選擇免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)測定糧油食品中黃曲霉毒素B1。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜級）;乙酸銨（分析純）;0.22 μm

微孔有機濾膜;黃曲霉毒素免疫親和柱;黃曲霉毒素標準溶液（2 μg/mL）。實驗用糧油樣品獲取自近期本地市場抽樣。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀（Agilent 1260）;電子天平（梅特勒ME204E型）;渦旋混合器（vortex genie2）;臺式高速離心機（TG16）。

1.3 實驗方法

1.3.1 配制標準儲備液

精準量取黃曲霉毒素標準溶液，加入適量甲醇稀釋為100 ng/mL濃度的標準儲備液。

1.3.2 配制標準工作液

分別量取0.20 μL、2.00 μL、5.00 μL、10.00 μL、20.00 μL標準儲備液置于樣品瓶內(nèi)，加入初始比例流動相定容，完成濃度分別為0.20 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00 ng/mL標準工作液的配制。

1.3.3 樣品提取

精準稱取5.00 g糧油樣品置于離心管（50 mL），加入甲醇-水溶液（70︰30）25.0 mL，渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至超聲波儀內(nèi)持續(xù)20 min提取后，再持續(xù)10 min離心（6 000 r/min），收集上清液，待凈化。

1.3.4 樣品凈化

精準量取上清液5.0 mL，加入含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液20 mL并混勻，待免疫親和柱原有液體恢復至室溫并流進后，用注射器裝載上述樣液，控制下滴流速為1.0 mL/min，全部下滴后用水淋洗免疫親和柱（分2次，共計耗水20 mL）[1-2]。待滴完水后抽干免疫親和柱，用甲醇洗脫免疫親和柱（分2次，共計使用甲醇2 mL），控制下滴流速為1.0 mL/min，用氮吹管裝載收集的洗脫液，50 ℃下氮氣吹干后，殘渣用初始比例流動相（1 mL）溶解后，過0.22 μm微孔有機濾膜并轉(zhuǎn)移至進樣小瓶內(nèi)，待測。

1.3.5 色譜條件

選擇Shim-pack GIST C18色譜柱，100 mm×2.1 mm，2 μm;40 ℃柱溫，0.3 mL/min柱流量，10 μL進樣體積[3]。流動相A、B分別為乙酸銨溶液（5 mmol/L）、乙腈-甲醇溶液（50︰50）.表1為梯度洗脫程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程及相關(guān)性

根據(jù)1.3.1和1.3.2的步驟完成標準溶液的配制，檢測不同濃度的標準溶液，參照對應化合物濃度（X）和目標化合物響應峰面積（Y）獲取黃曲霉毒素B1線性回歸方程為Y=68 577.3X-20 845，線性范圍為0.2～20 ng/mL，R>0.998。

2.2 方法檢出限

精準量取適量的標準工作溶液，移至空白樣品溶液內(nèi)，加入初始流動相逐級稀釋，以檢出限為信噪比S/N=3為根據(jù)，通過計算獲取0.07 μg/kg的黃曲霉毒素B1檢出限，以定量限為信噪比S/N=10為根據(jù)，通過計算獲取0.2 μg/kg的黃曲霉毒素B1定量限。

2.3 加標回收率及重現(xiàn)性

分別精準稱取空白糧油樣品5.00 g，共計18份，圍繞1 ng/mL、4 ng/mL、15 ng/mL的水平對標準儲備分別進行6次加標，通過處理檢測后得到黃曲霉毒素B1加標回收率及相對標準偏差。加標回收率超過85.0%，RSD處于2.8%～5.5%，見表2。

2.4 實際樣品測定

為對該方法實用性與可靠性展開驗證，參照上述實驗方法對2種能力驗證樣品及3種市場糧油制品進行前處理后，獲取黃曲霉毒素B1含量測定結(jié)果，見表3。根據(jù)兩種能力驗證樣品中測定的黃曲霉毒素B1含量結(jié)果得知，Z比分數(shù)為-0.83，|Z|≤2，結(jié)果滿意，證實了該方法的準確性。以《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中有關(guān)谷物及其制品、油脂及其制品中規(guī)定的黃曲霉毒素B1為5.0～20 μg/kg、10～20 μg/kg的安全限量為根據(jù)，市場糧油制品測定結(jié)果中的黃曲霉毒素B1含量與國家安全限量標準相符合。

2.5 實驗驗證

經(jīng)提取、凈化后的糧油制品，結(jié)合高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1，獲取的結(jié)果與國家安全限量標準相符合，加標回收率超過85.0%，RSD處于2.8%～5.5%。實際樣品檢測中，結(jié)果滿意，證實了方法準確性。本實驗方法結(jié)果準確可靠、重復性好，可用于快速檢測糧油制品中黃曲霉毒素B1。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測方法選擇

目前，可用于檢測黃曲霉毒素的方法有很多，如膠體金試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、薄層色譜法及免疫親和柱-溴化熒光分光光度法等。其中，由于薄層色譜法會消耗大量溶劑，且重現(xiàn)性不太可觀，因此在檢測黃曲霉毒素中并不太適用[4]。膠體金試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法一般在快速篩查黃曲霉毒素中應用，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法能夠同時檢測多種真菌毒素，然而因本身需要使用過于昂貴的儀器，會產(chǎn)生較高的使用成本，故而也不太適用。免疫親和柱無需消耗太多有機溶劑，且特異性強、機制干擾少、靈敏度高，在多種復雜基質(zhì)樣品中適用，在精確定量及確認黃曲霉毒素中十分適用[5]。因此，本試驗在綜合對比多種方法的優(yōu)劣后，最終選擇了免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)對糧油食品中的黃曲霉毒素B1展開測定。

3.2 樣品前處理優(yōu)化

實驗室檢測樣品中黃曲霉毒素時，在樣品前處理方面多以手動凈化的方式為主[6]。但是該凈化方式涉及了過于煩瑣的過程，且會消耗大量時間，每天能夠完成的樣本處理量較少，面對較大樣品量時會暴露出人為因素影響大、時效性低等不足。而通過免疫親和柱在線凈化高效液相色譜法的應用，能將上述不足有效彌補，大幅提升檢測時效性，且能為檢測結(jié)果提供準確性保障。

3.3 流動相選擇

以標準GB 5009.22—2016中洗脫程序為根據(jù)，以甲醇-乙腈和水、乙腈-水、甲醇-乙腈和0.5 mmol/L乙酸銨溶液為對象，對比流動相組合洗脫效果[7]。其中，甲醇-乙腈洗脫效率更顯著，洗脫時間更短。通過乙酸銨溶液的添加，能獲取對稱性良好的峰型，出峰時間更穩(wěn)定，單個樣品測試時間更短。因此，在綜合對比多種流動相的優(yōu)劣后，本實驗中確定流動相為甲醇-乙腈（50︰50）溶液和乙酸銨溶液（0.5 mmol/L）。

3.4 提取劑選擇

本次實驗前對提取劑選擇甲醇-水溶液和乙腈-水溶液時的提取效果展開對比分析，分析得到兩者之間不存在明顯差異，確定提取劑為成本相對更低的甲醇-水[8]。

參考文獻

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