何沖 王彬 賈亦森 張利娟

摘 要：建立了同時測定動物源性食品中、飼料及尿液中17種β-受體激動劑殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜方法（UPLC-MS/MS）。樣品經粉碎后用試樣經含2%甲酸水-乙腈-甲醇溶液勻漿提取，離心后，上清液經凈化后，用高效液相色譜-串聯質譜測定，分別采用內標法和外標法定量。結果表明，17種β-受體激動劑在一定質量濃度范圍1.0～10.0 μg/kg（腎上腺素為50～500 μg/kg）呈現出良好的線性關系，相關系數R2>0.99;從1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和10.0 μg/kg（腎上腺素為50 μg/kg、100 μg/kg和500 μg/kg）3個添加濃度的檢測結果中可以看出，17種化合物的回收率為67%～110%。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC/MS-MS）;β-受體激動劑;動物源性食品;飼料

Determination of the β-agonist Residues by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

HE Chong， WANG Bin， JIA Yisen， ZHANG Lijuan

（Shanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Xi'an 710048，China）

Abstract：The method for the simulataneous determination of seventeen β-agonists residues in animal derived foods、feed and urine samples was developed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC/MS-MS）.The sample was extracted in 2% formic acid/water-acetonitrile-methanol solution .The extraction was applied to a solid phase extraction cartridge for cleanup， determined by MRM， quantified by internal and external standard method.The calibration curves were goog liner between the peak arears and the concentrations of 1.0～10.0 μg/kg（The adrenaline 50～500 μg/kg） with the correlation coefficient R2>0.99.The average recoveries from spiked animal issues at three concentrations of 1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg （The adrenaline 50 μg/kg、100 μg/kg、500 μg/kg） ranged 67%～110%.

Keywords：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC/MS-MS）; β-agonists; animal derived food; feed

β-受體激動劑類的使用可影響營養(yǎng)物質在動物體內的流向，從而有效地促進肌肉組織生長，降低體內脂肪含量，提高動物瘦肉率[1]。競技運動員食用可以增加肌肉/脂肪比并提高肌肉力量，同時還對呼吸系統(tǒng)和神經系統(tǒng)有興奮作用[2]。

目前，關于β-受體激動劑類的檢測有HPLC法，GC/MS法、LC/MS法以及免疫法和毛細管電泳法等。液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS法）在20世紀80年代后迅速發(fā)展并逐漸成熟，在藥物分析、法醫(yī)學、商檢、環(huán)境科學、生命科學等領域都得到了廣泛的應用[3]?，F在，幾乎所有類的β-受體激動劑都可以用LC-MS/MS法來檢測，但大部分檢測方法的前處理十分復雜，步驟煩瑣，目標物回收率過低。同時不同基質（如食品、飼料、尿液等）[4-6]無法同時處理，時間、試劑和耗材的消耗量過大使現有方法難以實現大批量樣品的快速檢測[7]。本文所研究的方法在滿足檢出限和回收率要求的前提下，簡化了樣品前處理的步驟，并且該方法同時適用于食品、飼料和尿液的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液質聯用儀，Thermo Fisher TSQ&Endura;電子天平，賽多利斯科學（北京）公司BSA224S;渦旋混勻器，Scientific Industries Vortex Genie 2T;冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司H2100R;全自動SPE，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司EXTRA;氮吹儀，得泰儀器科技有限公司FV64。

1.2 試劑和耗材

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;所用水為超純水;Captiva EMR-Lipid凈化包（安捷倫）;Captiva RC針式過濾膜（安捷倫）;17種β-受體激動劑標準物質及9種同位素內標信息詳見表4。

1.3 標準曲線的配制

用甲醇分別將標準物質及同位素內標配制成濃度為10 μg/mL的儲備液（-18 ℃避光保存）。再分別精確吸取適量的儲備液配制成濃度為100 ng/mL的混合標準溶液和混合內標溶液（腎上腺素除外）。加入適量混合標準溶液和混合同位素內標溶液，用水稀釋成標準工作溶液?，F配現用。

1.4 樣品前處理

準確稱取2 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL具塞離心管中，加入混合同位素內標液，渦旋混勻。加入2 mL的2%甲酸水溶液和陶瓷均質子高速勻漿2 min，再加入8 mL甲醇︰乙腈（6︰4）渦旋振蕩5 min，4 ℃低溫9 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液，加入到Captiva EMR-Lipid重力自流并收集（上樣后可以適當增加壓力，保證流速在1滴/s左右，速度不要過快），待液體流干后加入2 mL的2%甲酸水︰乙腈（2︰8）洗脫，抽干，收集所有洗脫液。40 ℃氮吹至干，準確加入1 mL水超聲復溶，過Captiva RC針式過濾膜，上機待分析。

1.5 液相色譜-串聯質譜檢測

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）或性能相當者;流動相：A為含0.1%甲酸水溶液，B為甲醇。流速：300 μL/min;柱溫：40 ℃;進樣量：5 μL，梯度洗脫程序見表 1。

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）;檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）;噴霧電壓：3.5 kv（ESI+）;離子傳輸管溫度：350 ℃;霧化器溫度：300 ℃;鞘氣壓力：30 Arb;輔助器壓力：10 Arb;掃氣壓力：0 Arb。

1.6 定性與定量

在相同試驗條件下測定試樣和濃度相近的標準工作溶液，記錄試樣和標準工作溶液中的色譜保留時間，以相對于最強離子豐度的百分比作為定性離子的相對離子豐度。若試樣中檢出與標準溶液中興奮劑保留時間一致的色譜峰，且其定性離子與濃度相當的標準溶液中相應的定性離子的相對豐度相比，偏差不超過表2規(guī)定的范圍，可以確定試樣中檢出相應的目標物。

根據試樣中目標物的含量情況，選取濃度相近的混合標準工作液進行液相色譜-質譜/質譜分析?；旌蠘藴使ぷ饕汉痛郎y液中目標物的響應值均在儀器線性響應范圍內。以色譜峰面積按內標法和外標法分別定量。

2 結果與分析

2.1 17種β-受體激動劑及內標總離子流圖譜

圖1為17種β-受體激動劑以及其相對應的內標的標準溶液總離子流圖譜，從圖中可以看出目標物在該色譜條件下分離度較好、質譜響應值完全滿足信噪比要求，液相和質譜條件均能滿足后續(xù)實驗要求。

2.2 線性關系

17 種 β- 受體激動劑標準曲線見表3。

2.3 準確度和精密度

分別在樣品中添加17種興奮劑檢出限、定量限和10倍檢出限濃度的目標物進行樣品的回收率實驗，結果見表4。實驗結果表明本方法在1～10 ?g/kg（腎上腺素50～500 ?g/kg）添加濃度范圍內，回收率為67%～110%。在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%。

3 結論

與目前國內通用方法相比，本研究在滿足國家標準對檢出限、穩(wěn)定性和精密度要求的前提下極大地簡化了實驗步驟，縮短了樣品前處理的時間。同時本實驗對動物源性食品、飼料和尿液等不同基質中17種β-受體激動劑殘留量都進行了檢測研究，結果表明該方法還具有廣泛的應用性。解決了現有方法中不同基質需要采用不同前處理方法的問題。

參考文獻

[1]COURTHEYN D，IE-BIZEC B，BRAMBILLA G，et al.Recent developments in the use and abuse of growth promoters[J].Analytical Chimica Acta，2002（1）：71-82.

[2]閆翠花.08奧運會禁用的興奮劑分類及作用[J].中國藥物濫用防治雜志，2010，16（1）：25-27.

[3]朱堅.氣相色譜-質譜法測定肝、腎和肉中11中β-受體激動劑殘留量[J].質譜學報，2005，26（3）：12937.

[4]秦旸，徐友宣，楊樹民，等.液相色譜-質譜聯用在興奮劑檢測中的應用及進展[J].色譜，2008（4）：431-436.

[5]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法：GB/T 22286—2008，北京：中國標準出版社，2008.

[6]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺和鹽酸克侖特羅的測定 液相色譜質譜聯用法：GB/T 22147—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.